重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析

目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。

GST-hS100A9融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的制备GST-hS100A9融合蛋白。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增获取hS100A9基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-hS100A9;后者转化BL21菌后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达融合蛋白GST-hS100A9,经谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(GS4BB)分离纯化、SDS-PAGE及Western blot鉴定,BCA法蛋白定量,CCK-8测定GST-hS100A9对乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用。结果经酶切、测序分析证实pGST-hS100A9质粒构建正确;重组菌株经IPTG诱导后,表达相对分子质量约36 000的蛋白;纯化后纯度达94%;该蛋白可被S100A9的抗体特异识别;该蛋白产量约为20 mg/L菌液;且其抑制MCF-7的增殖。结论成功构建GST-hS100A9融合蛋白的原核表达质粒pGST-hS100A9;该质粒可在BL21中诱导表达GST-hS100A9,产率高,且对MCF-7增殖有抑制作用。

小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定

目的构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTAAgarose纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17-IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体。结果成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-Sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体。结论Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础。

融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响

目的探讨抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响。方法采用健康人富含血小板血浆以凝胶过滤法分离得到人血小板。流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5或小鼠抗人CD42b(glycoprotein Ibα,GPIbα)单克隆抗体(HIP1)与血小板的结合情况;以人血小板表面P-选择素的表达及PAC-1的结合反映血小板的激活程度;以全血电阻法定量分析TAP-SSL5对人血小板聚集功能的影响;为评价TAP-SSL5的出血风险,进一步观察了TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响。结果融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合,并竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合,进而抑制GPIbα与vWF的相互作用。但高浓度的TAP-SSL5(终浓度30 mg/L)也能激活血小板,使人血小板表面P-选择素的表达增加(表达阳性率为90.4%)和PAC-1的结合量上升(阳性率为66.3%);终浓度为10、30 mg/L的TAP-SSL5可引起血小板的显著聚集。给小鼠单次尾静脉注射10 mg/kg的TAP-SSL5,可显著延长尾部出血时间,由对照组的(647.1±33.7)s延长至(753.6±127.3)s(P<0.01);而常规剂量组(3 mg/kg TAP-SSL5)尾部出血时间为(612.8±79.1)s,与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结论融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能,有助于进一步提高TAP-SSL5的抗血栓作用,但同时也导致融合蛋白TAP-SSL5在高浓度情况下可延长出血时间和激活血小板。

抗炎、抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5表达载体的构建及其功能研究

目的构建一种具有抗炎和抗凝双效功能的融合蛋白,并对其功能进行初步鉴定。方法将重组金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5(staphylococcal superantigen-like protein-5,SSL5)与蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide,TAP)融合,从金黄色葡萄球NCTC8325菌株中克隆SSL5基因;经DNA重组技术,将编码pelB前导序列、SSL5和TAP的基因重组并克隆于原核表达载体pHOG21中,再转染于大肠杆菌BL21中扩增表达,制备融合蛋白SSL5-TAP或TAP-SSL5,采用流式细胞仪检测融合蛋白是否和SSL5一样,具有与粒细胞表面P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)结合的特性;采用反应底物法在体外检测融合蛋白对活化的凝血因子X(factor Xa,FXa)活性的抑制作用。结果TAP-SSL5保留了SSL5与PSGL-1结合的特性,并且融合蛋白TAP-SSL5可显著抑制FXa的活性(P<0.01),抑制率达39.5%。结论融合蛋白TAP-SSL5是一种以PSGL-1为靶向的新型抗炎、抗凝双效分子。

hTNFA-hPgnK5融合蛋白的原核表达及测定

目的 获得 h TNFα- h Pgn K5融合蛋白基因 ,在原核细胞中表达融合蛋白 ,探索其活性 .方法 PCR法改造h TNFα基因 ,消除其终止密码子 ,构建 h TNFα- h Pgn K5融合蛋白基因 .在大肠杆菌 DH5α中表达该融合蛋白 ,测定其体外抑制肿瘤细胞或血管内皮细胞增殖的活性 .结果 h TNFα基因经 PCR法改造 ,去除了终止密码子 ,并在 3 端引入 Bam HI位点 .h TNFα- h Pgn K5融合蛋白基因构建完成 ,并在原核系统中获得表达 ,免疫印迹反应表明该融合蛋白具有 h Pgn K5免疫活性 .体外实验表明该融合蛋白可抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的增殖 .结论 h Pgn K5蛋白可与 h TNFα一起表达 。

^125I标记融合蛋白TAP-SSL5在健康大耳兔体内的药代动力学研究

目的研究125I标记的抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5单次静脉注射后在健康日本大耳兔体内的药代动力学过程。方法采用固相氧化法(Iodogen法)将Na125I直接标记于TAP-SSL5,由耳缘静脉给每只大耳兔注射18.5×103kBq的125I-TAP-SSL5,分别于注射后1.5、3、5、10、30、60、120、240、480 min采血,称量并测定放射性计数(Counts per minute,cpm),换算为血液放射性浓度,经DAS软件分析得出最佳房室模型及相关药代动力学参数。结果纸层析法测得125I-TAP-SSL5的标记率为(67.32±9.91)%,放射化学纯度为(91.62±3.22)%,比活度为(30.2±4.4)TBq/μmol;TAP-SSL5在大耳兔体内的药代动力学过程符合权重为1的二室模型,分布相半衰期(t1/2α)及消除相半衰期(t1/2β)分别为(0.08±0.04)h和(4.97±0.75)h,清除率(Clearance,CL)为(0.015±0.011)ml/h,一室向二室转运常数(K12)为(6.651±3.642)/h,二室向一室转运常数(K21)为(4.072±1.737)/h。结论125I-TAP-SSL5在健康大耳兔体内的药代动力学过程符合权重系数为1的二室模型,自体清除率缓慢,可保证与组织有更多的结合几率。

Trx-NAP 5融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性检测

目的:用大肠杆菌表达获得重组线虫抗凝血肽5(rNAP 5),为研究开发NAP5的功能与应用提供原料来源。方法:将扩增的NAP5基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与表达载体pET-32a连接。构建好的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,分别经IPTG和乳糖诱导表达,并探讨诱导表达条件,分析表达产物的可溶性情况。表达产物经镍亲和纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝活性。结果:成功构建了pET-32a/NAP5表达载体,IPTG和乳糖均能诱导目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地可溶性表达。优化条件下每升LB培养基可获可溶性目的融合蛋白量达65.3mg。纯化的蛋白能明显延长PT及aPTT,7.0mg/L的蛋白平均约延长5.09倍aPTT,2.55倍PT。结论:在大肠杆菌中成功表达了具有很好生物活性的Trx-NAP5融合蛋白,为研究开发NAP5的功能与应用奠定了基础。

融合蛋白TAP-SSL5对血小板微粒与THP-1细胞结合及Mac-1活化的影响

目的探讨融合蛋白TAP-SSL5对血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)与人单核细胞株THP-1细胞结合及Mac-1活化的影响。方法以二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)激活人血小板并获取PMPs。采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)及PE标记的抗CD62P单克隆抗体、FITC标记的Annexin V检测PMPs,以FITC标记的抗CD41单克隆抗体和PE标记的抗CD154(CD40L)单克隆抗体检测PMPs的表面特征。采用JC-1试剂盒检测血小板线粒体膜电位。采用FCM检测PMPs与THP-1细胞的结合,以及PMPs诱导THP-1细胞表面Mac-1(CD11b/CD18,αMβ2)的活化情况,并研究TAP-SSL5的干预作用。结果 PMPs呈现CD62P和Annexin V双阳性,且CD41和CD40L的阳性率分别达到50.8%和44.0%。JC-1检测显示,ADP对血小板线粒体膜电位无明显影响(P>0.05)。PMPs与THP-1细胞的结合率为(24.80±5.16)%,PMPs诱导THP-1细胞Mac-1的活化率为(21.17±5.92)%,THP-1细胞经10 mg/L TAP-SSL5预处理后,PMPs的结合率下降至(13.67±2.15)%(P<0.05),Mac-1的活化率下降至(0.99±0.62)%(P<0.01)。结论 TAPSSL5可抑制PMPs与THP-1细胞的结合及THP-1细胞表面Mac-1的活化。

融合蛋白TAP-SSL5对血小板与粒细胞结合的影响

目的探讨融合蛋白TAP-SSL5对血小板与粒细胞结合作用的影响。方法采用CCK-8试剂盒检测TAP-SSL5对细胞活力的影响;流式细胞仪检测THP-1细胞表面CD162(PSGL-1)的表达,及TAP-SSL5对小鼠抗人CD162单抗KPL-1与THP-1细胞结合的抑制作用。以20μmol/L ADP激活人血小板,采用流式细胞仪、瑞氏-姬姆萨染色检测血小板与THP-1细胞或人中性粒细胞的结合情况,并研究TAP-SSL5的干预作用。结果 TAP-SSL5浓度在30 mg/L或以下时对THP-1细胞或中性粒细胞的活力无明显影响。流式细胞仪检测显示,TAP-SSL5(终浓度10 mg/L)能显著抑制KPL-1与THP-1细胞的结合;20μmol/L ADP激活的血小板与THP-1细胞或中性粒细胞的结合率分别为(31.3±8.4)%和(35.6±5.9)%;细胞经10 mg/L TAP-SSL5预先处理后,其结合率分别降至(13.4±6.7)%和(10.4±6.4)%(P<0.01)。瑞氏-姬姆萨染色的结果表明,TAP-SSL5和SSL5均可抑制激活的血小板与中性粒细胞的结合(P<0.05)。结论 TAP-SSL5可通过与PSGL-1的结合,而直接抑制激活的血小板与粒细胞的结合。

融合蛋白TAP-SSL5对激活的血小板与人淋巴细胞结合的影响

目的:研究抗炎、抗凝双效融合蛋白蜱抗凝血肽(TAP)-金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白5(SSL5)对激活的血小板与人淋巴细胞结合作用的影响。方法:采用免疫磁珠分选法筛选人外周血总淋巴细胞;CCK-8法检测TAP-SSL5对细胞活力的影响;流式细胞术检测Jurkat细胞(人外周血白血病T细胞株)表面CD162(PSGL-1)的表达及TAP-SSL5对小鼠抗人CD162单抗(KPL-1)与Jurkat细胞结合的抑制作用。以20μmol/L ADP激活人血小板,流式细胞术检测血小板与Jurkat细胞或人淋巴细胞的结合情况,并研究TAP-SSL5的干预作用。结果:30mg/L及以下浓度的TAP-SSL5对Jurkat细胞的活力无明显影响。流式细胞术检测显示,10 mg/L的TAP-SSL5能显著抑制KPL-1与Jurkat细胞的结合;20μmol/L ADP激活的血小板与Jurkat细胞或淋巴细胞的结合率分别为(11.86±4.49)%和(8.32±1.00)%;细胞经10 mg/L TAP-SSL5预先处理后,结合率分别降至(6.73±2.71)%和(5.51±0.70)%,差异有统计学意义。结论:TAP-SSL5可与淋巴细胞表面的PSGL-1结合,从而抑制激活的血小板与人淋巴细胞的结合,这可能是抗炎、抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5发挥其抗炎作用的机制之一。

重组人神经肽Y受体Y5融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的在大肠杆菌中表达人神经肽YY5受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y5转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni2+-NTA亲和层析纯化。然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y5受体蛋白。结果经IPTG诱导含有pET28a-Y5重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y5融合蛋白。重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白。经相关在线软件分析后获得了Y5受体的相关生物学特性。结论重组质粒pET28a-Y5在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y5受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础。

Dok4和Dok5 PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的 :制备Dok4和Dok5PTB结构域的GST融合蛋白。方法 :用PCR方法分别扩增编码Dok4、Dok5PTB结构域的cDNA ,并将其克隆入表达载体pGEX 4T 3中 ,转化大肠杆菌BL 2 1,构建成表达GST PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后 ,经Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化 ,用SDS PAGE进行分析 ,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的 2 5 %。结果 :获得重组的GST 4PTB和GST 5PTB融合蛋白 ,纯度在 95 %以上 ,产物得率约 75 %。结论 :成功制备高纯度Dok4和Dok5PTB结构域的GST融合蛋白 ,为进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域 (PTB)

重组人Tum-5融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建人肿瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum5的融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:人工合成Tum5基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pQE30中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行TricineSDSPAGE电泳分析和WesternBlot检测分析.结果构建了重组融合表达质粒pQE30Tum5,表达的蛋白经TricineSDSPAGE电泳分析,在约Mr10×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的40%,纯化后的蛋白灰度扫描检测,纯度为95%.结论:成功地构建了人Tum5基因的原核表达载体,并纯化了该基因的原核表达产物.

融合蛋白TAP-SSL5抑制动静脉血栓形成

目的:探讨重组抗炎、抗凝双效融合蛋白蜱抗凝血肽(TAP)-金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5(SSL5)对动静脉血栓形成的影响和机制。方法:采用基因重组技术构建TAP-SSL5基因,进而制备融合蛋白TAPSSL5,通过流式细胞检测技术研究重组蛋白TAP-SSL5与粒细胞表面P-选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)结合的特性;采用反应底物法在体外检测融合蛋白TAP-SSL5对活化的凝血因子Xa(factor Xa,FXa)活性的抑制作用。采用Fe Cl3诱导的SD大鼠下腔静脉血栓模型,研究TAP-SSL5对静脉血栓形成的影响;采用Fe Cl3诱导的C57BL/6J小鼠肠系膜动脉血栓模型,在双光子显微镜下连续检测TAP-SSL5对动脉血栓形成的影响。结果:TAP-SSL5可与粒细胞表面PSGL-1结合,并抑制粒细胞与P-selectin和血小板的结合。TAP-SSL5呈剂量依赖性地抑制FXa活性(P <0. 01)。体内实验中TAP-SSL5可明显抑制Fe Cl3诱导的SD大鼠下腔静脉及C57BL/6J小鼠肠系膜动脉血栓的形成。结论:融合蛋白TAP-SSL5具有抗炎和抗凝双重效果,可以明显抑制动静脉血栓的形成。

SOE-PCR法检测PRRSV ORF5缺失跨膜区的融合蛋白基因片段的研究

PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，含有8个开放阅读框（open reading frames，ORFs），其中ORF5—7分别编码PRRSV主要的结构蛋白：糖基化囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。糖基化囊膜蛋白（E）又称GP5蛋白，具有良好的抗原性和免疫原性，分子质量约为25ku。重叠延伸PCR技术简称SOE—PCR，又称重叠区扩增基因拼接法、交错延伸剪接PCR技术或套叠PCR技术。此技术利用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，而且不需要内切酶消化和连接酶处理。研究在分析了GP5蛋白跨膜区之后，采用SOE—PCR的方法将跨膜区基因缺失，对GP5蛋白编码跨膜区外的基因片段进行了克隆，旨在为获得高表达、高活性的基因产物打下基础。

抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对大鼠长期毒性研究

目的研究抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对大鼠的长期毒性,评价其用药安全性。方法 SD大鼠隔天腹腔注射给药TAP-SSL5 1 mg/kg一次,连续给药8周,恢复1周,检测大鼠一般行为状态、体质量变化、血液常规及血液生化、脏器系数等指标。结果各组大鼠一般行为状态正常、体征正常、体质量无明显异常;血液常规和生化指标未见异常变化;各组动物器官组织病理检查未见明显异常;各组间脏器重量及脏器系数未见明显差异。结论融合蛋白TAP-SSL5对大鼠长期毒性小,提示其用药安全性较高。

新型Resilin-R5融合蛋白的大肠杆菌表达和纯化

为了获得兼具"高弹性"和"硅沉积"性能的新型功能生物材料,将具有高弹性的Resilin蛋白与具有硅沉积作用的R5肽进行了融合,研究其在大肠杆菌中的表达,建立了简易的纯化方法。首先,将果蝇弹性蛋白基因CG15920序列与硅藻R5肽基因序列进行拼接,经过稀有密码子优化后合成重组基因resilin-r5。然后将其插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS获得表达菌株,并通过IPTG进行诱导表达。最后以盐析加热法和Ni离子柱亲和层析法纯化带组氨酸标签的重组融合蛋白。最终实现Resilin-R5融合蛋白的高效表达,产量达到120 mg·L-1发酵液,为"高弹性-硅沉积"融合蛋白Resilin-R5的性能表征和创新应用奠定了基础。

Histatin5可溶性突变体融合蛋白在大肠杆菌中的优化表达

目的优化表达条件,提高Histatin5突变体融合蛋白(GST-HST5)表达量。方法比较不同IPTG诱导浓度、不同诱导后培养时间,确定优化表达条件。结果 histatin5突变体融合蛋白经1mmol/L IPTG,37℃诱导6h,表达量最高。结论诱导表达条件对Histatin5突变体融合蛋白表达有较大影响。

Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的表达纯化及初步鉴定

目的:构建Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,纯化得到具有生物学活性的目的蛋白。方法:首先从合成的pUC57-CBLB502质粒中扩增出CBLB502基因片段,酶切后克隆至pUC57-Fc质粒中,然后双酶切pc DNA3.1和pUC57-CBLB502-Fc,将CBLB502-Fc基因片段克隆至载体pc DNA3.1,挑选阳性克隆并测序,再将重组质粒转染CHO细胞,筛选高表达细胞系,用免疫印迹鉴定表达情况,Protein A亲和柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,用小鼠辐射试验初步验证目的蛋白的生物学活性。结果:构建了pc DNA3.1-CBLB502-Fc真核表达载体;转染CHO细胞,筛选得到CBLB502-Fc高表达细胞系,并经免疫印迹鉴定培养上清;纯化得到较高纯度的融合蛋白并经SDS-PAGE鉴定;小鼠辐射实验表明CBLB502-Fc具有抗辐射作用。结论:真核表达并纯化了具有抗辐射作用CBLB502-Fc融合蛋白,为后续研究CBLB502-Fc的生物学功能奠定了重要基础。