人禽流感H5N1病毒HA1蛋白抗原表位及主要免疫功能区特征的研究

目的确定人禽流感H5N1病毒HA1蛋白的单克隆抗体(McAb)抗识别表位及主要免疫功能区。方法将16条人禽流感H5N1病毒HA1基因重叠片段克隆入真核表达载体pDisplay,构建表达HA1蛋白的重叠肽段重组质粒,转染HeLa细胞后制备细胞抗原片。利用灭活的H5N1病毒免疫BALB/c小鼠,制备病毒特异单克隆抗体(单抗)和多克隆抗体(多抗),采用间接免疫荧光法分析单抗、多抗与HA1肽段的反应性,确定HA1蛋白的单抗识别表位及主要免疫功能区。结果成功克隆、表达了16条不同长度的H5N1肽段,并制备、获得30株分泌抗H5N1型禽流感病毒McAb的杂交瘤细胞株,其中18株为抗HA的单抗,18株中有6株单抗具有中和病毒活性。利用表达的H5N1肽段对单抗识别表位进行分析,初步确定3B5、3D1、3B2、M6、M3等18株McAb识别表位区域分别位于氨基酸残基aa133-143、aa155-165、aa166-196、aa166-176、aa34-66及aa296-328之间,其中3B5、3D1、3B2、M6等McAb识别表位为序列依赖型表位,M3和M7等具有中和活性的McAb识别表位为构象性中和表位。结论利用制备的H5N1病毒特异性McAb和表达的病毒HA1蛋白重叠肽抗原,初步确定了18株抗HAMcAb的识别表位和HA1蛋白的主要免疫功能区,为进一步研究开发新型疫苗提供了重要理论依据。

甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素蛋白基因进化研究

目的推算全球各地近年来分离的甲型H1N1流行性感冒（简称流感）病毒株血凝素（HA）蛋白片段的进化速率和进化分歧时间，从而初步探索流感病毒的起源和传播关系。方法搜集GenBank数据库中2008年以来登录的全球流感病毒H1序列共344条（人源性248条，猪源性84条，禽源性11条，其他1条）及本课题组分离的7条人源性H1序列，按照“分子钟”进化理论和基于markov chain monte carlo（MCMC）算法的Bayesian推断方法估算进化速率和进化分歧时间，并利用后验概率方法构建系统进化树。结果系统进化树显示，美国人源性、猪源性与禽源性H1序列与部分亚洲猪源性H1序列构成一个主要分支（美国分支）；全球其他地区的人源性H1序列构成另一个主要分支（欧亚人分支）；而部分中国猪源性、禽源性H1序列与意大利分离的禽源性序列也构成一个分支（欧亚动物分支）。全球H1N1和H1N2流感病毒株H1序列930bp核苷酸序列的年平均进化速率约为2．57×10^-3／位点（95％最高后验概率区间：1．96×10^-3～3．03×10^-3／位点）。其中，欧洲人源性H1序列和中国大陆猪H1序列的起源时间最早，年进化速率分别为6．46×10^-3／位点、0．97×10^-3／位点；而美国的人源性与猪源性H1序列的起源时间相近，年进化速率则分别为5．86×10^-3／位点、5．02×10^-3／位点。结论本次甲型H1N1流感暴发是北美地区H1N1病毒株长期人畜共患性积累的基因变异所致。中国大陆地区并非本次流感疫情病毒株的发源地，尚无证据能够表明北美暴发株属于一个全新的流感病毒变种。

稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立

目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。

人感染 H7 N9禽流感病毒血凝素蛋白线性 B 淋巴细胞抗原表位的预测及鉴定

目的：预测并鉴定人感染H7N9禽流感病毒血凝素（HA）蛋白的线性B淋巴细胞抗原表位及H7亚型的特异性。方法选取绍兴市人民医院提供的人感染H7 N9患者不同时间的三份血清样本和一份健康对照血清样本，采用TMHMM Sever v．2．0预测蛋白质胞外区，采用DNAStar Lasergene’ s Protean、BcePred和ABCpred预测其优势B淋巴细胞抗原表位，并用间接酶联免疫吸附试验（ ELISA）验证预测的B淋巴细胞抗原表位的免疫原性。使用Clustal X2．1软件将预测抗原表位与GenBank上H7N9和H1～H16亚型流感病毒HA蛋白的氨基酸序列进行多重序列比对以分析预测抗原表位的H7亚型特异性，采用Cn3D 4．3．1软件分析预测的线性B淋巴细胞抗原表位在H7N9禽流感病毒HA蛋白中的分布情况。结果 HA蛋白可能的B淋巴细胞表位位于胞外区N端的第172～183、363～380、452～472和第491～506四个区段。 ELISA结果表明，四个预测的B淋巴细胞表位均与已确诊患者血清发生阳性反应。多重序列比对结果发现第172～183和452～472区段与其他亚型氨基酸序列差异最大，可能具有更好的H7亚型特异性。 HA蛋白的三维结构进一步证明预测的四个B淋巴细胞抗原表位均位于HA蛋白表面。结论鉴定出了四个 HA蛋白线性B淋巴细胞抗原表位，其中第172～183和452～472区段具有更好的H7亚型特异性，可作为新型疫苗表位设计和H7抗原和抗体的特异性检测的依据。

类风湿关节炎患者HLA—DR4／1表型与流感病毒血凝素特异性T细胞增殖及其抗体的关系

目的探讨类风湿关节炎（RA）患者人类白细胞抗原（HLA）-DR4／1表型与流感病毒血凝素（HA）308-317多肽特异性T细胞增殖和血清抗HA308-317抗体之间的关系。方法将HA308-317多肽与70例RA患者外周血单个核细胞（PBMC）共孵育5d，^3H掺入法测定T细胞增殖。用ELISA法检测RA患者血清HA308-317抗体水平。以序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）技术对RA患者进行HLA-DR分型。结果在70例RA患者中，27例HLA-DR4／1表型阳性。其中，HA308-317多肽可刺激T细胞增殖的RA患者有17例（62.9％），10例无反应性；15例（55．6％）HLA-DR4／阳性RA患者抗HA308-317抗体阳性。在HLA-DR4／1表型阴性的RA患者中，T细胞对HA308-317多肽有反应性者10例（23．3％），无反应性者33例；25例（58．1％）患者抗HA308-317抗体阳性。HLA-DR4／1表型阳性组HA308-317特异性细胞增殖高于HLA-DR4／1表型阴性组（P〈0．01），但两组血清中HA308—317抗体水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论RA患者HA308-317特异性T细胞增殖与HLA-DR4／1表型有关，HA308-317抗体生成与HLA-DR4／1亚型无明显关系；HA308—317多肽可能通过诱导HLA-DR4／1特异性T细胞活化参与RA的发病。

禽流感病毒H5N1血凝素蛋白的细胞膜上提纯和结晶

目的从细胞膜上提纯禽流感病毒H5N1的血凝素蛋白H51151F和H51151F＋A134V＋E186D，并使蛋白结晶。方法细胞内大量增殖重组牛痘病毒，去垢剂提取细胞膜中的HA蛋白，连续蔗糖密度梯度超速离心，Western印迹检测，菠萝蛋白酶等裂解HA，离子交换层析，SDS—PAGE电泳并染色检测蛋白纯度，坐滴气象扩散法结晶。结果从细胞膜中提取了高纯度的血凝素蛋白H51151F和H51151F＋A134V＋E186D，并得到了H51151F蛋白晶体。结论首次获得了禽流感病毒H5N1的I-IS1151F蛋白晶体，为进一步研究禽流感病毒人传人的可能性打下基础。

甲型流感病毒血凝素基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的利用昆虫杆状病毒系统表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白。方法 PCR扩增去除信号肽的甲型H1N1(A/PR/8/34)流感病毒HA基因,与pFastBacdual载体(pFBd)连接,构建转移载体pFBd-HA,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒rBacmid-HA。rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒rBac-HA。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测重组杆状病毒基因组HA基因,间接免疫荧光法、Western blot法和ELISA法检测HA蛋白的表达。结果穿梭质粒rBacmid-HA经PCR鉴定构建正确;第3代rBac-HA的滴度为3×107 pfu/ml;感染rBac-HA的sf9细胞经PCR扩增可见4 216 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western blot鉴定与鼠抗甲型流感病毒HA(H1)单抗和鸡抗流感病毒(California株)多抗发生特异性反应,ELISA检测与鼠抗流感病毒(PR8株)多抗特异性结合的能力强于与鸡抗流感病毒(California株)多抗结合的能力。结论 利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了甲型流感病毒HA蛋白。

1999--2012年浙江省乙型流行性感冒病毒血凝素与三个内部基因的变异分析

目的探讨乙型流行性感冒病毒（简称乙型流感病毒）分离株血凝素（hemagglutinin，HA）、核蛋白（nucleoprotein，NP）、基质蛋白（matrixprotein，M）和非结构蛋白（nonstructuralprotein，NS）基因的分子变异特征。方法选取浙江省1999--2012年乙型流感病毒分离代表株31株，进行HA重链区（HAl）、NP、M和NS基因测序，并构建基因进化树，估算此4个基因的核苷酸进化速率并分析其氨基酸变异位点。结果31株乙型流感病毒分离株在删J基因进化树上分别处于Victoria系和Yamagata系两大分支，分别以B／Victoria／2／87和B／Yamagata／16／88为代表。2010年之后Victoria系分离株的ⅣP基因与Yamagata系毒株高度同源，处于同一进化分支。估算HAJ、ⅣP、M和NS．基因的核苷酸年进化速率分别为2．29×10^-3、1．39×10^-3、1．78×10^-3、1．30×10^-3／位点。Victoria系分离株HAl氨基酸重要变异位点主要包括K48E、L58P、N75K、K80R、K129N／S、N165K、S172P、S197N／D和A202V，Yamagata系分离株HAl的变异位点包括R48K、S150I、N166Y、N203S、G230D和D233N。2010年之后的Victoria系分离株NP氨基酸序列与Yamagata系毒株类似，与之前的毒株存在4个特征性氨基酸位点的变异，分别为A60D、L233V、N513S和V534I。结论1999--2012年浙江省乙型流感病毒分离株发生明显变异，表面抗原基因HAl进化速度快于内部基因，基因重配和基因突变是病毒发生变异的主要机制。

2017年贵州省H7N9禽流感病毒血凝素基因特性分析

为了解2017年贵州省H7N9禽流感病毒的分子特征和疾病风险,运用生物信息学软件对14株病毒HA基因的同源性、遗传进化、受体结合关键位点、致病相关和糖基化位点进行分析,明确了其HA基因核苷酸同源性为95.9%~100%,与WHO推荐的A/Shanghai/2/2013和A/Anhui/1/2013疫苗株的同源性分别为96.8%~97.8%和96.8%~97.9%;14株毒株均属于长三角分支,来源于5个不同的毒株;其中13株为低致病性禽流感毒株,而A/Guizhou-Weining/CSY01/2017为高致病性禽流感毒株;受体结合关键位点14株毒株均存在G186V的突变,13株存在Q226L的突变;潜在糖基化位点无变异。

流感病毒裂解疫苗及单价病毒液的血凝素稳定性研究

目的 通过对连续三年生产的流行性感冒（流感）病毒裂解疫苗成品和单价病毒液（MVP）血凝素（HA）的定期检测，了解成品和MVP的HA含量的变化情况，以便更准确、有效地配制半成品。方法 2003-2005年，每年选择一定数量的成品和MVP，按一定时间间隔抽样，采用单向免疫扩散法检测成品和MVP的HA含量。观察期至少为1年。结果 成品存放至半年，HA含量都在控制范围之内。但存放至1年，个别毒株HA含量降至低于控制范围。MVP的HA稳定性因毒株的不同而异。结论一般情况下，流感疫苗在成品检定合格后7个月内完成使用，因此，在此期间，成品的HA含量在合格范围之内。不同毒株的MVP，HA降幅不同，可能是由于编码HA蛋白的RNA4节段的核苷酸序列在不同亚型，甚至在同一亚型不同变异株间的差异所造成的。

人IgG Fc标签融合表达载体的构建及H5 HA1融合蛋白的表达

目的构建人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化H5 HA1融合蛋白。方法以pCAGGS载体为基础,依次插入IL-2信号肽及人IgG Fc片段,构建人IgG Fc标签融合表达载体。将H5 HA1克隆至含人IgG Fc标签的融合表达载体pCAGGS-F-IL-2/Fc中,瞬时转染293T细胞,进行融合蛋白的表达。表达的蛋白经Protein G亲和层析一步法纯化。结果人IgG Fc标签融合表达载体经酶切及测序证明构建正确;在293T细胞中分泌表达的H5 HA1与人IgG Fc的融合蛋白HA1-Fc相对分子质量约75 000,转染后72和96 h表达量最高;纯化的融合蛋白纯度达90%以上,含量为1.63μg/ml。结论成功构建了人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化了HA1-Fc融合蛋白,为流感病毒侵入及免疫机制的研究奠定了基础。

流感疫苗血凝素含量测定替代方法的建立及验证

目的建立测定流感疫苗血凝素（Haemagglutinin,HA）含量的替代方法 ,并进行验证,以解决大流行流感发生初期疫苗原液中HA定量的难题。方法优化糖苷酶处理条件,将流感疫苗原液经糖苷酶处理后,以还原SDS-PAGE方法分离样品,以灰度扫描法确定HA蛋白百分比,结合样品总蛋白数值,计算样品中HA含量。以该方法和传统的单向免疫扩散（SRID）法分别测定7批流感疫苗原液中HA含量,并进行比较。结果优化的糖苷酶处理条件为：总蛋白400μg/ml,PNGaseF加入比例为1：50。样品经糖苷酶处理后,以还原SDS-PAGE法可以清晰区分各蛋白条带,经测序后确定HA两个亚基,与预期相对分子质量一致。该方法测定7批流感疫苗原液中HA含量的结果与SRID法测定结果的符合率在87.90%~122.20%之间。结论初步建立了测定流感疫苗中HA含量的替代方法 ,在WHO参考品供应不到位时,可用于大流感发生时疫苗原液中HA之定量。

基于流感病毒血凝素的通用流感疫苗研究进展

目前使用的流感疫苗都是针对现行流行株设计的，因此难以有效应对病毒快速变异出现的新病毒株，而开发能同时抵抗多个流感病毒株感染的具有交叉保护作用的通用疫苗是今后流感疫苗研发的趋势。随着对流感病毒研究的深入，人们发现将传统认为具有高度变异性的流感病毒血凝素蛋白合理设计成疫苗靶抗原，也可以在一定程度上起到抗多个流感病毒株感染的保护作用，这表明流感病毒血凝素也具有作为通用流感疫苗候选抗原的潜力。此文对近年来基于血凝素构建的通用流感疫苗的研究进行综述。

泉州市流感疫情实验室检测及H3N2亚型基因特性分析

目的 了解2009年泉州地区流感流行及病毒株的变异情况,探讨流感病毒基因的变异与流感流行的关系.方法 对泉州市198例流感患者的咽拭子采用MDCK细胞培养进行病毒分离,经血清学试验鉴定分型和实时荧光RT-PCR方法检测病毒核酸.对其中4株毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR扩增病毒HA1基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAstar megalign软件分析基因.结果 198份咽拭子中有98份为H3N2亚型流感病毒核酸阳性,分离到62株H3N2亚型流感病毒,HA1基因经核苷酸序列测定显示,其基因特性更接近于A/Ningbo/333/2008,核苷酸同源性为98.7%,与A/Xiamen/70/2004的同源性为96.8%,由HA1基因核苷酸序列推导的氨基酸系列与疫苗株A/Brisbane/10/2007相比,有7个氨基酸位点发生变异,其中有1个位点位于抗原决定簇A区（144）,有2个位点位于抗原决定簇B区（158、189）,种系发生树分析也证实HA1基因存在一定差异.结论引起2009年泉州市流感在部分集体单位流行的病毒为H3N2亚型,其基因特性和抗原性与疫苗株相比均发生了一定变异.

流行性感冒病毒裂解疫苗灭活试验探讨

目的进行流行性感冒病毒裂解疫苗的病毒灭活检测,研究病毒灭活状况。方法将单价病毒液接种鸡胚尿囊腔,第二代鸡胚尿囊液检查不应出现血凝反应。结果半成品配制前,200批单价病毒液灭活试验全部通过,单价病毒液中较高的血凝素含量会影响灭活试验的判断。结论试验表明疫苗中无活病毒存在,生产过程中血凝素含量应适当控制。

乙型流感疫苗生产用毒株NYMC BX-51B主要抗原的基因特征及传代稳定性研究

目的 了解2013年流感疫苗生产用乙型病毒株NYMC BX-51B主要抗原血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）的基因特征,并研究该疫苗株的传代稳定性.方法 对制备的乙型流感病毒株主种子批、工作种子批及收获液病毒进行全面的生物学特性检定.采用逆转录-PCR法从主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液中扩增HA及NA基因片段,并进行全基因序列测定及分析.对7株不同年份的乙型疫苗株及野毒株的HA氨基酸序列进行比对,绘制氨基酸种系发生树.结果 该毒株主种子批和工作种子批的抗原性与WHO2013年推荐的毒株一致,种子批和收获液病毒的生物学特性均符合我国2010年版药典标准.HA基因序列长度为1 755 bp,编码584个氨基酸;NA基因序列长度为1 401 bp,编码466个氨基酸.各代次流感病毒HA和NA的基因核苷酸和氨基酸序列均相同,与GenBank发布的序列完全一致,同源性为100％.2013年乙型疫苗株的HA氨基酸序列与2010和2012年相比,同源性分别为94.3％和98.4％.结论 2013年乙型流感疫苗株NYMCBX-51B主要抗原基因传代稳定,一般生物学特性符合我国药典要求.2013年疫苗株的HA氨基酸序列与2010年相比进化距离较远.

生产用流感疫苗候选病毒株复制能力的提高

流感疫苗生产主要采用鸡胚病毒培养的方式，而提高流感病毒在鸡胚中的复制能力将能增加疫苗的产量和可靠性。影响病毒在鸡胚中繁殖的重要因素包括：流感病毒血凝素部分位点的氨基酸变异、血凝素与神经氨酸酶之间的作用平衡、病毒其他蛋白的作用及8个基因节段的重配比例。疫苗株制备方法瓶颈的突破和乙型流感病毒重配株的研究也将帮助疫苗生产商选择合适的候选疫苗株。

血细胞凝聚素和神经氨酸酶协同突变对甲型H1N1流行性感冒病毒特性的影响

甲型H1N1流行性感冒(以下简称流感)病毒为主要流行的流感病毒亚型,极易发生突变。血细胞凝聚素和神经氨酸酶是流感病毒表面两种重要的膜蛋白,相应的基因突变会导致这两种蛋白质发生变异,对流感病毒的复制能力、病毒毒力、神经氨酸酶活性、耐药性和免疫逃逸特性的改变起关键作用。甲型H1N1流感病毒特性的改变可能会对公共卫生产生重大威胁。现从复制能力、毒力、耐药性等方面,对血细胞凝聚素和神经氨酸酶协同突变影响甲型H1N1流感病毒特性的研究进展进行综述,为今后流感病毒特性的研究、疫苗的研发和临床用药提供参考。

四价流感病毒裂解疫苗生产用毒种传代稳定性研究

目的:研究四价流感病毒裂解疫苗生产用毒种的传代稳定性,确保毒种适用于疫苗生产。方法:将WHO推荐的季节性流感疫苗甲型H1N1和H3N2、乙型BV和BY病毒株(原始种子批)在鸡胚中传代扩增,制备生产用主种子批和工作种子批毒种。按中国药典2015年版三部的要求对毒种进行检定,包括鉴别试验、病毒滴度和血凝滴度测定、外源微生物检查等。将毒种连续传10代,用反转录PCR扩增第2、3、4、5、10代病毒鸡胚尿囊液中的血凝素和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的基因片段,并进行序列测定,分析传代过程中血凝素和NA的核苷酸和氨基酸序列同源性。结果:主种子批和工作种子批毒种的抗原性均与推荐的病毒株一致。各型病毒滴度均>6.5 lg半数鸡胚感染量/ml,血凝滴度均≥1∶160。2个种子批的支原体和无菌检查结果均为阴性,主种子批外源性禽白血病病毒和禽腺病毒检查结果亦为阴性。毒种在鸡胚中连续传代后,各型病毒株血凝素和NA的核苷酸序列同源性均>99%,氨基酸序列同源性均为100%。结论:四价流感病毒裂解疫苗生产用毒种具有良好的传代稳定性,可用于疫苗生产。