屋尘螨抗原Derp2基因的克隆和表达

目的 构建并克隆屋尘螨抗原 Der p2基因 ,在大肠杆菌中初步表达 .方法 根据已发表的 Der p2基因 ,人工设计合成一系列基因片段 ,经单链扩增后连接成完整的 Der p2基因 ;将该基因克隆入表达载体 p Pro EX HTb中 ,测序并进行初步表达 .结果 利用所设计的结构制备了完整的 Der p2基因 ,以大肠杆菌为宿主在 IPTG的诱导下获得初步表达 ,该外源蛋白 Mr约为 17× 10 3,占总蛋白量的 2 0 % .结论 所构建的 Der

应用螨抗原片间接荧光抗体试验(IFA)诊断肺螨病的研究

本文首次应用以粉螨类为主的混合螨种制成的螨抗原片作间接荧光抗体试验(IFA),55例患者的阳性率为90.91％,阳性滴度几何均值为121.10,15例阴性对照3例显示荧光,其中最大滴度为1:8。荧光显色的螨体轮廊清晰可辨,体表呈荧光浓染。结果提示患者体内产生了针对螨抗原的特异性IgG,螨体抗原性较强的部位在体表、螫肢和足,同时表明本文创用的螨抗原片间接免疫荧光试验具有较高的敏感性和特异性,对肺螨病的辅助诊断具有一定的实用价值。

尘螨抗原对P815肥大细胞维生素D受体和炎症介质分泌的影响及1,25(OH)_2D_3的免疫调节作用

目的探讨1,25(OH)_2D_3对尘螨抗原(Der p)直接作用的P815肥大细胞维生素D受体(VDR)表达及IL-4、IL-10分泌的影响及其免疫调节作用。方法用不同浓度Der p、1,25(OH)_2D_3单独或联合作用P815细胞,收集细胞和上清液。采用Western blot、RT-PCR法分别检测P815肥大细胞VDR蛋白及m RNA表达,ELISA法检测细胞悬液上清液中IL-4、IL-10浓度。结果 P815肥大细胞表达VDR。不同浓度Der p对P815肥大细胞VDR表达有调节作用,作用12、24h组VDR m RNA表达呈明显浓度依赖性下调(P<0.05)。不同浓度Der p作用P815肥大细胞36h后,VDR蛋白表达呈浓度依赖性下调。高浓度1,25(OH)_2D_3单独作用对VDR表达有上调作用(P<0.05)。不同浓度1,25(OH)_2D_3单独作用P815肥大细胞可促进IL-10的释放(P<0.05),但对P815肥大细胞IL-4分泌无明显影响(P>0.05)。1,25(OH)_2D_3可抑制Der p引起的IL-4分泌(P<0.05),且1,25(OH)_2D_3浓度越高,抑制作用越强。Der p、1,25(OH)_2D_3联合处理P815肥大细胞36h后,上清液中IL-10浓度无明显变化(P>0.05)。结论 1,25(OH)_2D_3可通过上调肥大细胞上VDR表达,促进IL-10分泌,从而发挥抗炎作用。1,25(OH)_2D_3对Der p引起的肥大细胞免疫反应的干预作用可能是通过抑制IL-4的合成和分泌,从而抑制Th2型免疫应答的。

尘螨抗原蛋白酶作用的研究进展

尘螨抗原除有一般抗原的共同特性外,尚具有蛋白酶水解作用。尘螨蛋白酶抗原能够裂解B细胞和巨噬细胞膜表面某些受体分子(如CD23和CD25),酶解上皮细胞间的紧密连接,诱导支气管上皮细胞释放前炎症介质。尘螨抗原的蛋白酶作用在吸入抗原致敏及特应性疾病的病理生理过程中起重要作用。

螨抗原蛋白含量的快速测定方法—紫外分光光度法

目的 建立一种快速测定螨抗原原液蛋白含量的方法 .方法 通过建立螨抗原的蛋白含量与其吸光度的线性回归方程 ,寻求建立利用紫外分光光度法快速测定螨抗原原液蛋白含量的方法 .结果 该方法可快速测定螨抗原原液蛋白含量 ,其结果与微量凯氏定氮法比较无显著差异 .结论 紫外分光光度法测定螨抗原蛋白浓度简便、实用、快捷。

粉尘螨抗原PLGA微球对致敏小鼠脱敏疗效的研究

目的:给予粉尘螨抗原致敏小鼠分别灌服粉尘螨抗原PLGA微球(直径7～10 μm)和粉尘螨(浸液)抗原脱敏或减敏治疗疗效的观察,以选择一种对尘螨性哮喘脱敏治疗的药物.方法:粉尘螨抗原致敏C57-BL/6小鼠,灌服粉尘螨抗原PLGA微球以及等剂量的粉尘螨(浸液)抗原减敏后,检测小鼠BALF和血清中的弹性蛋白酶、粉尘螨特异性IgG、粉尘螨特异性IgE,以及血清中的IL-4、IFN-γ,并对支气管肺组织进行病理学检查.结果:粉尘螨抗原致敏小鼠血清中粉尘螨特异性IgE、IL-4水平明显升高,粉尘螨特异性IgG水平和IFN-γ含量明显降低,BALF中弹性蛋白酶活性、粉尘螨特异性IgE水平升高,与正常对照组相比具有显著性差异;致敏小鼠气道中产生大量炎性渗出液.灌服粉尘螨抗原PLGA微球减敏后,血清中粉尘螨特异性IgE、IL-4水平下降,粉尘螨特异性IgG水平、IFN-γ含量明显升高,BALF中弹性蛋白酶活性、粉尘螨特异性IgE水平明显降低,与粉尘螨抗原致敏模型组相比具有显著性差异(P＜0.05);气道中渗出液明显减少,粉尘螨特异性IgG水平无明显差异;而灌服等剂量的粉尘螨(浸液)抗原后对致敏小鼠无明显疗效.结论:直径为7～10μm、10 μg/10 g体重的粉尘螨抗原PLGA微球对致敏小鼠具有减敏作用,是一种新型的治疗粉尘螨过敏性哮喘的口服脱敏缓释制剂.

屋尘螨抗原Der p2重组耻垢分枝杆菌的构建及其鉴定

目的构建并鉴定能够分泌表达外源蛋白——屋尘螨抗原(Der p2)的基因重组耻垢分枝杆菌(rM.s)。方法采用电穿技术,将鉴定好的PCW-Der p2质粒转化到耻垢分枝杆菌(M.s),通过PCR鉴定目标基因在rM.s中的表达。结果经PCR鉴定,成功将PCW-Der p2质粒转化到M.s。结论成功构建了以分泌方式表达外源蛋白的Der p2-rM.s。

重组粉尘螨抗原纳米疫苗PLGA-Der f2免疫治疗小鼠过敏性哮喘的实验研究

目的探讨粉尘螨抗原纳米疫苗PLGA-Der f2免疫治疗小鼠过敏性哮喘的疗效及机制。方法使用PLGA包裹重组粉尘螨抗原Der f2构建纳米疫苗PLGA-Der f2。将雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组(PBS组,n=32)和致敏组(n=32),致敏组再分为哮喘模型组(Asthma组,n=8)、空纳米对照组(PLGA组,n=8)、重组粉尘螨抗原Der f2免疫治疗组(Der f2组,n=8)、PLGA-Der f2纳米疫苗免疫治疗组(PLGA-Der f2组,n=8)。使用粉尘螨粗提液分别对致敏组各组BALB/c小鼠进行致敏、激发,检测各组小鼠气道高反应性;通过HE染色观察小鼠肺部炎症浸润情况;比较小鼠支气管肺泡灌洗液(BAL F)中细胞总数和嗜酸性粒细胞数量;使用酶联免疫吸附测定法测定小鼠肺组织研磨上清及脾细胞培养上清中的细胞因子IL-4、IL-13以及血清中的尘螨抗原特异性IgE抗体(sIgE)。结果与Asthma组和PLGA组相比:Der f2组和PLGA-Der f2组小鼠气道高反应性Penh值明显降低(均P<0.05),肺部炎症浸润显著减轻;BAL F中细胞总数(P<0.05)、嗜酸性粒细胞数量减少(P<0.05),血清中抗sIgE显著降低(P<0.05);肺组织研磨上清和脾细胞培养上清中IL-4、IL-13均明显降低(均P<0.05)。与粉尘螨抗原Der f2相比,PLGA-Der f2纳米疫苗治疗作用更强(均P<0.05)。结论粉尘螨抗原PLGA-Der f2纳米疫苗免疫治疗作用强于单独使用粉尘螨抗原Der f2。

PM2.5颗粒协同屋尘螨抗原Der p1在小儿哮喘发作中的机制分析

目的 :研究PM2.5颗粒协同屋尘螨抗原Der p1在小儿哮喘发作中的作用。方法 :96例哮喘发作患儿随机分为PM2.5组、屋尘螨组、协同组和对照组各24例,对比临床效果。结果 :对照组哮喘控制率显著高于PM2.5组和屋尘螨组,协同组最低;控制时间最短,其次为PM2.5组和屋尘螨组组,协同组最长(P<0.05)。干预后各组肺功能FVC、FEV1和PEF水平较前增加,且对照组明显高于PM2.5组和屋尘螨组,协同组最低(P<0.05)。治疗后对照组血清IL-25、TSLP和丙二醛含量明显降低,而其他三组明显升高(P<0.05)。结论 :PM2.5颗粒和屋尘螨抗原Der p1可通过炎症反应和氧化应激影响小儿哮喘的治疗效果。

屋尘螨抗原致敏大鼠支气管上皮细胞白介素6、白介素8和转化生长因子β1的表达

目的探讨屋尘螨抗原（Derpl）对大鼠原代支气管上皮细胞白介素6（IL-6）、IL-8和转化生长因子β1（TGF—β1）表达的影响。方法将实验随机分成正常对照组和实验组，实验组中细胞分别暴露于3个不同的Derpl浓度（1、5、10mg，／L）及3个不同的培养时间点（4、8和24h）。然后用逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）及酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测细胞及细胞上清液中IL-6、IL-8和TGF-β1的表达及含量。结果与对照组相比，实验组各指标有明显变化。Derpl刺激4h，IL-6和IL-8表达开始升高，直至8～24h呈高水平。而在Derpl浓度≥5mg／L条件下，IL-6和IL-8表达最明显，与正常对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。而TGF—β1则随着时间和浓度的增加，其表达水平呈逐渐上升趋势，各时间点的表达差异均有统计学意义（P〈O．05）。各炎症指标（IL-6，IL-8，TGF-β1）ELISA结果与PCR趋势基本一致。结论Derpl刺激气道上皮细胞，引起支气管上皮细胞免疫反应，释放一系列炎症因子如IL-6、IL-8和TGF-β1，从而参与哮喘气道炎症反应及哮喘的气道重塑。

螨抗原鼻粘膜激发试验在变应性鼻炎发病机理探讨中的应用

91例变应性鼻炎患者分别用1％地卡同，10％色甘酸二销及生理盐水（对照组）预处理，观察预处理前后螨抗原鼻激发引起的鼻分泌量的动态变化。结果：①螨抗原激发侧鼻分泌量明显多于对侧。②对螨抗原鼻激发引起的易分泌量增多1％地卡因不能有效抑制。而色甘酸二钠抑制作用明显。提示：在变应性鼻炎发病机理中起作用的不但有植物神经，而且有伤害性感觉神经。说明变应原鼻激发试验是探讨变应性鼻炎发病机理的手段之一。

SPA-ELISA和Map-IFAT诊断肺螨病的研究

目的 探讨葡萄球菌A蛋白 -酶联免疫吸附试验 (SPA -ELISA)和螨成虫抗原片间接荧光抗体试验 (Map-IFAT)对肺螨病的诊断价值。方法 应用SPA -ELISA和Map-IFAT分别对肺螨病组 (35例 )、疮疮组 (35例 )、蠕形螨组 (38例 )、对照组 (30例 )进行血清抗体检测并对比分析。结果 SPA -ELISA检测血清螨特异性IgG阳性率和Map -IFAT血清抗螨抗体的阳性率 :肺螨组分别为94.3 %和 88.6 % ;疥疮组分别为 5 .7%和 0 ;蠕形螨组均为 0 ;对照组分别为 3 .3 %和 6 .7%。两种方无显著性差异 (P >0 .0 5)。两组方法联合使用其阳性率为 97.1 4 %。结论 SPA -ELISA和Map -IFAT对肺螨病的诊断均有较高的特异性敏感性 ,而SPA -ELISA法在肺螨病的大规模的流行病学调查中具有很大的优点 ,两者联合应用可提高诊断肺性螨病的准确性。

小儿变应性鼻炎症状与尘螨特异性IgE及家居环境尘螨变应原含量相关性分析

目的探究学龄前儿童变应性鼻炎症状与家居环境尘螨及尘螨特异性Ig E（specific Ig E,s Ig E）相关性,为小儿过敏性疾病防治工作提供理论依据。方法出生于芜湖市第二人民医院,3~4周岁时,对患有变应性鼻炎儿童进行家庭内随访,评估患儿变应性鼻炎症状积分,采集患儿家居环境灰尘样本,应用酶联免疫吸附法测定尘样中屋尘螨第1组分变应原（Der p1）和粉尘螨第1组分变应原（Der f1）含量,并对患儿进行血清尘螨s Ig E水平检测。结果对采集的64份尘螨样本进行相关性分析,小儿变应性鼻炎症状与屋尘螨s Ig E和粉尘螨s Ig E之间有正相关性（P〈0.05）;小儿变应性鼻炎症状与Der p1和Der f1之间有正相关性（P〈0.05）。患儿居室内Der p1和Der f1暴露水平与屋尘螨s Ig E及粉尘螨s Ig E相互之间没有统计学意义上的相关性（P〉0.05）。结论小儿变应性鼻炎症状与家居环境尘螨含量及尘螨s Ig E呈正相关,给临床科研提供了一个研究方向,提示可通过检测s Ig E水平初步预测变应性鼻炎症状严重性,通过加强尘螨健康教育及降低居室环境尘螨含量来防治过敏性疾病和改善生活质量。

间接荧光抗体试验诊断肺螨病的研究

本文用粉尘螨类为主的成螨制成螨体抗原片做间接荧光抗体试验，采用ＩｇＧ荧光抗体，结果５８例已确诊肺螨病患者的阳性率为９４．８％，同时对其中２０例肺螨病患者采用ＩｇＭ荧光抗体作了ＩＦＡ实验比较，仅３例出现了阳性反应。螨体显示荧光的主要部位在螯肢、足部和腹面。认为此法用于肺螨病的诊断具有较高的敏感性和特异性，可应用于临床肺螨病的辅助诊断。

Der p2重组胞壁型E.coli-BCG穿梭表达载体的构建和鉴定

目的 :构建能够携带外源蛋白屋尘螨抗原 (Derp2 )基因并能在胞壁表达的E .coli BCG穿梭载体。方法 :用PCR技术 ,从结核分支菌毒株H37Rv基因中 ,扩增结核分支杆菌 19kDa抗原的胞壁区及其上游调控元件 (19 ss)基因 ,并克隆入含有Derp2基因的E .coli BCG穿梭载体 pOLYG中。用间接免疫荧光染色法 ,检测该载体能够携带并表达的Derp2基因在牡牛分支杆菌宿主中表达。结果 :经测序证实 ,所克隆的 19 ss基因序列正确。所构建的含有 19 ss基因的E .coli BCG穿梭载体 (pCW )能完成在大肠杆菌和牡牛分支杆菌细胞之间的穿梭 ,并介导抗生素抗性基因表达。经免疫荧光检查 ,外源基因Derp2以脂蛋白的形式表达于分支杆菌宿主的表面。 结论 :成功地构建了以胞壁嵌合形式表达外源蛋白的E .coli

胞壁表达Der p2的重组BCG对BALB/c小鼠Th细胞免疫应答的影响

目的:观察接种以膜蛋白形式表达屋尘螨抗原Der-p2基因的重组BCG(rBCG),对BALB/c小鼠Th细胞免疫应答的影响。方法:以生理盐水为对照,分别将rBCG和BCG经腹腔注射接种于6～8wk龄和新生BALB/c小鼠,用ELISA法测定小鼠血清、脾脏T细胞培养上清(STLCS)中IL4、IFN-γ水平,用双色荧光标记流式细胞仪法测定脾脏细胞Th细胞亚群。结果:接种rBCG和BCG后,成年和新生小鼠血清和STLCS中IL4水平较对照组显著降低、IFN-γ水平显著升高;无论成年鼠还是新生鼠,在CD4+的脾脏细胞中,IFN-γ+细胞的比例明显升高,而IL4+细胞比例明显降低;此外,在两个年龄组小鼠,接种rBCG者脾细胞均产生了较BCG组更高水平的IFNγ;同时,用rBCG免疫的两组小鼠脾脏CD4+IFN-γ+的细胞比例也明显高于BCG免疫各组。结论:无论rBCG还是BCG通过腹腔注射免疫,均可诱导不同年龄BALB/c小鼠产生Th1免疫应答;表达在rBCG细胞壁上的Derp2被当成BCG的成分,为机体免疫系统所识别,抗原再次接触进一步刺激了Derp2特异性的Th1应答。这些结果表明,胞壁型抗原重组BCG可作为有效的疫苗,特异性地调节Th1/Th2平衡。

HLA-DRB1、DQB1基因与汉族哮喘的相关性研究

探讨 HL A- DRB1、DQB1位点基因在中国汉族哮喘家系中与哮喘的相关性。用序列特异性引物 -聚合酶链反应 (PCR- SSP)方法 ,对 10 1例哮喘家系成员和 6 0例正常对照者进行了 HL A- DRB1、DQB1等位基因的分型 ,并分析了 DRB1、DQB1基因在两组中的分布。结果示 ,与正常对照组比较 ,哮喘患者组 DRB1* 15等位基因频率 (2 0 .93% )较正常对照组 (6 .6 7% )明显增高 (χ2 =10 .95 ,P<0 .0 5 ) ;DQB1* 0 6 0 1等位基因频率在哮喘患者组(31.4 0 % )较正常对照组 (7.5 % )明显增高 (χ2 =2 3.0 8,Pc<0 .0 1)。同时发现 HL A- DRB1* 0 7等位基因频率在对屋尘螨抗原皮试阳性家系成员中 (2 7.4 2 % )较家系中皮试阴性者 (5 .36 % )显著增高 (χ2 =10 .83,Pc<0 .0 5 )。HL A- DRB1* 15和 DQB1* 0 6 0 1可能是汉族哮喘的遗传等位易感基因 ,HL A- DRB1* 0 7在限定对屋尘螨抗原特异性 Ig

分泌表达Der p2的重组BCG的构建与鉴定

目的构建并鉴定能够分泌表达外源蛋白——屋尘螨抗原(Derp2)的基因重组卡介苗(rBCG)。方法采用PCR技术,从结核分枝杆菌H37Rv基因中扩增信号肽Alpha抗原(α-ss)的穿膜区基因,经测序鉴定后克隆入胞内表达Derp2的rBCG中。通过Westernblot鉴定目标抗原在rBCG中的表达。结果经测序证实,所克隆的α-ss信号肽基因序列正确,构建的Derp2-rBCG能完成在大肠埃希菌(E.coli)和牡牛分枝杆菌细胞之间的穿梭,并介导抗生素抗性基因表达。外源基因Derp2表达于BCG培养上清。结论成功构建了以分泌方式表达外源蛋白的Derp2-rBCG。