高分辨率融解曲线技术检测冠心病患者IL-1β和IL-1Ra基因多态性

目的为探讨白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素1受体拮抗剂（IL-IRa）基因单核苷酸多态性（SNP）与冠心病（CHD）易感及其血清学指标的相关性，应用高分辨率融解曲线分析（HRM）技术建立IL-1β和IL-1Ra基因SNP的分子诊断方法。方法建立IL-1B-511C〉T、IL-1β-31C〉T、IL-1β＋3954C〉T和IL-1RNT〉C这4个SNP位点的PCR-HRM检测方法，对260例CHD患者和274例健康对照进行比较研究，分析其与CHD易感及血清学指标的关系。结果上述4个SNP位点未发现与CHD易感有统计学差异，性别分层后发现男性IL-1β．31C〉T位点和女性IL-1β＋3954C〉T位点的等位基因频率，在病例组和对照组间存在差异；单倍型分析发现IL-1β-511T／IL-1β-31C／IL-1β＋3954C／IL-1RNT（TCCT）单倍型增加CHD发病风险（OR=1．217，95％CI：0．950—1．559，P=0．123），CTCC和玳T单倍型降低cHD发病风险（OR=0．612，95％CI：0．376～0．994，P=0．046；OR=0．365，95％CI：0．154～0．862，P=0．017）；病例组血清学指标的相关性分析未发现其与SNP位点之间有关联性。结论应用HRM技术建立的4个SNP位点PCR—HRM检测方法经测序验证和临床标本检测均能正确基因分型，实现了快速基因分型的均相检测。IL-1β-31C〉T、IL-1β＋3954C〉T位点和单倍型CTCC和TTCT与中国兰州地区汉族人群CHD易感性有关。

SYBR-GreenⅠ实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析技术在α-珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断中的应用

目的探讨SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR(SYBR-PCR)结合融解曲线分析(D.C)技术进行α-珠蛋白生成障碍性贫血(α-地贫)基因诊断的价值。方法对22个家系中的37份样品采用4管SYBR-PCR结合D.C进行--SEA、-α3.7,-α4.2及非缺失型(αα)4个等位基因型的检测,进而作出基因诊断。同时运用单管多重PCR(mPCR)结合凝胶电泳技术进行基因检测加以对照确认。结果22个家系中6个家系检出有--SEA或-α3.7携带者,其中东南亚型缺失携带者(--SEA/αα)7例,右侧缺失携带者(-α3.7/αα)3例,东南亚型缺失与右侧缺失双重杂合子(--SEA/-α3.7)1例。2例为胎儿产前诊断。其中1例为Bart′s水肿胎儿(--SEA/--SEA),另1例为东南亚型缺失携带者(--SEA/αα)。用mPCR凝胶电泳技术得出的基因诊断结果与上述结果一致。结论SYBR-PCR结合D.C技术在α-地贫的基因诊断、携带者检出及产前诊断方面具有实用价值。

Rotor-Gene链融解曲线法甲基化标记筛选技术的建立

目的:建立基于Rotor-Gene的链融解曲线法的甲基化标记筛选技术,分析各种影响因素,评估其实用性。方法:克隆Hela细胞雄激素受体基因外显子-1的Bisulfite-PCR产物,挑出经测序证实的可以代表不同甲基化程度的一组质粒,并以之为模板,在Rotor-Gene3000实时定量PCR仪进行扩增和链融解,分析融链温度、链融解曲线与甲基化程度、甲基化模式的相关性及各种影响因素。结果:基于Rotor-Gene的链融解曲线法,不仅可以区分甲基化与非甲基化,而且能够鉴别片段内细微的甲基化差异;主要的影响因素有升温幅度、缓冲液离子强度、产物浓度等。结论:基于Rotor-Gene的链融解曲线法,可以集扩增和链融解于一体,是一种经济简便的甲基化分析技术,可用于样品的甲基化筛选。

实时荧光PCR结合融解曲线分析快速鉴定临床常见曲霉菌

目的采用实时荧光PCR结合融解曲线分析的方法快速将临床常见曲霉菌鉴定到种的水平。方法①普通PCR扩增真菌ITS区后进行序列比对,准确鉴定菌种并设计种特异性引物和探针。②采用实时荧光PCR的方法及融解曲线分析,根据不同的解链温度将5种临床常见曲霉菌鉴定到种的水平。③特异性、敏感性、重复性试验。结果①解链曲线分析显示,不同种曲霉菌的种特异性探针有特异的Tm值,根据Tm值的不同可以将5种曲霉菌区分开来:烟曲霉Tm=61.4℃,黄曲霉Tm=57.4℃,黑曲霉Tm=67.7℃,土曲霉Tm=55.2℃和64.5℃,构巢曲霉Tm=65.8℃。其中小孢根霉和疣状瓶霉与烟曲霉探针发生交叉反应,阴性对照不出现特异性的解链曲线。②该方法对5种曲霉菌的检测下限分别为:烟曲霉56.8 fg,黄曲霉1 110 fg,黑曲霉13.7 fg,土曲霉123 fg,构巢曲霉780 fg。③重复性试验结果显示,同一种曲霉菌的Tm值波动范围不超过0.5℃。结论采用实时荧光PCR结合融解曲线分析的方法可以快速准确地将临床常见曲霉菌鉴定到种的水平,具有良好的敏感性、特异性和可重复性,有助于临床侵袭性曲霉感染的诊断和指导抗真菌药物使用。

双链置换探针实时荧光定量PCR结合融解曲线特性分析检测高危型人乳头瘤病毒16、58亚型

目的:建立一种准确、快速、实用的检测人乳头瘤病毒(HPV)16、58亚型的方法。方法:根据HPV16和HPV58亚型的序列特异性各设计一对引物和一对型特异性双链置换探针,采用实时荧光PCR扩增后,通过非高分辨的融解曲线分析在同一荧光通道内有效区分两种HPVDNA基因亚型。结果:1ng/μl、0.1ng/μl和0.01ng/μlHPV16和HPV58模板荧光PCR扩增及融解曲线分析显示,融解曲线分析较定量扩增更灵敏、特异。HPV16和HPV58融解曲线对应的Tm值分别为83.5°C和87°C。结论:所建双链置换探针实时荧光定量PCR结合融解曲线分析检测HPV16、58亚型的方法灵敏、特异,有临床应用价值。

用SYBR-GreenⅠ实时荧光PER结合融解曲线分析法诊断α-地中海贫血

目的建立自动化、高通量、准确快速检测缺失型α-地中海贫血基因型的技术。方法应用SYBR-Greenl进行两个实时荧光聚合酶链反应（real-time fluorescence polymerase chain reaction with SYBR-Green 1，SYBR-PCR），检测左缺（-α^4.2）、右缺（-α^3.7）等位基因，同时进行融解曲线（dissociation calve，DC）和Tm（melting temperature）值分析。PCR产物重组到pCR2．1，重组子梯度稀释作为模板检测灵敏度，确定两种等位基因型（-α^4.2，-α^3.7）的检测下限，并对110份DNA样品进行检测。结果检测-α^4.2和-α^3.7的PCR产物长度分别为1．65kb、1．9kb，Tm分别为（81．5±0．5）℃、（82．5±0．5）℃，检测下限分别为9×10^2个拷贝、4．3×10^2个拷贝。该检测技术的灵敏度较常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳法高10倍。结论SYBR-Greenl实时荧光PCR结合融解曲线分析及Tm分析可以灵敏、准确地检测-α^4.2、-α^3.7、αα（包括α^Tα）及--^SEA4种等位基因，从而为各种缺失型α-地中海贫血做出基因诊断。该技术具有自动化程度高，不需荧光标记探针，成本低，易质控，防污染，高通量等优点，适于临床推广应用。

qPCR-HRM曲线分析技术与普通PCR加直接测序法检测胶质瘤EGFR突变比较

目的:比较实时聚合酶链反应-高分辨率融解(qPCR-HRM)曲线分析技术和普通PCR法加直接测序法检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,探讨适用于临床的EGFR基因突变检测方法,为胶质瘤患者术后放射、化学治疗及预后判断研究提供可靠的依据。方法:用普通PCR加测序法与qPCR-HRM曲线分析技术检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,检测结果比较采用卡方检验。结果:两种方法检测EGFR外显子19基因突变结果比较差异无统计学意义,且qPCR-HRM曲线分析技术比直接测序法更快捷、灵敏。结论:与直接测序法相比,qPCR-HRM曲线分析技术可能更适用于临床检测胶质瘤患者标本EGFR突变性质。

ARL15、HLA-DMA基因多态性与中国西北地区汉族人群类风湿性关节炎易感性相关

目的采用高分辨融解曲线(HRM)技术建立检测类ADP核糖基化因子GTP酶15(ARL15)、主要组织相容性抗原复合体ⅡDMα(HLA-DMA)和核因子κB亚基2(NFKB2)基因单核苷酸多态性(SNP)的方法,并探讨其与中国西北地区汉族人群类风湿性关节炎(RA)易感性的关系。方法针对rs255758、rs1063478、rs397514331和rs397514332四个SNP位点建立PCRHRM检测体系并测序验证。对588例RA患者和200例健康对照标本进行病例对照研究,分析这四个SNP与RA发病风险的关系。结果建立的针对四个SNP位点的PCR-HRM基因分型方法经测序验证可正确分型。rs397514331和rs397514332位点未发现突变基因型。rs255758和rs1063478位点的基因型频率在两组间存在统计学差异,而基因频率无统计学差异。其中rs255758位点的AA基因型在显性模型(AA vs AC/CC)下降低RA发病风险(OR=0.666,95%CI=0.478~0.927,P=0.016)。结论我们建立的PCR-HRM基因分型方法可对rs255758、rs1063478、rs397514331和rs397514332四个SNP位点进行常规化检测。ARL15和HLA-DMA基因多态性与中国西北地区汉族人群RA易感相关。

单管一步甲基化可变位点分析技术

目的建立单管一步甲基化可变位点(methylation variable position,MVP)分析技术——单管消化后PCR链融解曲线分析(post-digestion PCR-melting curve analysis,PDP-MCA)。方法以文献报道的差异甲基化区(differentially methylated region,DMR)为模型,在MVP两侧设计一组解链温度各不相同的引物。应用FastDigest甲基化敏感性限制酶(methylation-sensitive restriction enzyme,MSRE),在同一反应管内顺次进行DNA的酶切、复合扩增和MCA检测,生成MCA图谱。同时用该方法和传统的MSRE-PCR MCA技术检测相同样品(外周静脉血、精液、阴道液各5份),比较两种方法检测结果,验证其可行性,并分析比较不同样品的MCA/HRM图谱。结果解链温度相差2℃以上的片段,MCA峰分离良好,复合扩增后可以用MCA技术检测。应用单管PDP-MCA技术,可以集酶切、扩增和检测三步于一管,在2h内得到与传统方法一致的特异性图谱和数据,并实现样品的快速分类鉴别。结论单管PDP-MCA技术可以实现多个MVP的单管、闭管检测,具有简便、快速、易于自动化等优点,可用于样品DNA甲基化差异的检测。

乳腺癌分子分型与GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多态性的关系及意义

目的探讨乳腺癌患者谷胱甘肽转硫酶M1(GSTM1)、谷胱甘肽转硫酶T1(GSTT1)和谷胱甘肽转硫酶P1(GSTP1 rs1695)的基因多态性分布,并分析其与乳腺癌分子分型的关系。方法应用多重PCR技术(MPCR)和高分辨融解曲线技术(HRM)分析252例女性乳腺癌患者外周血中GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs 1 695)的基因多态性。结果 252例乳腺癌患者中,108例(42.9%)为GSTM1(+),144例(57.1%)为GSTM1(-);178例(70.6%)为GSTT1(+),74例(29.4%)为GSTT1(-);143例(56.7%)为GSTP1(rs1695)AA基因型,102例(40.5%)为GSTP1(rs1695)AG基因型,7例(2.8%)为GSTP1(rs1695)GG基因型。经Hardy-Weinberg遗传平衡检验,证实本研究入组病例GSTP1(rs1695)基因具有群体代表性(P>0.05);8例Cerb-B-2(2+)和(2+→3+)者未行FJSH检测予以剔除,其中Luminal型占63.1%(154/244),三阴型占22.1%(54/244),Her-2过表达型占14.8%(36/244);GSTT1(-)在不同分子分型的乳腺癌人群中的分布不同,差异有统计学意义(P<0.05),而GSTM1和GSTP1(rs1695)基因多态性在各分子分型的乳腺癌人群中的分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论 GSTT1基因多态性与乳腺癌的分子分型有关,GSTT1(-)在三阴型乳腺癌中缺失率较低,其基因多态性可为分子分型下乳腺癌的异质性提供合理补充。

胶质瘤表皮生长因子受体基因突变检测方法的对比研究

目的分析普通聚合酶链式反应(PCR)联合直接测序法与实时聚合酶链式反应-高分辨率融解(qPCR-HRM)曲线分析技术对胶质瘤表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的检测效果。方法用普通PCR联合直接测序法与qPCR-HRM曲线分析技术检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,检测结果比较采用χ2检验。结果普通PCR联合直接测序法与qPCR-HRM曲线分析技术对胶质瘤患者肿瘤组织EGFR突变的检测结果一致性较高,达90.91%,两者间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 qPCR-HRM曲线分析技术操作较普通PCR联合直接测序法简便,实验时间较短,降低了交叉污染的风险,通过HRM曲线分析检测结果可以实现对样品基因型的判定。

肺癌患者外周血AKAP12基因甲基化水平的检测及意义

目的：研究甲基化特异‐高分辨融解曲线法（MS‐HRM）检测肺癌患者外周血中A激酶锚定蛋白12（AKAP12）基因甲基化水平及其临床意义。方法采用MS‐HRM法检测60例肺癌患者外周血中AKAP12基因的甲基化水平，分析其与肺癌患者病理参数的关系。结果经MS‐HRM检测，从60例肺癌患者标本中检出34例（56．7％）AKAP12基因甲基化，其中，18例（52．9％）甲基化程度为1％～20％，14例（41．2％）为20％～60％，2例（5．88％）为60％～100％。外周血中AKAP12基因甲基化水平在不同患者年龄和性别中比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；而与肺癌的病理分期和分化程度比较，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论AKAP12启动子甲基化改变与肿瘤进展及肿瘤恶性程度相关。

革胡子鲶MHC基因表达qPCR分析的引物设计与评估

为应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析革胡子鲶主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因的表达谱,本研究利用Primer 5软件设计扩增革胡子鲶MHC基因片段的引物并进行qPCR评估。结果显示:引物MHCF1-MHCR3在qPCR扩增时,融解曲线为单一尖锐峰;标准曲线分析显示:引物的扩增效率为99.3%,R2值为0.998。上述结果说明该对引物具有良好的扩增特异性和扩增效率,满足了qPCR扩增的要求。本研究为革胡子鲶MHCⅠ基因表达的qPCR分析奠定了基础。

血鹦鹉TYR基因表达qPCR分析的引物设计与评估

为了解色素相关基因和体色之间的关系,应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析血鹦鹉的酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因的表达谱,通过Primer 5软件设计扩增血鹦鹉TYR基因片段的引物并进行qPCR评估研究。结果显示,引物TYR2F-TYR2R在q PCR扩增时,融解曲线为单一尖锐峰;标准曲线分析显示,引物的扩增效率为103.3%,R2值为0.994。上述结果说明该对引物具有良好的扩增特异性和扩增效率,满足了qPCR扩增的要求,该研究结果可为血鹦鹉TYR基因表达的qPCR分析奠定基础。

HRM技术快速检测新冠病毒变异株

建立基于高分辨率融解曲线(High resolution melting,HRM)的快速检测新冠病毒变异株的方法,为新冠变异株快速检测提供技术支撑。针对新冠病毒S基因的氨基酸突变位点G339H/D、D796Y、V83A设计HRM引物,将新冠病毒实时定量荧光PCR(RT-PCR)阳性的核酸逆转录后进行HRM分析,并对33份新冠病毒RT-PCR阳性核酸标本进行检测,与二代测序结果进行比较。建立的HRM方法能区分Delta、Omicron及XBB亚型,33份标本的HRM分析结果显示其中2份为Delta株,31份为Omicron株,12份为XBB亚型。HRM分析结果与二代测序结果一致。本实验建立的HRM方法能够准确检测出新冠病毒变异株中的Delta、Omicron及XBB亚型,可应用于快速鉴定新冠病毒型别。

连续流动微流控PCR快速检测转基因植物的实验研究

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是现代分子生物学研究中最重要的技术之一,在医药研究领域中日益成为各实验室必不可少的技术。

直接测序法和qPCR-HRM法检测NSCLC组织EGFR突变的比较研究

目的比较直接测序法和实时聚合酶链反应-高分辨率融解曲线技术(q PCR-HRM)检测非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的差异,探讨适用于临床检测EGFR基因突变的方法,为NSCLC患者的靶向治疗提供理论依据。方法共收集NSCLC患者组织标本52例,分别采用q PCR-HRM法和直接测序法进行EGFR基因突变检测,采用χ2检验对检测结果进行统计学比较。结果 52例NSCLC患者组织标本中,直接测序法检测的EGFR基因突变率为30.8%(16/52),q PCR-HRM法检测的EGFR基因突变率为32.7%(17/52),两种方法检测结果相比较,差异无统计学意义(χ2=0.04,P>0.05)。结论与直接测序法相比较,q PCR-HRM法是一种操作简便、费用低、速度快、灵敏度高的检测方法,对于临床筛选适合EGFR-TKI治疗的NSCLC患者亚群,预测EGFR-TKI疗效都具有重要意义,值得临床进一步推广应用。

qPCR-HRM法检测NSCLC患者外周血中EGFR突变

目的比较直接测序法和实时聚合酶链反应-高分辨率融解曲线技术(qPCR-HRM)检测非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的差异,探讨适用于临床的EGFR基因突变检测方法。方法 52例NSCLC患者外周血中EGFR突变采用qPCR-HRM法,其组织标本中EGFR突变采用直接测序法,采用卡方检验比较检测结果。结果 qPCR-HRM法检测外周血中EGFR突变率为34.6%(18/52),直接测序法检测的组织标本中突变率为30.8%(16/52),结果差异无统计学意义(χ2=0.17,P>0.05);2种方法的总符合率为96.2%(50/52)。结论与直接测序法相比,qPCR-HRM法检测NSCLC患者外周血中EGFR突变更适用于临床筛选适合EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗的NSCLC患者。