长春市2016—2020监测年度甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因特征分析

目的分析长春市2016—2020年度甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因特征,了解其变异情况及遗传进化特征。方法选取2016—2020年度甲型H1N1流感病毒分离株109株,PCR扩增HA基因并进行序列测定;利用生物信息学软件对分离株的HA基因进行进化和变异分析。结果长春市109株分离株与疫苗株A/California/07/2009的HA蛋白相比均有S84N、S162N和I216T共同的氨基酸位点变异,且有1株发生了HA蛋白D222N位点突变,提示此毒株可引起患者下呼吸道症状。109株病毒株的HA基因之间核苷酸同源性为96.9%~100%,氨基酸同源性为97.2%~100%。在进化树分析上,都属于6B.1大分支,并且随着时间的推移,HA在基因进化树上离早期疫苗株A/California/7/2009越来越远,同一年份里也有毒株位于不同的小分支内。结论长春市2016—2020年度甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因在不断的变异中,应持续进行监测,为预防甲型H1N1流感大流行提供参考。

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化

利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。

2014-2015年商洛市流感病毒H3N2亚型血凝素(HA1)基因进化研究

目的分析2014-2015年度商洛市流感监测病毒血凝素(HA)基因变异情况并研究与推荐疫苗的匹配性。方法收集2014-2015年商洛市流感监测平台用狗肾传代细胞(MDCK)培养分离的H3N2亚型毒株,利用RT-PCR方法扩增分离HA片段,进行核苷酸序列测定,应用clustax2.1软件进行序列比对后,用Mega6.0软件构建系统发育进化树,系统进化树采用Neighboring-joining方法进行分析。结果 2014-2015年度分离的流感H3N2毒株同源性在97.2%~99.9%,与推荐疫苗株A/Texas/50/2012同源性为97.3%~98.5%;将分离毒株的HA1基因氨基酸与疫苗株比较,发现2014年毒株主要抗原决定簇氨基酸变异点有B区Y159F、S198P;2015年主要抗原决定簇氨基酸变异点有A区G142R,B区S159F、S198P。结论2014-2015年度商洛市流感H3N2亚型毒株关键抗原决定簇已经出现改变,A/Texas/50/2012作为疫苗组分已经不是最佳,亟需对我国流感H3N2亚型疫苗组分进行更新,应密切关注流感H3N2基因进化趋势。

H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9中的表达与纯化

【目的】真核表达H7亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA蛋白,为进一步制备H7亚型HIV亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9,Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成H7亚型AIV的HA序列,将其克隆至穿梭质粒pFastBac1中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9中,通过间接免疫荧光和Westernblots试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过SYBRgreen染料法荧光定量PCR试验,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法,筛选出在Sf9中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白。【结果】表达H7亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9盲传3代后,Sf9开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和Western blots试验发现,Sf9内出现可与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的HA重组蛋白条带大小约70 kD左右,与预期相符,且HA重组蛋白可与H7亚型AIV阳性血清反应,表明HA重组蛋白表达成功;以构建的pUC19-gp64质粒为标准,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR检测方法,该方法在1×103~1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数R2=0.993;利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过Western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以10MOI的比例接种Sf9,孵育72h,蛋白表达效果最好;通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白,蛋白浓度为0.268mg/mL,鸡红细胞凝集效价为4log2。【结论】本试验在Sf9中成功表达并纯化H7亚型AIVHA蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法,可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供参考。

乳胶凝集试验检测H5亚型禽流感病毒血凝素抗体的研究

利用原核表达并经过纯化的H5亚型禽流感病毒的血凝素蛋白做为抗原,经碳二亚胺(EDAC)将表达产物和羧基化的乳胶共价偶联,并对偶联乳胶的蛋白量和偶联时间进行合理选择,建立H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白乳胶凝集试验的方法。临床检测H5亚型禽流感病毒实验免疫鸡血清126份,同血凝抑制试验相比,其敏感性为87.03%,特异性为88.8%,两者的符合率为87.30%。结果证明建立的方法可用于H5亚型禽流感抗体水平监测和流行病学调查。

广东地区人禽流感H_5N_1血凝素基因特征与进化

目的通过对广东地区人禽流感H5N1毒株（HA）基因序列的变异分析，揭示毒株HA基因变异与进化。方法对广东地区人禽流感H5N1毒株（A／GD／01／06）HA基因测序，同时检索全球各地人禽流感H5N1毒株HA基因，采用SPSS11．0和DNAStar5．0软件对检索的人禽流感H5N1毒株HA基因核苷酸序列进行聚类、比对和分析；并结合临床资料对变异毒株进行进化速度分析。结果1997～2006年，42毒株HA基因序列聚类分成3类；HA基因89氨基酸位点置换，占15．7％（89／568）；2003～2006年H5N1，毒株通过氨基酸第170～172位（NST／S）位点的置换，增加一个糖基化位点。同义变异中，HA基因Ks为1．99×10^-5～2．58×10^-5,生物进化线性回归方程为Y=4．8×10^-9X＋1．048×10^-5；同时各毒株Ks均大于Ka，进化检验Ks／Ka值显示HA基因进化压力主要来自自然变异。42株地N1毒株可以分3条进化途径，1997-1998年毒株为1条，2003～2005年东南亚毒株为第2条途径，2005～2006年中国毒株为第3条途径。毒株HK-213-03氨基酸变异显示其变异的进化过度性，而2004年毒株TL—L2004—04氨基酸位点变异值得注意。结论2003--2006年人禽流感H5N1毒株HA基因抗原性与1997年毒株有较大不同，人禽流感H5N1，毒株增加一个糖蛋白位点可能改变毒株致病性；少数毒株氨基酸位点变异较大，值得关注。人禽流感H5N1毒株在自然界变异频繁，但受到鸟禽和人体的免疫压力较小；但随着H5N1，毒株自然进化，H5N1，毒株具有人一人传播能力的概率较大。建议在研制人禽流感H5N1毒株疫苗时，要充分考虑不同毒株HA基因抗原性。

2005～2006年流感季节河北省甲3亚型流感病毒血凝素重链区基因变异分析

目的：研究2005～2006年流感流行期河北省分离的甲3（H3N2）亚型流感病毒株血凝素重链（HA1）的基因特性,了解H3N2亚型流感病毒株HA1基因的变异及其与流感流行的关系。方法：用狗肾（MDCK）细胞分离培养流感病毒,提取病毒核糖核酸（RNA）,采用RT-PCR法扩增病毒HA1基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件作分析处理。结果：2005～2006年流感流行期在河北省分离到的H3N2亚型流感病毒株HA1与同时期的H3N2亚型流感疫苗株A/Calfornia/7/04相比其抗原性变异不大,核苷酸同源性为96.2%～98.2%,氨基酸同源性为98.7%～99.0%,3个位点发生了氨基酸替换,其中2个在抗原决定簇B区（188N〉D、193S〉F）,1个在受体结合位点（225D〉N）。结论：H3N2亚型流感病毒HA1尚未发生明显变异,与疫苗株同源性较高。人群对其已建立起较好的免疫屏障,这是河北省该流行期H3N2亚型活动水平低的主要原因。

高致病性禽流感H5N1血凝素蛋白表达及活性测定

通过PCR扩增高致病性禽流感H5N1的HA和HA1基因片段,利用原核表达系统表达重组HA和HA1蛋白,并用SDS-PAGE,Western-blotting和血凝试验进行重组HA蛋白的鉴定和血凝活性鉴定.结果表明,经过HA蛋白胞外段分析、重组载体的酶切鉴定得出的重组HA蛋白,在血凝试验中能与HA特异性抗体结合,并有较高的血凝活性.利用表达载体pET42a表达AIV-H5亚型的HA基因,为进一步利用重组蛋白研制AIV-H5抗体的ELISA检测方法,研制抗AIV-H5亚型的单克隆抗体提供基础.

2株云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因序列分析

在2019年1月-2019年6月对云南出现呼吸道疫病的57个鸡场进行H9亚型禽流感检测的基础上,选取石林和楚雄2个H9亚型禽流感阳性样品进行病毒分离。从分离的H9N2亚型禽流感病毒感染鸡胚尿囊液中提取总RNA,采用特异性引物经反转录PCR分别扩增HA和NA基因,PCR产物纯化后进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,云南2株H9N2毒株HA基因核苷酸序列同源性为94.2%,NA基因核苷酸序列同源性为93.6%,系统进化分析表明云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因均属于欧亚谱系中的类ADKHKY28097分支(Y280-like),ACKYN12019和ACKYN72019 HA基因之间的同源性为94.3%,与参考毒株ACKJX2448的同源性最高,为95.6%~98.5%,与中国流行的H9N2代表株和疫苗株同源性较低。HA蛋白333-340位裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有低致病性禽流感病毒分子特征,受体结合位点均发生E198T和Q234L的突变,具有人样受体结合特征,在29、141、298、305、313、492位氨基酸有6个糖基化位点。ACKYN12019和ACKYN72019 NA基因同源性为93.6%,与Y280-like代表毒株的同源性分别为97.1%~97.5%和93.7%~94.6%,NA蛋白缺失63、64、65位氨基酸,在44、69、86、146、200、234位氨基酸处存在6个潜在的糖基化位点,NA蛋白红细胞结合(HB)位点分析发现,368-369、399-403、432位氨基酸处存在变异。研究结果显示,H9N2亚型禽流感病毒一直处于不断的变异之中,故应加强其监测与防控。

基于血凝素裂解位点的DNA条形码在A型流感病毒分型中的应用

为了建立一种快速鉴别AIV的HA亚型的RT-PCR方法,本研究探讨了流感病毒血凝素裂解位点基因作为DNA条形码对A型流感病毒进行亚型鉴定的可行性。通过生物信息学方法对16种A型流感病毒的血凝素基因全长进行比对,在HA裂解位点的两端高度保守区设计一对DNA条形码引物,RT-PCR扩增获得约170bp的核苷酸片段。利用MEGA5.0软件构建N-J系统树并计算亚型间及亚型内平均遗传距离。结果显示,不同A型流感病毒裂解位点氨基酸具有单系性,每一亚型可分别形成各自独立的分支。不同亚型间平均遗传距离为0.277,相同亚型内平均遗传距离0.032。研究表明,利用DNA条形码技术可在A型流感病毒分型方面进行有效的分子分类鉴定。

中国H5N1禽流感病毒HA基因的分子进化分析

为了阐明中国H5N1禽流感病毒血凝素(HA)基因的分子进化规律,从GenBank下载中国近年来分离的27株禽流感H5N1病毒的HA基因,利用LaserGene软件包中的EditSeq程序剪切共同序列并翻译成氨基酸序列,与DNAMAN软件进行比对,并以LaserGene软件包中的MegAlign程序构建分子进化树,结合背景资料分析其传播流行规律。结果显示:①在HA裂解位点上游毗邻的位置,gdch04、gddu04、gxch0405、gxdu05、gxqu0502、hkcph05、stch05、stqu05、ynch0502株都缺失了三个碱基;②27株毒株在HA裂解位点上游毗邻的位置存在多个连续的碱性氨基酸;③来自广西的gxch0405、gxdu05、gxqu0502和来自香港的hkcph05、hkgh04的序列同源性很高,很可能与苍鹭的迁移有关;④来自广西的gxqu0502和来自香港的hkcph05亲源关系很近,很可能来自同一祖先。

HA基因真核表达载体构建及在293T细胞中的表达

目的:为后续进一步研究H1N1病毒DNA疫苗对小鼠免疫系统的影响提供技术支撑。方法:应用PCR方法体外扩增血凝素(HA)基因全序列,并利用pcDNA3.1(+)载体构建甲型流感病毒(H1N1)血凝素(HA)的真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-HA),经双酶切鉴定后,转染293T细胞,通过RT-PCR和Western blot方法观察该重组质粒在293T细胞中的表达情况。结果表明,pcDNA3.1(+)-HA重组质粒构建成功;与空白及阴性对照相比,转染293T细胞48 h后的HA mRNA水平显著上升(2.4×10^(3),P<0.0001),并能在293T细胞中成功表达,为深入研究H1N1病毒DNA疫苗对小鼠免疫系统的影响奠定了基础。

H1N1流感病毒HA蛋白疫苗构建策略的筛选

目的筛选并确立流感病毒H1N1 A/Nebraska/14/2019血凝素(HA)的最佳蛋白疫苗策略。方法分别构建HA全长、HA胞外区C端不同的突变体及共表达HA/M1的重组杆状病毒,感染昆虫细胞表达80 h后,收取培养上清,Western blot鉴定重组抗原的表达,同时采用血凝试验间接分析其免疫原性。然后大量表达HA/M1蛋白,Core700纯化后分析蛋白颗粒的理化性质、血凝活性及稳定性。结果2种HA胞外区的C端突变体虽均以三聚体形式表达,但表达上清无血凝活性;HA全长三聚体具有较好的血凝活性,但为膜蛋白,纯化难度大。HA/M1共表达上清具有血凝活性,HA/M1表达上清经Core700纯化,透射电子显微镜分析显示为80 nm~150 nm病毒样颗粒(VLP)。HA-M1-VLP的血凝效价高达26,动态光散射显示HA-M1-VLP在4℃保存3个月性质稳定。结论HA-M1-VLP易于表达纯化、稳定性好,且血凝活性高,可用于流感病毒H1N1蛋白疫苗的研究。

表达量高、血凝活性好的H3N2流感病毒血凝素(HA)蛋白疫苗的筛选研究

目的:筛选表达量高、血凝活性好的H3N2流感病毒血凝素(HA)重组蛋白。方法:以A/MINNESOTA/41/2019(H3N2)毒株的HA为基础,将HA胞外区N端融合GP67信号肽,C端融合三聚化基序,分别构建HA胞外区全长及近膜区截短2个氨基酸的HA重组杆状病毒,并构建相应的不含三聚化基序的HA重组杆状病毒;经昆虫细胞表达,Western blot鉴定,亲和层析纯化后分析重组蛋白的血凝效价及稳定性。结果:四种HA重组蛋白均获得有效表达,其中HA胞外区全长融合三聚化基序的重组蛋白(HA-T)表达水平最高,经Strep tag亲和层析获得高度纯化,产量高达30 mg/L,Ethylene glycolbis交联分析显示为稳定的HA三聚体形式,血凝活性分析显示HA-T的活性最高,血凝效价为29,动态光散射显示HA-T在4℃放置3个月性质稳定。结论:HA-T表达量高、稳定性好、血凝活性高且易于纯化,研究结果为流感重组蛋白疫苗的研发策略提供了参考。

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立

【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒(AIV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素(HA)基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂(Calcein/MnCl2混合液),然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIVRT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。

禽流感病毒A／Chicken／Jiangsu／JS-1／2002(H9N2)分子鉴定与起源分析

运用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒A／Chicken／Jiangsu／JS-1/2002(H9N2)完整的血凝素 (HA)基因,并克隆到pGEM-T载体中,进一步进行了序列测定。序列测定结果已经登陆 GenBank,登陆号为AY364228。所扩增的HA基因长度为1683核苷酸,共编码560个氨基酸,其中 信号肽长度为18aa,HA1为319aa,HA2为223aa。HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为RSSR↓GLF, 不舍连续的碱性氨基酸,具有低致病性AⅣ HA基因裂解位点的序列特征。通过构建一个包含 18株H9N2亚型AIV的HA基因遗传进化树,发现所有的18个毒株共可分为欧亚谱系和北美谱 系两个谱系,而本分离株在分类地位上国内另外的三个分离株同属于欧亚谱系,在遗传进化上非 常接近,表明它们可能具有共同的起源。

禽流感病毒的致病性研究进展

禽流感严重威胁人类健康和生命安全,危害养禽业,造成巨大经济损失,而且目前出现了多种亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)共存的局面。疫苗接种仍是当前预防禽流感的重要手段。单一亚型的HA、NA抗原甚至不能对相同亚型的毒株产生很好的免疫保护作用。因此,研究和开发广谱、高效、毒力低的多价疫苗(Polyvalent Vac-cine)是禽流感疫苗发展的方向。然而随着病毒的毒力逐年增强及抗原的频繁变异,在疫苗株的选育上显得愈加艰难;又由于多价疫苗的相互干扰作用,会造成免疫原性降低或毒力增强等。因此,研制广谱、高效、低毒的疫苗一直是困扰人们的一个难题。其中,DNA疫苗被认为是防制禽流感最具潜力的基因工程疫苗之一。

共表达H5N1流感病毒M1和HA基因的DNA疫苗与腺病毒载体疫苗的小鼠免疫评价(英文)

为评价在小鼠体内表达流感病毒M1和HA基因诱导的免疫反应,制备共表达H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)全长基质蛋白1(M1)基因和血凝素(HA)基因的重组DNA疫苗pStar-M1/HA和重组腺病毒载体疫苗Ad-M1/HA,将其按初免-加强程序免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集小鼠血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集小鼠脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制(HI)实验和ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒特异性IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M1和HA的特异性细胞免疫应答。共表达H5N1流感病毒M1和HA基因的DNA疫苗与腺病毒载体疫苗在小鼠体内的免疫学评价,为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。

2017年云南省乙型流感病毒监测结果及其血凝素基因特征分析

2017~2018年间,流感病毒在我国流行态势严重,以Yamagata(By)谱系为主的乙型流感病毒(Influenza B virus,IBV)与甲型H1N1和H3N2亚型在我国区域流行。为了解2017年云南省IBV的监测结果及其流感病毒的血凝素(Hemagglutinin,HA)基因分子特征,本研究对2017年云南省流感监测哨点医院采集的21 672份标本使用real-time RT-PCR方法检测流感病毒,核酸阳性标本使用MDCK细胞进行病毒分离,并采用HA凝集试验及抑制试验进行病毒鉴定。随机选取24株IBV毒株进行高通量测序,使用MEGA软件分析其HA基因特征。云南省2017年哨点医院监测和暴发疫情监测资料均显示IBV已成为流感流行的优势株之一,由IBV Victoria(Bv)谱系引起9起暴发疫情(42.86%),而由By系引起4起暴发疫情(19.05%)。IBV HA基因无明显变异,提示今年疫苗株可起到很好的保护效果。本研究结果提示,今后云南省需要继续加强监测力度,提高监测敏感性并做到及时预警,从而控制流感流行风险。