红景天苷改善顺铂引起的小鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元损伤的机制

目的探究红景天苷(SAL)改善顺铂(CIS)引起的耳蜗毛细胞(CHC)和螺旋神经节神经元(SGN)损伤的作用及其与环磷腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/cAMP效应元件结合蛋白(CREB)通路的关系。方法分离新生C57BL/6小鼠的耳蜗基底膜,分为对照组(C组)、CIS组、SAL组、SAL+SQ22536(cAMP抑制剂)组和SAL+H-89(PKA抑制剂)组,每组20条。C组仅加入无血清BME培养液;CIS组在培养液中加入15μmol/L CIS;SAL组在CIS组基础上加入5μmol/L SAL;SAL+SQ22536组在CIS组基础上加入5μmol/L SAL和5μmol/L SQ22536;SAL+H-89组在CIS组基础上加入5μmol/L SAL和30μmol/L H-89。各组在培养箱中孵育48 h后,免疫荧光染色观察各组CHC和SGN损伤;试剂盒检测各组耳蜗基底膜中ROS和cAMP含量;Western blot检测各组PKA、p-CREB、CREB、Bcl-2、BDNF、NF-M蛋白水平。结果CIS组CHC排列混乱、体积肿大,SGN细胞核破碎、神经突缺失,SAL可减轻CHC和SGNs损伤。与C组相比,CIS组CHC、SGN数量较少(P<0.05),ROS、cAMP含量、PKA、BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白及p-CREB/CREB水平较高(P<0.05);与CIS组相比,SAL组CHC、SGN数量较多(P<0.05),ROS含量较低(P<0.05),cAMP含量、PKA、BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白及p-CREB/CREB水平较高(P<0.05)。SQ22536和H-89均可逆转SAL对CHC和SGN的保护作用。结论SAL可能通过激活cAMP/PKA/CREB通路,促进抗凋亡蛋白和神经保护因子表达,缓解CIS引起的CHC和SGN损伤。

当归芍药散调控IKK/IκBα/NF-κB通路对老年性聋小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡的影响

目的探究当归芍药散调控核转录因子-κB抑制蛋白激酶(IKK)/核因子κB抑制蛋白(IκBα)/核因子-κB(NF-κB)通路对老年性聋小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡的影响。方法将48只C57BL/6J小鼠随机分为老年性聋模型组(Model组)、低剂量当归芍药散组(中药-L组,3.2 g/kg生药)、高剂量当归芍药散组(中药-H组,6.4 g/kg生药)和高剂量当归芍药散+IKK/IκBα/NF-κB信号通路激活剂白藜芦醇(RES)组(中药-H+RES组,6.4 g/kg生药+43.33 mg/kg RES),每组12只小鼠;取12只2月龄的C57BL/6J小鼠作为对照组(Control组)。采用听性脑干反应(ABR)检测各组小鼠听阈值;HE染色观察小鼠耳蜗螺旋神经节的病理变化,并对小鼠耳蜗中回与底回的螺旋神经节细胞的数量进行计数;TUNEL染色法检测小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的凋亡。ELISA法检测小鼠耳蜗组织中丙二醛(MDA)与超氧化物歧化酶(SOD)水平。qRT-PCR法检测小鼠耳蜗组织中IL-1β、IL-6与TNF-αmRNA水平。Western blot法检测小鼠耳蜗组织IKK/IκBα/NF-κB通路与凋亡相关蛋白的表达。结果Model组小鼠较Control组小鼠8 kHz、16 kHz、24 kH、32 kHz听阈值、耳蜗螺旋神经节组织TUNEL阳性细胞数、耳蜗组织MDA及IL-1β、IL-6与TNF-αmRNA水平、p-IκBα、凋亡蛋白(Bax、cleaved-Caspase-3)表达水平、IKK、NF-κB p65磷酸化水平均显著升高(均P<0.05),耳蜗螺旋神经节细胞数量、SOD水平、IκBα蛋白表达水平显著降低(均P<0.05),耳蜗螺旋神经节细胞的形态异常、排列疏松紊乱,发生空泡化,出现病理学损伤。中药-L组、中药-H组小鼠较Model组相应指标变化程度较轻(均P<0.05)。RES减弱了当归芍药散对老年性聋小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡的抑制作用。结论当归芍药散可能通过下调IKK/IκBα/NF-κB通路抑制老年性聋小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡。

腺病毒介导的NT3基因转染对噪音损伤的耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用

神经营养素 3(neurotrophin 3,NT3)作为螺旋神经节细胞特异的营养因子 ,可有效地支持内耳传入神经元的存活 ,因此有望成为治疗因其退变而引起的感音性神经性耳聋的有效因子。实验采用腺病毒介导lacZ基因 ,检测了外源基因在豚鼠内耳中的长期表达。用噪音制备了豚鼠耳聋模型 ,在噪音损伤后第 7天 ,通过圆窗膜注入 1× 10 8重组腺病毒。注入神经营养素 3重组腺 (Ad NT3)的组为实验组 ,注入Ad lacZ的为对照组。 4周后 ,经NT3抗体免疫细胞化学染色可见 ,在注入Ad NT3病毒的实验组中 ,在内耳多种细胞中有明显的NT3蛋白的表达。HE染色显示 ,注射Ad lacZ组的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞明显退变 ,螺旋神经节内细胞间隙拉大 ,细胞密度明显低于注射Ad NT3实验组动物 (P <0 .0 1)。这一结果说明 ,腺病毒介导的NT3基因可长期表达于内耳中 ,并且可在噪音引起毛细胞死亡后有效地抑制螺旋神经节细胞的退变。

顺铂对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡及caspase-3表达的影响

目的:建立小鼠顺铂(CDDP)耳毒性模型,研究不同剂量顺铂对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡及caspase-3表达的影响。方法:采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术检测螺旋神经节细胞的凋亡;应用免疫组织化学Envision法检测caspase-3在螺旋神经节中的表达;同时结合听脑干反应(ABR)测试,观察用药前后小鼠听力的变化。结果:不同剂量顺铂组小鼠体重和听力明显下降,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05,P<0.01);并且随着顺铂给药剂量的增加,小鼠耳蜗螺旋神经节中TUNEL阳性细胞数增多,以及caspase-3表达明显增强。结论:应用小鼠能建立可靠的顺铂耳毒性模型;顺铂可导致耳蜗螺旋神经节细胞凋亡,而且此凋亡过程中有caspase-3的参与,进一步证实了凋亡可能是顺铂耳毒性机制之一。

强噪声暴露下豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡及Caspase-3的表达

目的探讨强噪声能否诱导豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞(sprial ganglion cell,SGC)的凋亡及SGC的凋亡是否与凋亡蛋白酶Caspase-3信号转导有关。方法选用健康雄性白色豚鼠20只,随机分为4组,每组5只,其中3组为实验组,1组为对照组。将实验组动物暴露于4kHz、120dB SPL窄带噪声中4h,分别测试噪声刺激停止后1、4、14d及对照组豚鼠听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)。通过透射电镜和脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(ternial-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeing,TUNEL),检测SGC凋亡细胞,免疫组织化学方法检查Caspase-3蛋白的表达。结果透射电镜观察发现实验组SGC出现了凋亡细胞的特征性改变。实验组SGC的TUNEL染色明显增强,Caspase-3的表达增高,与对照组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论强噪声可以诱导SGC凋亡;SGC凋亡与caspase-3的激活有关。

谷氨酸受体在噪声所致豚鼠螺旋神经节细胞损伤中的作用

本文旨在研究谷氨酸及其受体在噪声致豚鼠螺旋神经节细胞损伤中的作用。实验分为在体和离体两部分。(1)在体实验:豚鼠分为生理盐水(NS,10μL)组,NS(10μL)+噪声组和犬尿喹啉酸(kynurenic acid,KYNA,5 mmol/L,10μL)+噪声组,每组15只。用微量注射器经完整圆窗膜表面给予NS或KYNA;暴露于白噪声110 dB SPL,1 h。在圆窗给药前及噪声暴露后测试听觉脑干诱发电位(auditory brainstem response,ABR)阈值及Ⅲ波幅值,听神经复合动作电位(compound action potential,CAP)阈值及N1波幅值和潜伏期,测试后取基底膜进行透射电镜观察。(2)离体实验:观察高浓度谷氨酸对急性分离的豚鼠螺旋神经节细胞的影响。结果显示,NS+噪声组豚鼠ABR及CAP阈移显著高于KYNA+噪声组,且Ⅲ波和N1波幅值明显降低,潜伏期明显延长。NS+噪声组豚鼠毛细胞及传入神经末梢急性水肿和线粒体结构破坏;KYNA +噪声组豚鼠的毛细胞和传入神经末梢无明显变化。离体胞外施加谷氨酸可引起螺旋神经节细胞逐渐出现水肿、变性,最后死亡。本实验提示,噪声暴露可引起豚鼠听功能损伤,毛细胞/传入神经突触的结构破坏和螺旋神经节细胞变性、死亡;这种损伤可能与噪声暴露引起谷氨酸的过度释放有关;谷氨酸通过其受体介导致使螺旋神经节细胞损伤,谷氨酸受体的广谱拮抗剂KYNA可减轻噪声对螺旋神经节细胞的损伤。

耳蜗毛细胞和螺旋神经节及其神经纤维的联合定量观察

目的：将耳蜗基底膜取材技术与耳蜗切片技术相结合以观察同一耳蜗中几个主要结构在病理发展中的相互关系。方法：耳蜗铺片用于定量观察毛细胞，骨性螺旋板切片用于定量观察缰孔内的神经纤维，中轴切片用于定量观察螺旋神经节。结果：将卡铂耳中毒灰鼠的耳蜗标本与正常灰鼠进行比较，显示内毛细胞，神经纤维和螺旋神经节的损失百分比基本一致。结论：卡铂对内毛细胞，神经纤维和螺旋神经节都有破坏作用，至于在卡铂病变早期，究竟哪一部分对损伤更敏感，有待进一步研究。

刺五加注射液对庆大霉素耳中毒豚鼠耳蜗螺旋神经节中谷氨酸及其受体表达的影响

目的观察刺五加注射液对庆大霉素耳中毒豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞中谷氨酸及其受体表达的影响,并探讨相关机制。方法实验动物随机分成正常对照组、庆大霉素组、刺五加+庆大霉素组和刺五加注射液组。采用腹腔注射庆大霉素制作耳毒模型,刺五加注射液进行干预治疗。连续用药10 d后,观察各组实验动物听阈变化、耳蜗螺旋神经节中谷氨酸及其受体表达情况。结果与正常对照组和刺五加注射液组相比,庆大霉素组豚鼠听阈阈值和耳蜗螺旋神经节中谷氨酸及其受体的表达明显增高;刺五加注射液可显著改善庆大霉素所致的听阈改变和降低谷氨酸及其受体的表达。结论庆大霉素作用下耳蜗螺旋神经节细胞中谷氨酸和其相应受体表达增高;刺五加注射液可通过抑制谷氨酸及其受体在耳蜗螺旋神经节中的过度表达,对螺旋神经节细胞起到保护作用。

豚鼠脑震荡后耳蜗功能及螺旋神经节细胞的病理变化研究

目的探讨脑震荡后耳蜗毛细胞功能以及螺旋神经节细胞的病理变化,为临床患者脑震荡后耳聋的诊治及法医学的鉴定提供一定的实验依据。方法选用听力正常的白毛红目豚鼠40只,雌雄不限,随机分为四组,分别为正常对照组、撞击后4周组、撞击后6周组和撞击后8周组。应用听性脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)测试四组动物的听力和耳蜗功能,应用透射电镜观察各组耳蜗螺旋神经节细胞的病理改变。结果ABR阈值:撞击后4周、6周、8周组分别与正常对照组阈值比较均提高,差异有统计学意义(P<0.05);DPOAE结果:撞击后4周组与正常对照组在频率0.5kHz、0.7kHz、1kHz、2kHz比较有差异(P<0.05);撞击后6周组与正常对照组仅在频率4kHz比较有差异(P<0.05);撞击后8周组与正常对照组只在频率1kHz比较有差异(P<0.05)。透射电镜发现实验各组螺旋神经节细胞有不同程度的受损,表现为线粒体肿胀,空泡样变,线粒体嵴消失或位于周边,粗面内质网扩张等。结论脑震荡伤后可以引起ABR、DPOAE的异常和耳蜗螺旋神经节细胞的损伤。

新生豚鼠谷氨酸钠内耳螺旋神经节损伤模型

目的 研究谷氨酸钠不同用药剂量对新生豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞及听力损伤的程度 ,以探索稳定而可靠的谷氨酸钠耳聋模型 .方法 豚鼠随机分成 4组 ,每组 (G0 ,G1,G2 ,G4 )分别按 0 ,1,2 ,4g·kg- 1 ·d- 1 ,ip给予谷氨酸钠 (Gluta mate ,G) ,连续 7d ,停药后饲养 35d .处死前测其耳廓反射以及脑干听觉诱发电位 .后取耳蜗 ,纵向石蜡切片 ,焦油紫染色 ,光镜观察 .结果 G0组死亡率为 0 10 ,听阈为 (43 5± 3 4 )dB ,平均细胞密度为 (4345 7± 2 4 1 4 )个·mm- 2 ;G1组死亡率为2 10 ,听阈为 (43 8± 9 4 )dB ,细胞密度为 (42 15 4± 2 95 2 )个·mm- 2 ;G2组死亡率为 4 10 ,听阈为 (6 7 3± 2 3 3)dB ,细胞密度为 (1997 5± 10 19 8)个·mm- 2 ;G4组死亡率为 2 0 2 0 .经方差分析 ,F检验 ,G2组与其他组比较 ,差异显著 ,P <0 0 1,GO组与G1组 ,差异无显著性 ,P >0 0 5 .结论 谷氨酸钠对新生豚鼠毒性损伤存在剂量依赖关系 ,2g·kg- 1 ·d- 1 ,ip可引起豚鼠均匀一致的耳蜗螺旋神经节细胞的消失 ,听力下降明显 ,死亡率较低 ,模型较为稳定 .

银杏叶提取物对噪声致大鼠螺旋神经节损伤的保护作用

目的探讨银杏叶提取物对大鼠噪声暴露后螺旋神经节损伤的保护作用。方法将36只SD大鼠分为三组:正常对照组(正常组)、生理盐水+噪声暴露组(噪声组)、银杏叶提取物+噪声暴露组(用药组),每组12只。后两组大鼠每天暴露于110dBSPL白噪声中6h,连续10天,且于噪声暴露开始每天分别腹腔注射生理盐水和银杏叶提取物10ml/d。所有大鼠均于实验前和实验第10天检测听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR),并于第二次测试ABR后处死动物,检测耳蜗组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量,并用透射电镜观察耳蜗螺旋神经节细胞的超微结构变化。结果实验后噪声组和用药组的ABR阈值均高于正常组,但用药组显著低于噪声组,差异有统计学意义;用药组SOD活性较噪声组明显增加、MDA含量较噪声组显著降低,差异有统计学意义;用药组耳蜗螺旋神经节损害明显轻于噪声组。结论银杏叶提取物对大鼠噪声暴露后螺旋神经节细胞的损害具有保护作用。

顺铂致豚鼠螺旋神经节细胞凋亡及Caspase-3活化的研究

目的 探讨顺铂的耳毒性作用与螺旋神经节细胞 (sprialglanglioncell,SGC)凋亡的关系 ,及SGC的凋亡是否与凋亡蛋白酶Caspase - 3信号转导有关。方法 取 40只听力正常的豚鼠 ,随机分为顺铂 1、2、4天组和对照组 ,每天检测听性脑干反应 (ABR)和 40Hz相关电位以观察豚鼠高、低频的听阈变化 ,并用TUNEL法检测凋亡细胞数量变化 ,免疫组化检测SGC中Caspase - 3p2 0活性片段的表达。结果 随着注射顺铂时间的延长 ,豚鼠听力逐渐下降 ,同时SGC的TUNEL染色明显增强 ,Caspase- 3p2 0活性片段的表达增高 ,与对照组比较均有显著性差异 (P <0 .0 1)。结论 顺铂的耳毒性损害机制与SGC的凋亡有关 ;顺铂所致的SGC凋亡过程中有Caspase -

EGCG对过氧化氢造成的螺旋神经节细胞损害的抑制作用

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸盐 [(- ) -epigallocatechin - (3) -gallate ,EGCG]对过氧化氢(H2 O2 )所致培养耳蜗螺旋神经节细胞 (spiralganglioncells ,SGC)氧化损伤的保护作用。方法 SGC在体外培养 2 4小时后 ,分别加入不同浓度 (2 5、5 0、10 0、2 0 0及 5 0 0 μmol L)的H2 O2 和 或EGCG(10、5 0及 10 0 μg ml)后继续培养 2 4小时 ,采用四唑盐 (MTT)比色试验和Hoechst332 5 8核染色法分别检测细胞活力和凋亡率 ,并以经典抗氧化剂维生素C为对照。结果 当H2 O2 浓度≥ 5 0 μmol L时 ,细胞存活率及细胞凋亡率与对照组相比明显下降 (P <0 .0 5 ) ,并随H2 O2浓度升高而加重。EGCG处理后 ,能明显提高细胞存活率 ,降低细胞凋亡率 (P <0 .0 5 ) ,随着EGCG浓度提高 ,其保护作用加强 ,且较VitC更具优势。结论 绿茶提取物EGCG在H2 O2

APE/Ref1在H_2O_2诱导耳蜗螺旋神经节细胞氧化损伤过程中的表达

目的研究氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redox factor1,APE/Ref-1)在过氧化氢(H2O2)诱导耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGCs)氧化损伤过程中的表达。方法原代培养离体大鼠SGCs,采用免疫荧光和Western blot方法检测APE/Ref-1在H2O2诱导SGCs氧化损伤过程中的表达。台盼蓝染色法计算SGCs氧化损伤过程中的死亡率。结果APE/Ref-1在体外正常培养SGCs细胞质和细胞核均有表达,细胞核较强。H2O2浓度≥60μmol/L时,SGCs死亡率显著升高,APE/Ref-1在细胞核表达明显减弱,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论APE/Ref-1在氧化环境下SGCs细胞核表达减少,细胞死亡率升高,提示氧化环境下细胞活性降低可能与APE/Ref-1表达减少有关。

卡铂对灰鼠螺旋神经节的早期损害

实验中观察了卡铂(50mg/kg)对灰鼠耳蜗螺旋神经节细胞的急性损害.注药后6小时即可发现在Ⅰ型神经元胞体和神经纤维中有空泡形成.注药后1天可见Ⅰ型神经元内充满大空泡并开始发生坏死.其结果表明卡铂产生对螺旋神经节的毒害相当迅速.提示耳蜗传入神经系统可能是卡铂的第一个靶组织.

硫酸链霉素对豚鼠螺旋神经节细胞膜钙内流的影响

目的 观察硫酸链霉素是否影响耳蜗螺旋神经节细胞 (spiralganglioncells,SGC)胞膜去极化时细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i)升高的能力 ,并观察这种影响在不同药物浓度下以及相同药物浓度对蜗轴不同部位的螺旋神经节细胞的作用的异同 ,旨在深入探讨硫酸链霉素急性耳毒性的分子生物学机制。方法 豚鼠全身麻醉后断头活杀 ,酶 机械法分离获得单离的SGC。 10 μmol L的钙敏荧光探针Fluo 3 AM负载 30min后用ACASUltima型激光扫描共聚焦显微镜观察各种条件下SGC[Ca2 + ]i的动态变化。结果 ①SGC[Ca2 + ]i在标准细胞外液灌流过程中保持稳定。② 15 0mmol L的高钾细胞外液灌流导致 12 14个细胞的 [Ca2 + ]i明显升高 ,而高钾无钙细胞外液灌流仅有 1 10个细胞[Ca2 + ]i 明显的升高。③经 1mmol L、0 .1mmol L、0 .0 1mmol L硫酸链霉素作用后 ,再灌流高钾细胞外液则分别有 0 9、6 14、7 13个细胞 [Ca2 + ]i 升高。④经 0 .0 2mmol L硫酸链霉素作用后 ,对来源于顶回和底回的SGC灌流高钾细胞外液分别有 5 10和 0 15个细胞 [Ca2 + ]i 升高。结论 高钾细胞外液灌流SGC[Ca2 + ]i 明显升高 ,钙升高的来源为细胞外钙离子的内流。硫酸链霉素可以阻断这种钙离子的内流 ,其阻断作用具有浓度和部位依赖性。

爆震后豚鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞定量观察

目的 :观察爆震后耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的变化。 方法 :复制强脉冲噪声致聋豚鼠模型 ,以脑干听觉诱发电位测试仪测定听神经脑干反应 (ABR)阈值 ,通过耳蜗铺片计算机图像分析行毛细胞计数 ,耳蜗病理切片螺旋神经节细胞计数。结果 :正常对照组和噪声暴露后 2 1d的实验组耳蜗钩回、第 1和第 2回毛细胞总数分别为 3 5 99± 15 9.6个 ,6 0 2 2± 98.4个 ;二下螺旋神经节细胞计数分别为 (5 1± 4.72 )个 ,(2 7± 6 .94)个 ,以上均数各组间相差显著。结论 :爆震后不仅 ABR阈值升高 ,毛细胞数减少 。

EGCG对H_2O_2诱导的螺旋神经节细胞MnSOD基因表达的影响

目的 :探讨表没食子儿茶素没食子酸盐 (EGCG)在双氧水 (H2 O2 )诱导耳蜗螺旋神经节细胞 (SGCs)氧化损伤中对线粒体抗氧化酶基因 MnSOD基因表达的影响。方法 :培养离体SGCs,采用半定量RT PCR方法检测加入不同浓度H2 O2 和 /或EGCG后螺旋神经元MnSOD基因的表达情况。以经典抗氧化剂维生素C作对照。结果 :随着H2 O2 浓度提高 ,MnSOD基因的表达亦随之升高 ;在H2 O2 浓度大于 10 0 μmol/L时MnSOD基因表达明显上调 (P <0 .0 5 ) ,10 0 μg/mlEGCG能明显抑制H2 O2 诱导的MnSOD基因表达 (P <0 .0 5 )。结论 :EGCG可能通过清除氧自由基 ,提高MnSOD酶活性 ,抑制H2 O2

老化豚鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞定量研究

本文对3～3.5年老化豚鼠进行毛细胞和螺旋神经节细胞定量研究,并与1.5月龄青年豚鼠比较。结果表明:老化豚鼠外毛细胞损失率明显高于青年组（P<0.01）,而内毛细胞损失率无明显差异。外毛细胞损失率OHC3>OHC2>OHC1。顶回和底回螺旋神经节细胞分别减少15％和19.81％。耳蜗中轴PAS染色,螺旋神经节细胞内大量脂褐素Lp增加,柯替氏器不同程度退变,血管纹及螺旋韧带萎缩程度轻,耳蜗神经纤维减少,但胶质细胞增加。讨论了老化豚鼠形态变化对听功能的影响。