螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因的删除和主要产生螺旋霉素组分Ⅰ菌株的获得

螺旋霉素(SP)为16元环大环内酯类抗生素,含有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ个组分,其结构的差异为16元内酯环的C3上分别连接羟基(SPⅠ)、乙酰基(SPⅡ)和丙酰基(SPⅢ);SPⅡ和SPⅢ是在相同的3-O-酰基转移酶催化下SPⅠ进一步酰化的产物。SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ在生物学活性方面无大差异。为简化螺旋霉素组分,便于今后对其结构进行进一步改造,根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶序列,设计了简并性PCR引物,并采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法,从螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus F21中进行特异性扩增,获得了螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因(sspA)及其侧翼序列,共约4.3kb(其中的3457nt DNA序列已被Genbank收录,DQ642742)。采用DNA同源双交换技术对S.spiramyceticus F21中的sspA进行了删除。对螺旋霉素原株和sspA缺失变株进行发酵产物提取和HPLC分析表明:原株中SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ的相对含量分别为7.8%、67%和25%,变株中则分别为72%、18%和9.6%;变株主要组分为SPⅠ。螺旋霉素sspA缺失变株的获得为螺旋霉素组分简化及其衍生物的结构改造奠定了基础。

利用CRISPR-Cas9系统构建新型异戊酰螺旋霉素Ⅰ产生菌

异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin,ISP)Ⅰ是必特螺旋霉素(Bitespiramycin,BT)的一种主组分,其抗菌活性与BT相似,而且作为单一组分在质控和剂型上更具优势,目前正在进行临床前研究。原有的 ISPⅠ工程菌株经过3次基因改造,已经具有2种抗性基因,很难再进行遗传操作。前期研究利用经典同源重组的方法无法构建无抗性的ISPⅠ产生菌,文中利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在螺旋霉素(Spiramycin,SP)产生菌中成功将3位酰基化酶的基因bsm4替换为组成型强启动子ermEp~*控制下的异戊酰基转移酶基因(Isovaleryltansferase gene,ist)。删除bsm4后突变株只能产生SPⅠ组分,外源基因ist的表达产物催化SPⅠ在其4″位进行异戊酰化修饰形成ISPⅠ。经过HPLC和质谱鉴定,阳性菌株ΔEI的发酵产物中只有ISPⅠ一种ISP组分,证实新的ISPⅠ工程菌株构建成功。ΔEI菌株不带有抗性基因,可重复利用CRISPR-Cas9系统进行基因操作来获得新的改良菌株。

螺旋霉素对金黄色葡萄球菌耐药突变体的转录组特征分析

螺旋霉素Ⅰ是一类重要的大环内酯类抗生素,但由于耐药菌的产生限制了临床使用。为了在转录水平上全局性的了解细菌耐药前后对抗生素响应上的变化和机制,通过基于RNA-seq方法对螺旋霉素敏感菌株Staphylococcus aureus ATCC29213和其诱导耐药突变菌株S.aureus ATCC29213-R在抗生素压力诱导前后菌体的转录组表达变化进行了分析。研究结果证明了螺旋霉素Ⅰ可诱导S.aureus ATCC29213产生耐药菌株,并通过测序发现该菌的23S rRNA 2089位A→C颠换,该突变位点在S.aureus中是首次报道。此外,还发现螺旋霉素Ⅰ能使S.aureus ATCC29213-R菌株的322个基因上调,82个基因下调,其中涉及精氨酸降解的基因arc A,arc C和arg F表达水平分别上调35,18.05和30.84倍,涉及精氨酸合成的基因arg H和arg G分别下调13.51和21.45倍,其综合作用减少精氨酸的内源性合成;因此,精氨酸代谢途径可能成为治疗23S RNA突变耐药金黄色葡萄球菌感染新的潜在靶点。

埃莎霉素Ⅰ组分高含量、高产量基因工程菌WSJ-IA及其原株的鉴定

【目的】利用调节基因acyB2激活异戊酰基转移酶(ist)基因表达的特点,将ist与调节基因acyB2在异戊酰螺旋霉素(埃莎霉素)Ⅰ产生菌菌株中共表达,获得埃莎霉素Ⅰ单组分的高含量及高产量菌株WSJ-IA。对其及原始螺旋霉素产生菌菌株Streptomyces spiramyceticus F21进行了初步鉴定。【方法】从形态学、培养和生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列、5个看家基因(atpD、gyrB、rpoB、recA和trpB)蛋白分析和系统发育树构建等方面对该菌株及其原株进行了鉴定。【结果】两株菌在形态培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平基本一致,在系统发育树分析中同处在一个分支中。而在16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平在系统发育上它们均与已知相近菌株处于不同的分支上,并且与不同基因的相近菌株各有不同,其中无一报道产生螺旋霉素。【结论】Streptomyces spira-myceticus F21可能是一个产生螺旋霉素的链霉菌新种,16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白序列分析可以作为埃莎霉素Ⅰ基因工程菌生产过程中进行鉴别的分子标志。

可利霉素体外抗结肠癌活性的研究

目的:评价可利霉素(carrimycin, CAM)及其单组分异戊酰螺旋霉素Ⅰ(isovalerylspiramycinⅠ, ISPⅠ)对结肠癌细胞的抑制作用,初步探讨其抗肿瘤的作用机制。方法:选择结肠癌细胞系LoVo,评价CAM及其单组分ISPⅠ与螺旋霉素(spiramycin, SP)及其单组分螺旋霉素Ⅰ(spiramycinⅠ, SPⅠ)的抗肿瘤活性,采用CCK-8试剂盒检测对细胞增殖的影响;采用克隆形成实验分析对细胞克隆形成能力的影响;采用流式细胞术分析对细胞凋亡的影响;采用划痕实验检测对细胞迁移能力的影响。通过转录组分析CAM、ISPⅠ发挥抗肿瘤活性可能作用的信号通路。结果:CAM及其单组分ISPⅠ可以有效抑制结肠癌细胞的增殖、克隆形成,能促使细胞凋亡比例增加,但对细胞迁移能力影响不明显;在给药6 h和9 h后,CAM及其单组分ISPⅠ在细胞内的相对含量高于SP及其单组分SPⅠ;转录组测序分析发现CAM及ISPⅠ可能作用于细胞粘附相关信号通路和PI3K/Akt信号通路。结论:CAM及其单组分ISPⅠ具有体外抗结肠癌活性,且优于SP及其单组分SPⅠ,这可能与其更好的细胞穿透性相关,CAM及ISPⅠ的抗结肠癌活性可能是通过作用于细胞粘附相关信号通路和PI3K/Akt信号通路而发挥的,这为进一步研究CAM及其单组分的抗肿瘤作用机制奠定了基础。

QuECHERS-HPLC-MS测定人血浆中3种大环内酯类抗菌药物及其代谢物含量

目的建立测定人血浆中3种大环内酯类抗菌药物(红霉素、地红霉素、螺旋霉素Ⅰ)及其代谢物(脱水红霉素、红霉素A烯醇醚、红霉胺、新螺旋霉素Ⅰ)的分析方法。方法用乙腈溶液提取,Qu ECHERS方法净化,采用无水硫酸镁和无水乙酸钠沉淀蛋白和盐析分层,无水硫酸镁和石墨碳烯净化,上清液氮气吹干后甲醇复溶待测,用Eclipse Plus C18色谱柱分离,电喷雾正离子模式,多反应离子监测扫描,内标法定量。结果 3种大环内酯类抗菌药物及其代谢物浓度在4~900 ng·mL^(-1)内的线性关系良好(r>0.999),定量限<10 ng·mL^(-1);在3个添加水平下,3种大环内酯类抗菌药物及其代谢物的提取回收率可达81.45%~96.82%,日内精密度<5.00%,日间精密度<10.00%。结论 Qu ECHERS-液相色谱串联三重四级杆质谱测定血浆中3种大环内酯类抗菌药物及其代谢物的分析方法简单,快速,灵敏,特异性强,适用于血浆中大环内酯类抗菌药物及其代谢物的测定。

HPLC-MS法同时测定大鼠血浆中大环内酯类成分的浓度

目的:建立高效液相色谱串联质谱法测定大鼠血浆中红霉素、螺旋霉素Ⅰ、脱水红霉素、红霉素A烯醇醚、新螺旋霉素Ⅰ的浓度。方法:用乙腈提取,SCX固相萃取柱净化,上清液氮气吹干后甲醇复溶待测;5个大环内酯类成分通过Hypersil Gold C_(18)色谱柱(100 mm×2.1 mm,5μm)分离,质谱电喷雾正离子模式检测,多反应离子监测扫描,标准曲线法定量。结果:5个大环内酯类成分浓度在5~500 ng·mL^(-1)范围内的线性关系良好(r>0.999),在3个浓度水平下,5个大环内酯类成分的回收率可达84.6%~96.2%,精密度为1.6%~2.5%;5个大环内酯类成分的基质效应在81.23%~109.3%之间;方法检测下限为1.4~1.9μg·kg^(-1),方法定量下限为4.5~6.8μg·kg^(-1)。结论:HPLC-MS法测定大鼠血浆中5个大环内酯类成分的分析方法简单、快速,特异性强,适用于血浆中大环内酯类成分的测定。