旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p4 6kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。 方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以 2 0 μg/只的剂量分 3次免疫小鼠后 ,攻击感染旋毛虫肌幼虫 2 0 0条 /只 ,检查旋毛虫 7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染 35d的肌幼虫数并计算减虫率 ,同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果 WN10免疫小鼠后获得旋毛虫 7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为 6 4 .2 8%和 6 1.2 1% ,均与感染对照组和佐剂对照组差异显著 ;获得雌虫产新生幼虫的减虫率为 16 .4 6 % ,与感染对照组和佐剂对照组差异不显著 ;WN10免疫组小鼠在第 3次免疫后 1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG ,在攻击感染旋毛虫 9周后仍维持在较高水平。 结论 编码旋毛虫新生幼虫 p4

猪肺炎支原体P46-P65重组蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)血清学调查及免疫评估方法,本研究利用DNAStar生物学软件对Mhp的P46和P65进行抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得P46-P65融合基因,构建重组表达质粒pETP46-P65,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的重组P46(aa33~aa419)-P65(aa307~aa627)蛋白(rP46-P65)。以纯化的r P46-P65为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的方法与CSFV、FMDV、PEDV、PCV2、PRV、PRRSV和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法可检测到最高稀释至6 400倍的Mhp阳性血清,批内和批间变异系数均小于5%。利用IDEXX试剂盒和本研究建立的方法同时检测298份临床血清样品,前者的检测阳性率为62.4%(186/298),后者的检测阳性率为73.8%(220/298),两者检测结果的总符合率为88.6%。IDEXX检测为阳性的血清,采用本研究建立的ELISA方法检测也均为阳性;而部分Mhp阳性猪经IDEXX试剂盒检测为阴性的血清,该ELISA方法检测结果却为阳性,其中79.4%(27/34)检测结果有差异的血清经Mhp颜色变化试验证明均为阳性,表明本研究建立的ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX方法。本研究建立的检测猪Mhp抗体的间接ELISA方法与目前广泛使用的方法相比优势明显,为临床血清流行病学调查及血清抗体水平评估提供了可行方法。

猪肺炎支原体168弱毒株P46-P65融合蛋白的免疫原性

根据猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株p46和p65基因序列设计特异性引物,进行PCR扩增并构建表达载体pET-28a-p46,pET-28a-p65以及pET-28a-p46-p65。以表达载体pET-28a-p46和pET-28a-p46-p65为模板,将其中p46基因3个TGA密码子突变为TGG。原核表达并纯化的蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫小鼠,通过酶联免疫吸附反应(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价。分别选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验。经间接ELISA试验证明单蛋白P46、P65以及融合蛋白P46-P65的血清效价分别为:1∶1 280000,1∶128 000和1∶2 560 000;攻毒试验证明,P46、P65单蛋白和P46-P65融合蛋白疫苗的保护率分别可达82%,78%和98%。融合蛋白P46-P65具有良好的免疫原性,并且要优于单蛋白P46和P65的免疫原性。

猪肺炎支原体168弱毒菌株P65-DnaKc融合蛋白的表达及免疫原性

研究猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株融合蛋白P65-DnaKc免疫原性。根据GenBank中Mhp168弱毒株p65和dnaKc基因的开放阅读框设计特异性引物,进行PCR扩增,构建原核表达载体pET-28α-P65,pET-28α-DnaKc以及pET-28α-P65-DnaKc,经原核表达并纯化获得的蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫小鼠,通过酶联免疫吸附反应(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价。选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验,记录分析试验结果。经间接ELISA试验证明单蛋白P65、DnaKc以及融合蛋白P65-DnaKc均具有良好的免疫原性,血清效价分别为:1∶12 800、1∶51 200和1∶204 800,融合蛋白的血清抗体效价明显高于单蛋白;攻毒试验证明,P65-DnaKc重组蛋白疫苗的保护率可达90%。融合蛋白P65-DnaKc具有良好的优于P65和DnaKc单蛋白的免疫原性。

NF-κB信号通路与肝纤维化的研究进展

核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是一类广泛存在的、调控着多种基因转录的重要转录调节因子。NF-κB是细胞中重要的转录调节因子,通常以p50-p65异二聚体的形式与其抑制性蛋白结合而呈非活化状态。NF-κB的不适当表达和激活与各种疾病的发生密切相关。因此,以NF-κB为治疗靶点的药物研究可能为预防和治疗这些疾病提供新思路。本文就NF-κB信号通路与肝纤维化发生、发展及其与肝星形细胞之间关系的研究进展做一综述。

一种带有组氨酸标签的抗糖尿病疫苗的构建、表达、纯化及鉴定

利用组氨酸标签系统提高抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的产量,简化纯化工艺。通过PCR方法,在融合蛋白HSP65-6P277的N端添加6个组氨酸标签后,定向克隆到pET28a原核表达载体中成功构建了组氨酸标签融合表达载体pET28a-HIS-HSP65-6P277。通过乳糖诱导,融合蛋白HIS-HSP65-6P277在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中以可溶形式表达,镍柱亲和层析纯化后,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明表达产物是约70 k具有6个组氨酸标签肽的融合蛋白;分离纯化融合蛋白的时间从原来的15～20 d缩短为2～3 d,产量提高到56 mg/L。组氨酸标签系统可以较好的简化抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的纯化工艺,提高产量。