蟾毒它灵诱导急性早幼粒细胞白血病HL⁃60细胞铁死亡的机制研究

目的探究蟾毒它灵(Bufotalin)对急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞HL‐60铁死亡的作用及机制。方法用不同浓度(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0μg·mL^(-1))蟾毒它灵分别作用于APL细胞HL‐60,使用光学显微镜观察细胞的形态学变化;采用CCK‐8法检测细胞的存活率情况;采用Western blot法检测细胞中铁死亡相关蛋白CD71、xCT、FTH1、GPX4的表达水平;采用谷胱甘肽(GSH/GSSG)检测试剂盒检测细胞内GSH和GSSG的含量变化;采用脂质氧化(MDA)检测试剂盒测定细胞内MDA的含量变化。将0.5μg·mL^(-1)蟾毒它灵、0.1μmol·L^(-1)Fer‐1和0.5μg·mL^(-1)蟾毒它灵+0.1μmol·L^(-1)Fer‐1分别作用于HL‐60细胞,使用光学显微镜观察细胞形态学变化,并用Western blot法检测铁死亡相关蛋白的表达水平。结果不同浓度蟾毒它灵处理HL‐60细胞后,细胞形态呈现出哑铃型、梭形等不规则形状,细胞的存活率降低,且呈时间‐剂量依赖关系。与对照组相比,蟾毒它灵可降低铁死亡相关蛋白GPX4、xCT、FTH1的表达水平和总谷胱甘肽的含量(均P<0.01),升高CD71蛋白的表达水平和MDA含量(均P<0.05)。蟾毒它灵与铁死亡抑制剂Fer‐1联合处理HL‐60细胞后,与对照组比较,HL‐60细胞的生长数量和形态学无明显变化,CD71、xCT、FTH1、GPX4蛋白表达水平的差异也无统计学意义(均P>0.05)。结论蟾毒它灵可抑制APL细胞HL‐60的增殖并诱导铁死亡,其可能通过GPX4介导的抗氧化途径和铁代谢途径实现。

蟾毒它灵对人胃癌BGC-823细胞的促凋亡作用

目的考察蟾蜍甾烯类化合物的生物转化产物蟾毒它灵(bufotalin)对BGC-823细胞的促凋亡作用,初步探讨其作用机理。方法MTT法检测细胞毒作用、Hoechst染色法和Annexin Ⅴ染色法检测细胞凋亡,免疫印迹杂交法检测裂解形式的caspase-3。结果蟾毒它灵在1μmol/L时对BGC-823细胞的毒性作用达到50%以上,形态学观察和流式细胞仪检测结果显示蟾毒它灵可明显促进BGC-823细胞的凋亡,上调caspase-3的表达。结论蟾毒它灵对BGC-823细胞有明显的促凋亡作用,其作用机理可能通过caspase-3凋亡途径实现。

蟾毒它灵的研究进展

本文简要综述了蟾毒它灵的相关研究进展,其研究主要集中在提取分离、抗肿瘤作用机理、药物代谢动力学、毒性及合成等方面。

2-蟾毒它灵诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展

蟾毒它灵是从蟾酥中提取的化合物,属于蟾蜍二烯酸内酯,它不仅有抗心律失常、强心、抗菌、局部麻醉、解热、利尿等作用,并且对许多实体肿瘤和非实体肿瘤也有很好的抑制作用。蟾毒它灵诱导肿瘤细胞凋亡的机制主要与线粒体途径、死亡受体途径及内质网应激有关,本文就蟾毒它灵诱导肿瘤细胞凋亡分子机制的研究现状进行综述。

蟾毒它灵逆转急性髓系白血病HL60/ADR耐药细胞的作用及机制

为探讨蟾毒它灵逆转急性髓系白血病HL60/ADR细胞耐药的作用及机制,采用低浓度药物梯度诱导法建立HL60/ADR耐药细胞,采用CCK8法和Western blot检测耐药情况,采用0.01μg/mL蟾毒它灵对HL60/ADR细胞进行预处理24 h,通过CCK8法检测HL60/ADR对阿霉素的敏感性,通过Western blot检测MDR1、MRP1、BCRP 3种耐药蛋白的表达水平。CCK8检测结果显示:HL60/ADR细胞24 h的IC_(50)由2.344μg/mL提升至9.50μg/mL,耐药倍数是4.06倍,72 h的IC_(50)由0.0852μg/mL提升至1.039μg/mL,耐药倍数是12.19倍;0.01μg/mL蟾毒它灵预处理24 h可将HL60/ADR细胞24 h的IC_(50)降至1.572μg/mL,逆转倍数是6.04倍,72 h的IC_(50)降至0.2649μg/mL,逆转倍数是3.92倍。0.01μg/mL蟾毒它灵处理HL60/ADR细胞24 h后,Western blot检测结果显示:MDR1、MRP1、BCRP 3种耐药蛋白的表达水平显著降低。上述结果表明:蟾毒它灵能够通过降低MDR1、MRP1、BCRP 3种耐药蛋白的表达水平来逆转HL60/ADR细胞耐药,可为蟾毒它灵逆转白血病细胞耐药的相关研究提供理论依据。

静脉注射蟾毒它灵和华蟾毒它灵后大鼠胆汁中代谢产物的UPLC-UV-MS法分析

建立了超高效液相色谱-紫外分光光度-质谱(UPLC-UV-MS)法研究蟾毒它灵和华蟾毒它灵静脉给药后大鼠胆汁中的代谢产物。UPLC的高分辨率能够基线分离胆汁中的原药和代谢物,UV光谱图揭示了各种化合物量的关系,MS进一步对代谢物进行结构表征。结果显示,大鼠胆汁中原药的含量小于5%,主要代谢物是去乙酰基并羟基化蟾毒它灵和去乙酰基华蟾毒它灵。表明蟾毒它灵在大鼠体内代谢途径主要是水解并羟基化,华蟾毒它灵主要是水解反应。

蟾毒它灵体内外抗肿瘤作用的研究

目的评价蟾毒它灵的体内外抗肿瘤作用。方法采用SRB测试察蟾毒它灵对人非小细胞肺癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞SGC-7901和人宫颈癌细胞HeLa的生长抑制活性。通过静脉恒速输注方式给药,对S180及H22荷瘤小鼠进行蟾毒它灵体内药效评价,包括高剂量短时程给药和低剂量长时程给药。结果蟾毒它灵对SGC-7901、A549、Bel-7402、HeLa细胞作用72 h的IC50值分别为0.018、0.017、0.052、0.013μg/mL。蟾毒它灵采用恒速输注给药方式可以实现50%以上的抑瘤率。结论蟾毒它灵在体内外均具有很好的抗肿瘤效果。

蟾毒它灵通过线粒体途径诱导急性髓系白血病 HL-60细胞凋亡的实验研究

目的研究蟾毒它灵对急性髓系白血病HL-60细胞的作用及其机制,为急性髓细胞白血病的治疗提供新的思路。方法用终浓度为0、40、80、160μg/mL的蟾毒它灵作用于对数生长期的HL-60细胞24 h后,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,通过透射电子显微镜观察细胞内线粒体形态,蛋白免疫印迹法检测Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-9基因表达情况,并用正常的外周血B淋巴细胞作为对照组观察该化合物对正常细胞的毒性作用。实验结果用SPSS 22.0统计学软件录入数据并进行检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果蟾毒它灵能够抑制HL-60细胞增殖并诱导其凋亡,且对正常细胞毒性作用相较于癌细胞小,差异有统计学意义(P<0.05);随着药物浓度增加,细胞核异形,出现核膜分离,异染色质明显增多,线粒体伴有水肿扩张,部分线粒体脊消失模糊、空泡化,而对照组线粒体形态较好;随着药物浓度增加,Bax/Bcl-2比例增加,Cleaved-Caspase-9基因表达逐渐增加,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论本实验结果表明蟾毒它灵对急性髓系白血病HL-60细胞这种非实体肿瘤细胞也有抑制作用,并且对正常细胞影响较小,其作用机制主要是通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。

中华大蟾蜍皮的化学成分

目的研究中华大蟾蜍皮的化学成分。方法利用反复硅胶柱、ODS反相柱、制备液相、重结晶等手段分离分离纯化化学成分,根据化合物的理化性质和光谱数据并参考文献鉴定其化学结构。结果从中华大蟾蜍皮中分离得到6个化合物:胆甾醇(cholesterol,1)、棕榈酸胆甾烯酯(palmitatic acid cholesteryl ester,2)、蟾毒它灵(bufotalin,3)、沙蟾毒精(arenobufagin,4)、嚏根草配基(hellebrigenin,5)、嚏根草配基-3-辛二酸半酯(hellebrigenin-3-hemisuberate,6)。结论化合物6为新化合物。

蟾酥抗肿瘤有效成分的活性追踪分离及急性毒性研究

目的从传统中药蟾酥中寻找抗肿瘤活性强而毒性低的化合物。方法采用追踪分离的方式,以体外肿瘤细胞生长抑制强度为活性指标,同时结合小鼠急性毒性实验,对蟾酥的主要化学成分进行初步研究。结果采用活性追踪分离方式,从蟾酥中分离得到具有抑制肿瘤细胞生长活性同时对小鼠急性毒性较低的化合物蟾毒它灵,其对人非小细胞肺癌A549细胞具有较好的生长抑制作用,小鼠iv给药的LD50约为蟾毒灵的4倍,而且稳定性较好。结论综合化合物的活性、毒性及稳定性等因素,初步判断蟾毒它灵较其他同类化合物具有更好的抗肿瘤药物开发前景。

HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物

目的建立HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物(和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基)的方法。方法采用ODS-2(250 mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.15%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,体积流量1 mL/min,柱温40℃,检测波长296 nm。HPLC-MS联用的色谱条件与HPLC分离基本条件一致,流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液。通过电喷雾离子源,正离子模式扫描,对六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物进行分析鉴别。结果 9种蟾蜍二烯内酯类化合物均得到良好分离,线性关系良好(r≥0.999 6)。加样回收率均在92%~105%,RSD<5%。应用建立的HPLC-MS方法测定了10批六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物的量,分别为和蟾蜍他灵0.40~0.88 mg/g,沙蟾毒精0.32~0.83 mg/g,远华蟾毒精0.61~2.11 mg/g,去乙酰华蟾毒它灵0.15~0.32 mg/g,蟾毒它灵0.84~1.85 mg/g,华蟾毒它灵25.76~62.14 mg/g,蟾毒灵0.96~2.06 mg/g,华蟾酥毒基2.30~4.75 mg/g,脂蟾毒配基1.20~2.61 mg/g。结论所建立的定量测定方法简便、快速、准确可靠,专属性强,可用于六神丸的质量控制。

蟾酥原浆HPLC指纹图谱建立及8种成分含量测定

目的建立蟾酥原浆HPLC指纹图谱及原浆中8种成分含量测定方法,对不同产地蟾酥原浆进行成分含量差异比较,同时进行质量评价。方法以乙腈-水为流动相,梯度洗脱,检测波长296 nm,体积流量1.2 m L/min,柱温30℃,进样量10μL;建立蟾酥原浆指纹图谱,测定8个成分含量,对结果进行聚类分析和主成分分析。结果 18批样品指纹图谱中有12个共有峰,各样品相似度有所差异,8个成分在各自范围内线性关系良好(r2≥0.999 5),精密度、重复性RSD<0.5%,在30 h内稳定性较好(RSD<0.7%),日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基回收率平均值分别为103.7%、103.0%、102.9%、103.0%、103.9%、100.3%、103.4%、103.2%,且RSD均小于1.2%,8个成分含量测定结果及聚类分析和主成分分析结果可知不同产地原浆质量有所差异。结论该方法简便可靠,为蟾酥原浆质量把控提供一定依据及参考。

干蟾皮及其炮制品的指纹图谱建立与化学模式识别

目的:建立干蟾皮生品及炮制品UPLC指纹图谱,并同时测定干蟾皮中指标性成分日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾蜍它里定、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、沙蟾毒精-3-辛二醇辛酯的含量,通过化学模式识别控制干蟾皮质量。方法:干蟾皮的甲醇提取液的分析采用Waters Acquity UPLC BEH色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),以乙腈-0.5%乙酸为流动相,梯度洗脱,流速为0.2 mL·min^(-1),柱温为30℃,检测波长为296 nm。结果:12批生品和12批炮制品的总含量分别为3.18~4.69 mg·g^(-1)和0.91~2.77 mg·g^(-1),指纹图谱中均有9个共有峰,相似度分别为0.963~0.991和0.692~0.988,主成分分析和聚类分析能很好地识别干蟾皮的生品和炮制品。结论:该方法稳定、可靠,可为干蟾皮的质量控制、炮制工艺,进一步开发研究提供科学依据。

一测多评法测定六神丸中的6个蟾蜍二烯内酯类化合物

目的:建立同时测定六神丸中6个蟾蜍二烯内酯类成分含量的一测多评法(QAMS),并验证其准确性和可行性。方法:采用高效液相色谱法,使用Waters Xbridge C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1 mL·min-1,柱温30℃,检测波长296 nm。以华蟾酥毒基为内参物,建立其与远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基5个成分的相对校正因子(RCF),并进行含量计算,实现一测多评;同时采用外标法(ESM)测定六神丸中蟾酥的6个成分的含量,比较一测多评法计算值与外标法实测值的差异。结果:在一定线性范围内,华蟾酥毒基与远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基的RCF值分别为0.897、0.965、1.023、0.844、0.964,且在不同实验条件下重现性良好(RSD <5.0%),一测多评法测得15批样品中华蟾酥毒基、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基的含量范围分别为2.26~9.27 mg·g-1、0.95~2.06 mg·g-1、1.12~2.50 mg·g-1、1.83~3.48 mg·g-1、1.10~2.81mg·g-1、0.90~3.65 mg·g-1,与外标法实测值无显著性差异。结论:所建立的同时测定六神丸中的6个蟾蜍二烯内酯类化合物的一测多评法准确可靠,可用于六神丸中多个成分的定量分析质量评价。

蟾酥干燥炮制前后化学成分和药效学变化考察

目的考察蟾酥Bufonis venenum鲜浆干燥炮制加工(日晒干燥、50℃真空干燥、50℃鼓风干燥、80℃鼓风干燥、冷冻干燥)前后化学成分及药效变化。方法 HPLC法和TLC法研究蟾酥不同干燥方式炮制前后化学成分的变化,MTT法测试不同炮制干燥品抑制5种不同肿瘤细胞株增殖的效果。结果 5种不同加工炮制方法所得蟾酥,性状有较大差异;化学成分的种类及含量没有明显差异;华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量之和都符合《中国药典》2015年版标准,大于6%;50℃和80℃鼓风干燥所得蟾酥具有比其他干燥方法更强的肿瘤细胞抑制效果。结论日晒及50℃鼓风干燥法所得蟾酥符合《中国药典》要求的外观性状。真空干燥和冷冻干燥虽然颜色不符合《中国药典》的规定,但主要有效成分并未发生较大变化。

HPLC法同时测定不同产地蟾酥中的5种活性成分

目的建立了同时测定蟾酥中活性成分的HPLC方法,并对5个不同产地的药材中5种活性成分进行测定。方法采用HPLC法测定,色谱柱为Hypersil ODS柱(250 mm×4.6 mm,25μm),流动相为醇-水(50∶50),检测波长296 nm,柱温30℃,体积流量1 mL/min,并在此色谱条件下测定不同产地经60%甲醇回流提取的蟾酥样品中活性成分的量。结果各成分的质量浓度和峰面积具有良好的线性关系,且有很好的分离度。日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙毒精、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基平均回收率为99.9%、99.6%、97.9%、96.7%、99.5%,RSD为2.8%、3.2%、1.9%、1.0%、3.4%。不同产地蟾酥样品的HPLC色谱图差别明显,所含成分的种类和质量分数差异较大。结论本方法简便、灵敏度高,具有实用性,可作为蟾酥药材的质量控制方法。

国产蟾酥药材质量综合评价研究

目的综合考察国产蟾酥药材质量。方法用HPLC测定14批蟾酥药材中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵等7种指标成分含量,并考察样品中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵等7种指标成分TLC鉴别和水分、总灰分、酸不溶灰分、醇浸出物等药材常规理化实验项目。结果各样品中均可检测出7种指标成分的色谱峰,蟾酥药材指标成分含量和常规理化实验项目测定结果表明,不同产地蟾酥药材间品质差异较大。结论本实验为蟾酥药材综合质量评价体系的建立提供理论和实验依据。