鸡新城疫病毒F48E9株血凝素神经氨酸酶基因免疫诱导免疫保护的初步研究

将我国新城疫病毒标准强毒F4 8E9株的血凝素 神经氨酸酶基因克隆于真核表达载体 pcDNA3 中 ,进行鉴定后筛选阳性质粒。将此阳性质粒进行大量法提取并纯化后作为基因疫苗以每只鸡 10 0 μg的剂量肌肉接种 4 5日龄SPF鸡 ,并以 pcDNA3 空质粒作为对照。结果表明 ,新城疫基因疫苗能够诱导机体产生新城疫病毒特异的血清IgG抗体反应 ,但产生抗体所需的时间较长 ,抗体滴度的增加较为缓慢。人工接种新城疫强毒后 ,基因疫苗免疫组 4 / 6的鸡得到保护 ,而且保护鸡具有明显的抗体反应 ,2只鸡未得到保护 ,但其死亡时间明显迟于对照组鸡 ,死亡鸡具有典型的新城疫病毒感染鸡的病理形态学变化。

表达新城疫病毒血凝素神经氨酸酶（HN）基因重组鸭肠炎病毒的构建

目的 构建表达新城疫病毒血凝素神经氨酸酶（HN）基因的重组鸭肠炎病毒（DEV）.方法 利用同源重组技术,在DEV Clone-03基因组中胸苷激酶（TK）基因内部插入新城疫病毒HN基因.以本实验室已构建的rDEV TK-EGFP株为亲本病毒,将病毒基因组与转移载体共转染及蚀斑纯化,获得表达新城疫病毒HN基因的重组鸭肠炎病毒.结果 重组病毒经基因水平和蛋白水平的鉴定,证明新城疫病毒HN基因正确插入DEV基因组内部且有效表达;复制动力学和遗传稳定性检测,证明重组病毒rDEV TK-HN滴度略有下降,但复制趋势与亲本病毒一致;在鸡胚成纤维细胞（CEF）和SPF鸡胚连续传代20代,表明HN基因随病毒传代而稳定遗传、表达.结论 利用同源重组技术,对鸭肠炎病毒基因组进行修饰,构建了TK基因缺失表达新城疫病毒HN基因的重组鸭肠炎病毒,该病毒能够携带HN基因稳定遗传和表达.

从噬菌体随机十二肽库中筛选新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶模拟表位

以生物素标记的抗新城疫病毒(NDV)血凝素＿神经氨酸酶(HN)的单抗M22为分子探针,从噬菌体随机12肽库中筛选鉴定该抗体所识别的抗原模拟表位。经过三轮亲和筛选,得到了四个能与单抗M22反应的阳性噬菌体单克隆,分别为CLONE11、17、18、20。竞争ELISA试验表明,CLONE20与M22的结合能被新城疫弱毒株LaSota特异性抑制,抑制率达67 3%。经测序,获得CLONE20的插入序列为SWFHHHQARAPM,同源性分析认为WF和QAR在HN的抗原性中起重要作用。动物试验结果表明,CLONE20能诱导SPF鸡产生一定水平的具有血凝抑制活性的特异抗体。以上结果显示SWFHHHQARAPM是具有免疫原性的HN抗原模拟表位。

鸭新城疫病毒河北分离株血凝素-神经氨酸酶蛋白基因序列分析

为研究新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的遗传变异特性,对NDV HB/1/05/Dk株的血凝素-神经氨酸酶（haemagglutinin-neuraminidase protein,HN）蛋白基因进行了扩增、测序和遗传进化分析。结果表明：该病毒的HN基因长2 002bp,含有1个长为1 716bp的完整开放阅读框架（Open reading frame,ORF）,编码571个氨基酸,符合强毒株的特征。同源性分析表明,该毒株的HN基因与35株参考毒株间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为71.8%-99.1%和83.4%-98.9%。遗传进化分析表明,该毒株与基因VIId亚型参考毒株关系较近,属同一分支,与疫苗株B1、LaSota、Mukteswar株和I类毒株关系较远。因此,须加强河北省水禽NDV的监测。

新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测

目的检测新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性。方法采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出最佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性。结果成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是最多的。经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性。结论融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。

脾脏酪氨酸激酶和核因子-κB对新城疫病毒-血凝素-神经氨酸酶上调自然杀伤细胞TRAIL蛋白表达的影响

目的探讨脾脏酪氨酸激酶(Syk)和核因子-κB(NF-κB)对新城疫病毒(NDV)-血凝素-神经氨酸酶(HN)上调自然杀伤(NK)细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白表达的影响。方法将干扰素γ(IFN-γ)受体缺失的NK细胞株(IFNR-/-NK)分为小干扰RNA(siRNA)-Syk1组、siRNA-Syk2组、siRNA-Syk3组、siRNA-p65-1组、siRNA-p65-2组、siRNA-p65-3组、未处理组、脂质体组、siRNA-NC组,未处理组加入磷酸缓冲盐溶液(PBS),脂质体组加入由脂质体3000和Opti-MEM培养基组成的转染复合物,siRNA-NC组加入含非特异性siRNA的转染复合物,其他组加入含相应siRNA的转染复合物。(1)转染36h后,检测各组细胞Syk和(或)p65的mRNA及蛋白的表达水平。(2)转染16h后,将细胞分为siRNA-Syk1+HN组、siRNA-Syk2+HN组、siRNA-Syk3+HN组、siRNA-p65-1+HN组、siRNA-p65-2+HN组、siRNA-p65-3+HN组、脂质体+HN组和siRNA-NC+HN组、未处理组,未处理组细胞加入PBS,其余各组细胞加入NDV-HN。检测各组细胞膜型及分泌型TRAIL蛋白的表达水平,并检测siRNA-Syk1+HN组、siRNA-Syk2+HN组、siRNA-Syk3+HN组、脂质体+HN组、siRNA-NC+HN组和未处理组磷酸化IκBα蛋白的表达水平。结果(1)瞬时转染36h后,与脂质体组比较,siRNA-Syk1、siRNA-Syk2、siRNA-Syk3组的SykmRNA及蛋白表达水平降低,siRNA-p65-1组、siRNA-p65-2组、siRNA-p65-3组p65mRNA及蛋白表达水平亦降低(均P<0.05)。(2)未处理组的膜型TRAIL蛋白及分泌型TRAIL蛋白表达水平均低于其他组,siRNA-Syk1+HN组、siRNA-Syk2+HN组、siRNA-Syk3+HN组及siRNA-p65-1+HN组、siRNA-p65-2+HN组、siRNA-p65-3+HN组的膜型TRAIL蛋白及分泌型TRAIL蛋白表达水平均低于脂质体+HN组(均P<0.05)。未处理组磷酸化IκBα蛋白表达水平均低于其他组,siRNA-Syk1+HN组、siRNA-Syk2+HN组、siRNA-Syk3+HN组磷酸化IκBα蛋白表达水平均低于脂质体+HN组(均P<0.05)。结论敲低Syk或p65可以削弱NDV-HN上调NK细胞TRAIL蛋白的表达。Syk和NF-κB信号通路可能介导NDV-HN直接活化NK细胞表达TRAIL的过程。

A型流感病毒神经氨酸酶蛋白功能研究进展

A型流感病毒(IAV)的宿主谱广泛,对人类健康和畜禽养殖均构成严重威胁。神经氨酸酶(neuraminidase,NA)作为IAV囊膜表面主要的糖蛋白之一,在病毒的感染过程中至关重要,是常用的抗病毒药物作用靶点。以往关于NA蛋白的研究主要聚焦于其通过切割宿主细胞表面唾液酸与血凝素(hemagglutinin,HA)之间的α-2,6或α-2,3糖苷键以促进新生病毒粒子释放的功能方面,而近来不断有证据表明,神经氨酸酶蛋白在受体结合和宿主适应性方面同样发挥关键作用。论文综述了神经氨酸酶蛋白的结构特征,并对神经氨酸酶蛋白的酶催化活性、受体结合功能以及与HA蛋白的功能平衡方面进行了总结,以期为深入理解IAV感染的分子机制提供参考。

表达鸡新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因的重组腺病毒对肝癌细胞HepG-2的抑制作用

目的探讨表达鸡新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的重组腺病毒Ad-HN对人肝癌细胞HepG-2的抑制作用。方法应用Ad-HN感染HepG-2细胞,采用MTT法检测Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制作用;AnnexinV染色法结合流式细胞仪检测细胞凋亡;AO/EB染色法和DAPI染色法对Ad-HN感染的肿瘤细胞及细胞核进行形态学观察;底物显色法检测Caspase1、Caspase3、Caspase6和Caspase8活性的变化。结果Ad-HN能够有效抑制HepG-2细胞的增殖,当感染剂量为100MOI,作用时间为48h时,Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制率达峰值(17.20%～35.04%);AnnexinV染色结果显示,Ad-HN感染48h后HepG-2细胞凋亡率为29.39%;Ad-HN感染导致HepG-2细胞呈现细胞浓缩、细胞核皱缩进而碎裂等凋亡特征;Ad-HN感染可显著上调HepG-2细胞的Caspase酶活性。结论Ad-HN能够诱导HepG-2细胞凋亡,并对HepG-2细胞产生抑制效应。

河南省急性呼吸道感染病例人副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶基因特征分析

目的了解河南省急性呼吸道感染(ARI)病例中人副流感病毒3型(HPIV3)血凝素-神经氨酸酶(HN)的基因特征。方法对河南省漯河市采集的严重急性呼吸道感染(SARI)病例标本和郑州市采集的流感样病例(ILI)标本进行人副流感病毒(HPIVs)核酸检测, HPIV3检测阳性标本使用RT-PCR法进行HN基因扩增并测序, 使用CExpress以及MEGA7.0软件进行序列编辑、进化树构建和基因特征分析。结果漯河市和郑州市共采集ARI咽拭子标本374份, 其中HPIV3核酸检测阳性标本20份(5.3%), 对阳性标本进行靶基因扩增后获得18条序列, 经分析全部为C3亚群, 其中有16条序列为C3f基因型, 有2条序列为C3a基因型。18株HPIV3的HN基因序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.6%~100.0%和99.3%~100.0%, 与原株型Wash/47885/57相比差异较大, 发生了12处共同的氨基酸突变, 其中H295Y、I391V、D556N和I53T是功能相关突变位点。与流行株China/BCH4210A/2014相比同源性较高, 未发生共同的氨基酸突变, 未发现新的功能相关突变位点。结论河南省近年流行的HPIV3为C3亚型的C3f和C3a分支, 可能建立了本土循环流行。应对HPIV3的C3亚型进行持续深入的监测, 为防控HPIV3相关疾病提供科学依据。

牛副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白在杆状病毒中的表达

目的在杆状病毒中表达牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type-3,BPIV-3)血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase,HN)。方法提取BPIV-3 BN-1株RNA,设计特异性引物扩增HN全长ORF,将其克隆至杆状病毒供体载体p Fast Bac HTA中,获得重组供体质粒p Fast Bac-HN。将p Fast Bac-HN转化至感受态细胞E.coli DH10Bac,制备穿梭质粒Bacmid-HN。将纯化的Bacmid-HN经脂质体转染至Sf21昆虫细胞,拯救重组杆状病毒,并进行Western blot鉴定。结果经PCR及测序鉴定证明,HN基因重组供体质粒p Fast Bac-HN及穿梭质粒Bacmid-HN构建正确。利用Sf21昆虫细胞成功拯救重组杆状病毒,连续传代扩增3代的病毒滴度为2×108 CPE/ml。重组HN蛋白的相对分子质量约70 000,可与BPIV-3阳性血清发生特异性反应。结论在杆状病毒表达系统中成功表达了BPIV-3重组HN蛋白,为BPIV-3的诊断及疫苗效力评价奠定了基础。

青岛市急性呼吸道感染儿童中人副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶基因特征分析

探讨山东省青岛市地区急性呼吸道感染患儿人副流感病毒3型(HPIV-3)的感染情况,并分析HPIV-3血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)基因特征。本研究为横断面研究,青岛市妇女儿童医院、青岛大学附属医院西海岸院区及崂山院区在2018年1月至2019年12月期间,每月随机采集急性呼吸道感染(ARTI)儿科患者的咽拭子样本,总共1674份,采用多重实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,筛查HPIV-3阳性样本。采用巢式PCR方法扩增HPIV-3阳性样本HN全长基因并进行序列测定,序列结果与GenBank中HPIV-3的代表株进行对比分析,建立系统进化树。结果显示,1674份咽拭子样本中,HPIV-3阳性有90份,检出率为5.37%,其中,6岁以下儿童占97.78%(88份)。HPIV-3阳性病例主要分布在春季和夏季。通过巢式PCR方法扩增得到44株HPIV-3 HN基因全长序列,序列比对及进化分析表明,HPIV-3 HN基因属于C3基因亚型的C3a和C3b分支,其中,C3a亚型有30株,C3b亚型有14株。44株青岛分离株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.0%~100.0%和98.5%~100.0%。综上,2018至2019年间,HPIV-3 C3基因型的C3a和C3b分支在山东省青岛市地区循环流行,其HN基因型变异较小,进化上具有一定的地域特征。

重组NDV HN基因乳酸菌穿梭表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

为构建新城疫病毒乳酸菌穿梭表达载体,采用RT-PCR方法从新城疫病毒中扩增了HN基因,将其克隆到pMD18-T Simple Vector中。经测序鉴定正确后,定向克隆至乳酸菌表达载体pW425et中,并转化入表达宿主菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blotting检测重组菌在大肠杆菌中的表达情况。结果表明:NDVHN基因与表达载体pW425et正确重组,且该重组菌传50代次以上,重组质粒依然稳定。SDS-PAGE显示表达出约63 kD的条带,与已知表达的HN蛋白大小相符。Western blotting进一步证实该蛋白能被NDV阳性抗体所识别,具有反应原性。表明构建了重组NDVHN基因乳酸菌穿梭表达载体。

新城疫病毒HN抗肿瘤机制研究进展

论述了HN抗肿瘤作用的机制,并对其发展前景作了展望。

新城疫病毒HN基因在毕赤酵母中的表达及其表达产物的免疫原性

应用RT-PCR获得新城疫病毒(NDV)La Sota株的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因片段,将HN基因片段定向插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,构建了分泌型表达载体pPICZαA-HN,将其用SacⅠ线性化后电转化入P. pastorisX-33。经高抗性及阳性转化子筛选得到重组菌株X-33/pPICZαA-HN,甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE、Western-blot和血凝活性检测,结果约在97 ku处有目的条带,比预期分子质量大,占总蛋白的53%,与NDV阳性血清发生特异性免疫反应,并具有较高的血凝活性。表明,HN基因在毕赤酵母中成功地进行了表达且表达产物具有良好的免疫原性。

新城疫病毒HN糖蛋白促细胞融合区域内保守氨基酸基因突变分析

目的确定新城疫病毒（NDV）血凝素神经氨酸酶（HN）糖蛋白促细胞融合区域内的保守氨基酸功能，探讨HN糖蛋白的促细胞融合机制。方法采用PCR定点突变与体内同源重组相结合的方法将HN糖蛋白促细胞融合区域内6个保守氨基酸突变为丙氨酸（A），在BHK21细胞内表达后，流式细胞仪定量分析蛋白的表达效率，并分别检测其促细胞融合活性、血细胞吸附能力（也称为受体识别活性）和神经氨酸酶活性。结果L74A蛋白表达效率降低为72．7％，各突变株蛋白表达效率与野毒株相比差别无统计学意义（P〈0．05）。各突变株蛋白促细胞融合活性都有不同程度的下降，其中1103A下降幅度最大，为野毒株的9．1％，各突变株蛋白血细胞吸附能力也都出现不同程度的降低，其中1103A的下降最明显，为28．2％，各突变株蛋白的神经氨酸酶活性变化程度不同，其中L74A略有升高，为118．6％，L110A下降幅度最大，为5．2％，1103A仅次于L110A，为5．7％。结论新城疫病毒HN糖蛋白促细胞融合区域内的保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用，第103位异亮氨酸（Ⅰ）是此区域内的关键氨基酸。

新城疫病毒HN蛋白膜外区的纯化

血凝素神经氨酸酶(HN)是新城疫病毒(NDV)囊膜表面的糖蛋白之一,其在病毒表面的含量非常丰富,影响NDV的很多生物学特性,如热稳定性等。利用TritonX-100破坏病毒囊膜结构,分离囊膜糖蛋白,最后通过蛋白酶酶切和高速离心的方法获得了较为纯净的HN蛋白胞外区的蛋白样品,建立了从NDV粒子上纯化HN蛋白胞外区的方法。利用该方法获得的HN蛋白样品可以保持天然蛋白的结构、化学修饰和功能,能够更好地用于研究HN蛋白结构功能和生物学特性的形成机制,为新城疫病毒的基础研究、新城疫病毒载体改良应用和新城疫疫苗的研发奠定了基础。

禽分枝杆菌副结核亚种hsp65与鹅副黏病毒HN融合基因真核表达载体的构建与表达

为探索禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的热休克蛋白65(hsp65)对鹅副黏病毒(GPMV)血凝素神经氨酸酶(HN)的分子佐剂作用及构建GPMV DNA疫苗,针对GPMV的HN基因和MAP的hsp65基因设计引物,PCR克隆扩增两个基因,分别将二者先后与真核表达载体pVAX1连接,构建了pVAX1-HN、pVAX1-hsp65-HN,并通过PCR、酶切和序列鉴定所获重组质粒;应用脂质体法将其转染至Marc-145细胞,RT-PCR和间接免疫荧光试验证实hsp65和HN在Marc-145细胞中获得了表达。本研究为制备新型GPMV DNA疫苗及探索hsp65在DNA疫苗中的应用奠定了基础。

一株鸭源新城疫病毒毒力基因分析及其对鸭的致病性研究

为了解中国鸭源新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的毒力特点,从2009年广东地区发病鸭群中分离和鉴定出1株新城疫病毒（简称NDV-104）,对其生物学特性、致病性和融合蛋白（fusion,F）、血凝素神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase,HN）基因进行了研究。结果显示,分离株的MDT、ICPI和IVPI分别为56.4 h、1.95和1.64,结合F蛋白裂解位点（112~117位）的氨基酸序列分析,确定了分离株为新城疫强毒。致病性结果表明,分离病毒对雏鸭具有感染性和致病性。F基因遗传进化结果显示,分离株属于基因Ⅶd亚型。F、HN蛋白的氨基酸同源性结果表明,分离株与2000年以来国内外分离到的基因Ⅶ型NDV同源性较高,分别为96.6%~99.3%和97.0%~99.7%,而其与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和LaSota的F、HN蛋白氨基酸序列的同源性较低,且与LaSota株和V4株的同源性最低,分别仅为88.1%和87.6%,说明分离株与经典新城疫病毒毒株存在一定的差异。

新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达

以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板,设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增,获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段,BamHⅠ/HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c,获得重组质粒分别命名为pET32c-HNa、pET32c-HNb和pET32c-HNa-L-b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析。结果表明,HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。

抗新城疫病毒HN蛋白单链抗体的原核表达及其功能鉴定

为制备抗鸡新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)单链抗体(scFv)并鉴定其生物学功能,本研究提取抗NDV HN单克隆抗体杂交瘤细胞株总RNA,通过RT-PCR扩增抗HN蛋白抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码序列,将其插入含有Linker序列的载体pET-scIG中,构建抗HN的scFv(HN-scFv)原核表达重组质粒pET-HN-scFv并在大肠杆菌中诱导表达。结果显示HN-scFv主要以包涵体形式存在。将包涵体进行复性和Ni-NTA层析柱纯化后用于流式细胞仪检测,结果显示复性纯化后的HN-scFv能够识别表达于293T细胞表面的NDV HN蛋白。该scFv的制备为进一步对该抗体进行改造奠定了基础。