2a型丙型肝炎病毒非结构基因5区(NS5)全长克隆的构建

目的 构建 2a型丙型肝炎病毒 (HCV)非结构基因 (NS) 5区全长克隆质粒。方法 用聚合酶链反应 (PCR)从HCVNS5A和NS5B质粒中扩增出NS5A和NS5BPCR片段 ,再采用融合PCR技术扩增出全长NS5的cDNA片段 ,克隆后RFLP和序列分析鉴定重组子。结果 融合PCR获得约 2 8kb全长NS5序列 ,同源性分析表明 :与HC J6的核苷酸同源性为 91 2 % ,推导的氨基酸同源性为 95 5 %。结论 利用融合PCR技术简单方便 ,利用该技术获得了 2a型HCVNS5全长序列 。

钝齿棒杆菌乳酸脱氢酶基因敲除菌株的构建

目的钝齿棒杆菌厌氧发酵时,其主要代谢产物为琥珀酸和乳酸。敲除乳酸脱氢酶基因(LdhA)可以减少乳酸的生成,提高钝齿棒杆菌产琥珀酸代谢途径的通量。方法为获得乳酸脱氢酶基因缺失的钝齿棒杆菌突变株,先通过PCR扩增获得LdhA基因的上、下游同源重组臂及卡那霉素抗性基因(Kn),然后通过融合PCR技术将LdhA基因上、下游同源重组臂与Kn抗性基因连接构建打靶片断与打靶质粒。结果先后成功构建了打靶片段ΔLdhA::Kn、打靶质质粒pCVD442-ΔLdhA::Kn与供体菌株E.coliβ2155/pCVD442-ΔLdhA::Kn,并成功筛选到具有卡那霉素抗性的钝齿棒杆菌单克隆菌株。结论PCR鉴定与乳酸脱氢酶活力分析结果表明,钝齿棒杆菌基因组中LdhA基因被Kn抗性基因替换,LdhA基因敲除成功,为后续利用钝齿棒杆菌高产琥珀酸奠定了基础。