犬瘟热病毒TN株血凝基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法对分离的TN野毒株H基因进行了扩增 ,并将其克隆到pGEM T载体上 ,进行核苷酸序列测定。结果TN野毒株H基因ORF全长 1 ,81 5bp ,编码 60 4个氨基酸。与GenBank中己报道的 7个CDV毒株相比 ,H基因核苷酸序列的同源性在 92 %～ 99%之间 ,推导的H蛋白氨基酸序列的同源性在 91 %～ 99%之间。TN株H蛋白潜在的N 联糖基化位点为 8个 ,而Onderstepoort弱毒株H蛋白为 4个 ;其中N端第 1 9～ 2 1、 30 9～ 31 1、 5 84～ 5 86位氨基酸所形成的 3个潜在的糖基化位点是野毒株拥有而疫苗株所没有的。预测的TN株和Onderstepoort株H蛋白的疏水性及抗原表位存在一定差异。研究结果提示TN野毒株H蛋白免疫原性可能与弱毒株有较大差别 。

大熊猫犬瘟热病毒附着或血凝蛋白基因的序列分析

首次对犬瘟热病毒 (CDV)大熊猫 (GP)毒株附着或血凝蛋白 (H)基因进行了序列测定并与疫苗株Onderstepoort进行了比较。我们设计合成了 4对引物 ,对GP株进行了RT PCR扩增与测序。H蛋白基因全长为 194 6bp ,开放阅读框架 (ORF)始于 2 1 2 3位的ATG ,终止于 184 2 - 184 4位的TGA ,编码 6 0 7个氨基酸 ,该基因序列已被GenBank收录。将GP毒株与GenBank中疫苗弱毒株Onderstepoort进行比较 ,二者核苷酸序列的同源性为 91.4 % ,推导的氨基酸序列的同源性为 90 .2 % ,GP和Onderstepoort株H蛋白的半胱氨酸残基数目均为 12个且相对位置不变 ;疏水性有一定的变化 ,但推测的穿膜区位置 (约 35 55位氨基酸 )是一致的 ;Onderstepoort株的H蛋白潜在的N 联糖基化位点为 4个 ,GP株H蛋白为 9个 ,糖基化位点的不同可能对GP株H蛋白的抗原性产生影响。

凝血因子V基因Leiden突变和凝血酶原基因G20210A突变与下肢深静脉血栓形成关系的探讨

目的 :探讨凝血因子V基因G16 91A突变 (Leiden突变 )和凝血酶原基因G2 0 2 10A突变与下肢深静脉血栓形成的关系。方法 :采用PCR RFLP技术对 86例下肢深静脉血栓形成患者和 10 0例正常对照的健康人群进行凝血因子V基因G16 91A突变和凝血酶原基因G2 0 2 10A突变检测。结果 :86例下肢深静脉血栓形成患者和 10 0例正常对照组中均未检出凝血因子V基因G16 91A突变和凝血酶原基因G2 0 2 10A突变。结论 :凝血因子V基因G16 91A突变和凝血酶原基因G2 0 2

基于凝血因子IX基因剔除小鼠建立血友病乙转基因动物模型

为在凝血因子IX基因剔除小鼠基础上建立基因组中整合有含特定点突变的人凝血因子IX基因表达载体的转基因小鼠家系 ,为血友病乙的研究提供更接近临床实际的动物模型。利用体外定点突变技术 ,构建含有特定点突变的人凝血因子IX基因表达载体 ,该载体包括由人凝血因子IX编码区及第一内含子构成的人凝血因子IX基因(hFIXml)、4个拷贝的MCK增强子 (MCKe)、鸡 β -肌动蛋白启动子 (bA)及PolyA ,命名为pMe4bAIXml质粒。将其线性化后 ,用显微注射法注射入 817只凝血因子IX基因剔除小鼠受精卵雄原核 ,再将它们分别回输 4 5只假孕受体母鼠的输卵管中 ,共产仔 6 9只 ,存活 6 3只。采用PCR与基因组Southern杂交筛选法鉴定小鼠 ,证实 6只小鼠基因组中整合有含特定点突变的pMe4bAIXml质粒 ,并对 1只小鼠的PCR产物进行测序 。

凝血因子Ⅸ基因剔除小鼠近交系的建立

目的 :建立可稳定遗传、临床症状显著的凝血因子 (F )基因剔除小鼠近交系。 方法 :以 PCR扩增检测小鼠尾组织 DNA,一期法检定小鼠血浆 F 活性和血浆凝血酶原时间 (PT)、白陶土部分凝血活酶时间 (KPTT)值 ;取以上结果为全阳性的小鼠以选优法进行全同胞兄妹交配 ,每代选用第一胎小鼠留种 ,第 8代开始筛选纯合子。 结果 :F8代 F 基因剔除小鼠PCR检测阳性率 92 % ,到 F1 2 代小鼠阳性率达 10 0 % ;F 活性 (2 .4 7± 1.75 ) %较正常小鼠 (14 8.18± 4 6 .98) %明显降低 (P<0 .0 1) ;F 基因剔除小鼠已近交培育到第 12代 ,遗传性状稳定 ,并有自发出血倾向。结论 :成功建立了纯合子 F 基因剔除小鼠近交系 ,该小鼠符合人血友病

活血化瘀中药治疗冠心病血瘀证个案疗效评价及与凝血、血流异常相关基因的相关性

目的探讨冠心病血瘀证与凝血、血流异常相关基因表达的相关性,以初步评价中药活血化瘀的分子疗效。方法严格按照冠心病纳入标准和陈氏血瘀证记分标准,筛选冠心病血瘀证病例。提取白细胞,制备治疗前后自身对照芯片,查询基因功能,获取冠心病血瘀证的凝血、血流相关异常表达基因。结果在选取病例中,冠心病血瘀证背景集中于17条凝血、血流相关异常表达基因,尤其是SPP1、FN1、THBS2等。结论冠心病血瘀证与凝血、血流异常相关基因的相关性可能是活血化瘀中药的重要分子靶点。

重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义

本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义。将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上;利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体;将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N。结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功;通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功。结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等。

腺病毒载体中凝血因子IX基因表达的电镜检测

腺病毒载体中凝血因子ＩＸ基因表达的电镜检测王琪卢大儒邱信芳薛京伦颜永碧郑尊（复旦大学遗传学研究所，上海２００４３３）（第二军医大学中心实验室）人凝血因子ＩＸ基因（ＨｕｍａｎＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＩＸ，ｈＦＩＸ）缺陷可导致遗传性出血性疾病，...

基因重组凝血因子Ⅶa在心脏直视术后严重渗出血患者中的应用

目的观察基因重组凝血因子Ⅶa(rFⅦa)在心脏直视术后严重渗出血患者中的应用效果。方法选择40例心内直视术后连续3h心包纵隔引流量>2mL/(kg.h)的患者,在应用传统止血方法临床效果不明显后,改用rFⅦa(20～40μg/kg)单次静脉注射,观察心包纵隔引流量的变化、监测凝血指标,并记录各种不良反应和(或)并发症。结果40例患者应用rFⅦa后有35例引流量显著减少,与应用前相比引流量由3.54mL/(kg.h)[2.31～10.3mL/(kg.h)]降至0.85mL/(kg.h)[0.45～2.53mL/(kg.h)](P<0.05),5例引流量仍较多,予二次开胸探查发现其中3例为活动性出血;活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)在应用rFⅦa后明显缩短(P<0.05);未见明显不良反应及血栓形成等相关并发症。结论rFⅦa对心内直视术后出现严重渗出血患者具有良好的止血效果,未发现明显不良反应及相关并发症。

人凝血因子ⅦcDNA基因的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定人凝血因子ⅦcDNA基因。方法:采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,从人胎肝总RNA中扩增人凝血因子ⅦcDNA基因,将其克隆入pGEM-T载体,对阳性克隆进行序列测定和分析。结果:经RT-PCR扩增和克隆,获得了人凝血因子ⅦcDNA基因,经序列分析表明,所克隆的基因序列正确。结论:本试验成功克隆了人凝血因子ⅦcDNA基因,为重组人凝血因子Ⅶ的研究奠定了基础。

基因重组凝血因子Ⅶa治疗心内直视手术后弥漫性渗血10例

10例心内直视手术后发生弥漫性渗血的患者应用基因重组凝血因子Ⅶa20～60μg/kg静脉注射，结果9例心包纵隔引流量明显减少，1例心包纵隔引流量减少不明显。显示基因重组凝血因子Ⅶa能有效控制心内直视手术后弥漫性渗血。

重组腺相关病毒介导的人凝血因子IX基因在人/鼠结肠癌上皮细胞中的表达

目的:探讨重组腺相关病毒/人凝血因子IX基因(rAAV-2/hFIX)在人/鼠结肠癌上皮细胞(SW480/C26细胞株)中的表达。方法:重组腺相关病毒/绿色荧光蛋白(rAAV-2/GFP)感染SW480/C26细胞,在荧光显微镜下观察GFP的表达,计算转染率。rAAV-2/hFIX感染SW480/C26细胞,检测hFIX基因、FIXAg量及hFIX活性的表达。结果:SW480细胞株/C26细胞株GFP48hr阳性率分别为(57.0±8.5)%和(48.0±5.7)%;转导组14 d和21 d均可见外源hFIX的cDNA片断。SW480细胞转导了rAAV-2/hFIX后在第2天和第21天ELISA法测hFIX抗原量分别为(98.0±4.3)和(30.9±6.5)ng.106cell-1.24h-1。未转导组为(2.7±0.1)ng.106cell-1.24h-1。C26细胞转导了rAAV-2/hFIX后在第2天测hFIX抗原量为(78±5.12)ng.106cell-1.24h-1。未转导组为(2.9±0.1)ng.106cell-1.24h-1。hFIX活性与hFIX抗原浓度明显相关。较对照组亦显著增高。结论:rAAV-2/GFP能有效地转导SW480/C26细胞。rAAV-2/hFIX能有效地转导SW480/C26细胞并表达具有凝血活性的功能蛋白hFIX。

自身免疫性感音神经性聋患者候选基因--凝血因子C同源物突变筛查

目的通过对22例自身免疫性感音神经性聋(autoimmune sensorineural hearing loss,ASNHL)患者进行凝血因子C同源物基因(coagulation factor C homology,COCH)全序列分析,探索自身免疫性感音神经性聋与COCH突变的相关性。方法应用聚合酶链反应(PCR)产物直接测序方法对22例自身免疫性感音神经性聋患者进行COCH全序列分析。结果在22例自身免疫性感音神经性聋病例中未发现COCH突变和多态。结论初步探索了ASNHL与COCH突变的相关性,未发现COCH突变和多态,还需进一步收集临床病例来证实。

凝血因子Ⅷ基因内二核苷酸重复序列在云南省傣、彝和汉族人群中的多态性研究

研究云南省傣、彝和汉族人凝血因子Ⅷ基因内含子 2 2 (CA)n二核苷酸重复序列的多态性 ,获取高多态信息量的分子遗传标志。应用聚合酶链反应 (PCR)和DNA序列分析技术及聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)对该位点的基因频率及多态信息量进行调查。结果发现 ,傣族和彝族中至少有 (CA)n拷贝数为 2 4 ,2 5和 2 6的 3种等位基因片段 ,两民族中的频率分布分别为 1 2 % -5 7 5 %和 16 .4 3% - 6 3 0 0 % ;汉族人群中至少有 5种等位基因片段 ,(CA)n拷贝数分别为 2 4 ,2 5 ,2 6 ,2 7和 2 8,频率分布在 8 97% - 32 0 0 %。在上述三种民族人群中均未发现FⅧ基因内含子 2 2二核苷酸重复序列的杂合子。本研究的结果提示 ,目前至少可认为该位点不宜作为云南省傣。

凝血因子IX基因剔除小鼠的培育历史与建系方法

目的 培育凝血因子IX基因剔除小鼠近交系。方法 采用全同胞兄妹对交配 ,每代选用第一胎小鼠留种 ,记录繁殖性能 ;第 8代开始筛选纯合子。结果 凝血因子IX基因剔除小鼠已近交培育到第 12代 ,交配年龄 70 - 90d ,平均每窝产仔数 5只以上 ,离乳数 3只以上。

凝血因子Ⅷ基因及其基因突变的研究

本文拟对甲型血友病ＦⅧ基因及其蛋白质结构和功能，ＦⅧ基因突变类型作一综述。

人凝血因子C同源物基因全长cDNA克隆

目的通过克隆凝血因子C同源物基因(Coagulation factor C homology,COCH)全长cDNA,为COCH编码蛋白cochlin的功能研究打下基础。方法从听力正常人新鲜外周静脉血中提取总RNA,应用一步法RT-PCR试剂盒进行COCH反转录,转录产物进行浓缩、酶切、连接。结果反转录COCH cDNA全长与标准基因序列比较,结果完全相符,得到完整的COCH cDNA全长序列。结论本研究成功克隆了COCH cDNA全长序列,为COCH编码蛋白cochlin的功能研究打下了良好的基础。

凝血因子V基因Leiden突变与严重先兆子痫的关系研究

为探讨凝血因子Ｖ基因Ｌｅｉｄｅｎ突变与孕妇严重先兆子痫的关系。方法：采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态分析对３５例严重先兆子痫孕妇及９０例正常对照组孕妇进行等位基因检测。结果：３５例严重先兆子痫患者中有３人，为Ｌｅｉｄｅｎ突变杂合子（８．６％），而正常对照组中的９０人中只有１人为Ｌｅｉｄｅｎ突变杂合子（１．１％），二组间差异显著，ｘ２＝４．８９，Ｐ＜０．０５。结论：因子Ｖ基因Ｌｅｉｄｅｎ突变携带者患严重先兆子痫的风险高于正常组。

凝血因子Ⅶ水平及其基因多态性与PTE的相关研究

目的探讨FⅦ基因R353Q多态性及血浆FⅦa水平与PTE的相关性。方法收集肺血栓栓塞症(PTE)患者198例和对照组212例;采用PCR-PFLP检测FⅦ基因R353Q多态性,ELISA法测定血浆FⅦa水平。结果①FⅦ基因R353Q单核苷酸多态性(SNP)基因分布频率和等位基因携带频率在病例与对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。②血浆FⅦa水平PTE组与对照组比较,差异有显著性意义(P=0.000)。③通过非条件Logistic回归模型校正后,吸烟、纤维蛋白原和血浆FⅦa水平是PTE患者的独立危险因素。结论高血浆FⅦa水平是PTE患者的独立危险因素;FⅦ基因R353Q多态性可能不是PTE患者的独立危险因素。

凝血因子Ⅷ基因倒位在重型血友病A遗传咨询中的意义

血友病A系凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺陷所致的常见遗传性出血性疾病。该类病人及其亲属的遗传咨询——即如何鉴定患者家庭成员中的女性携带者或对胎儿作出产前诊断,仍是临床血液学经常面临的问题。有关血友病A携还者鉴定及产前诊断的研究及应用,近十余年来主要聚焦点在两个方面:①FⅧ基因内或基因附近的限制性片段长度多态性(RFLP)分析及与FⅧ基因相关的衔接重复序列可变数目检测——即基因追踪观测;