鸭新城疫病毒河北分离株血凝素-神经氨酸酶蛋白基因序列分析

为研究新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的遗传变异特性,对NDV HB/1/05/Dk株的血凝素-神经氨酸酶（haemagglutinin-neuraminidase protein,HN）蛋白基因进行了扩增、测序和遗传进化分析。结果表明：该病毒的HN基因长2 002bp,含有1个长为1 716bp的完整开放阅读框架（Open reading frame,ORF）,编码571个氨基酸,符合强毒株的特征。同源性分析表明,该毒株的HN基因与35株参考毒株间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为71.8%-99.1%和83.4%-98.9%。遗传进化分析表明,该毒株与基因VIId亚型参考毒株关系较近,属同一分支,与疫苗株B1、LaSota、Mukteswar株和I类毒株关系较远。因此,须加强河北省水禽NDV的监测。

副粘病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白结构与功能的研究进展

副粘病毒的血凝素-神经氨酸酶和融合蛋白具有重要的生物学活性,其中前者具有受体识别活性、神经氨酸酶活性和促进融合蛋白的细胞融合作用.本文对近年来血凝素-神经氨酸酶结构和功能方面的研究进展进行了综述.

新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测

目的检测新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性。方法采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出最佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性。结果成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是最多的。经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性。结论融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。

跨膜丝氨酸蛋白酶-4对2009甲型H1N1流感病毒HA的切割及其融合活性研究

流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤。2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化。本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)的真核表达重组质粒pCA-TMPRSS4-Flag与表达2009甲型H1N1流感病毒中国四川分离株HA的真核重组表达质粒pCA-SCHA共转染293T细胞,利用westernblot证明2009甲型H1N1流感病毒的HA蛋白能够被TMPRSS4切割;通过激光共聚焦确定TMPRSS4和HA在293T细胞膜上共定位;并进一步通过细胞融合试验证明经正确切割的HA具有在低pH条件下介导细胞膜发生融合的生物学功能。本实验为研究自然感染情况下参与活化流感病毒的宿主胰蛋白酶提供了实验依据。

副黏病毒Tianjin株重组血凝素-神经氨酸酶单克隆抗体的制备及在临床检测中的初步应用

目的:建立双抗体夹心ELISA法,调查副黏病毒Tianjin株引起婴幼儿下呼吸道感染情况。方法:用纯化的重组HN片段免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体。以兔抗Tianjin株多克隆抗体为捕获抗体,单抗G7G7E7为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,检测104例下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)标本。结果:获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株G7H4D3、G7D9G3和G7G7E7。3株单克隆抗体与副黏病毒Tianjin株有较高结合活性,与甲、乙型流感病毒,新城疫病毒(NDV),人副流感病毒(hPIV)1型、3型、肺炎支原体均无交叉反应性。ELISA相加试验和阻断试验表明,3株单抗识别相同或相近表位区域,识别的表位在抗病毒免疫应答中处于免疫优势地位。双抗体夹心ELISA法检测阳性率为1.92%(2/104)。结论:与RT-PCR和间接ELISA法比较,双抗体夹心ELISA法,具有敏感性高、特异性强的优点,适于临床检测使用。副黏病毒Tianjin株是婴幼儿下呼吸道感染的重要致病因子之一。

人酪氨酸酶相关蛋白-2的cDNA克隆及表达

目的 克隆酪氨酸酶相关蛋白 - 2 (TRP- 2 )编码基因 ,表达 TRP- 2蛋白 .方法 从培养的人黑素细胞中提取总RNA,反转录成 c DNA,通过 PCR方法扩增 TRP- 2编码基因 ,克隆至 p UC19载体并测序 ,再亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)融合表达载体 p GEX- 4T- 1,转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达 TRP- 2 /GST融合蛋白 .结果 从培养的人黑素细胞中扩增出编码 TRP- 2的 c DNA,序列测定证实与文献报道的序列一致 ;成功构建了 GST融合表达载体 p GEX- 4T- 1/TRP- 2 ;表达了 TRP- 2 /GST融合蛋白 .结论 成功克隆了人 TRP- 2基因 ,构建了 GST融合表达载体并表达了 TRP- 2

Bcr-Abl酪氨酸蛋白激酶域及其突变体的构建和表达

目的:制备Bcr-Ab l激酶域及其突变体-H is的重组蛋白.方法:用PCR方法从含有Bcr-Ab l全长的质粒pGD210中扩增出Bcr-Ab l激酶域片段,再通过重组PCR技术获得激酶域的几个主要突变体(T315 I,Y253F,E255K,E255V),测序正确后将其克隆到原核表达载体pET-32 a中,构建表达激酶域片段和H is标签融合表达的载体,IPTG诱导表达,得到的融合蛋白用镍-次氮基三乙酸(N i-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化.结果:成功得到了Bcr-Ab l激酶域及其突变体序列,经序列分析证实后将重组质粒转入BL-21进行表达.结论:通过重组PCR技术获得了野生型激酶域及其突变体蛋白.融合蛋白表达在包涵体,占菌体总蛋白的70%以上.经N i-NTA镍珠纯化后,纯度在95%以上.

天冬氨酸酶E.coli融合表达研究

以大肠杆菌基因组DNA为模板,设计引物扩增得到天冬氨酸酶基因,将其重组于胞内融合表达型T载体中,重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明,工程菌经IPTG诱导,表达大量表观分子量约75kD的融合蛋白。经试验,工程菌细胞具有较高的天冬氨酸酶活性,融合形式的酶最适温度37℃,最适pH8.5,融合伴侣DsbA的存在对酶活没有影响。

血凝素和神经氨酸酶与禽流感入侵机制

病毒的毒性是由其对宿主细胞、宿主动物或对种群产生不利影响的能力决定的。人类21世纪四次严重的呼吸系统疾病大流行都是甲型流感病毒引起。而禽类作为禽流感病毒的自然宿主和主要病毒携带者,形成了庞大而复杂的毒株储存库,可以不断产生新的或潜在的流行毒株。血凝素介导与细胞表面受体结合及膜融合,在流感病毒感染宿主细胞过程中是不可或缺的步骤。血凝素与唾液酸受体结合成为甲型流感病毒入侵和跨物种传播的首要条件。神经氨酸酶也存在于病毒的囊膜表面,具有水解唾液酸受体、释放病毒感染其他宿主细胞的作用。了解禽流感入侵及其在鸟类和哺乳动物之间的传播机制,有利于早期识别,为提供防控新手段提供可能。

人酪氨酸羟化酶全长及催化结构域序列表达产物酶活性比较

采用人的全长酪氨酸羟化酶 c DNA为模板 ,设计特定的引物进行 PCR扩增反应 ,获得编码 N-端缺失 14 1个氨基酸的催化结构域 c DNA片段 ,将其插入谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体 p GEX-4 T-1中 ,构建表达质粒 p GEXTHc,同时构建其全长片段的表达质粒 p GEXTHa。两者分别转化大肠杆菌 BL2 1,以 IPTG诱导可高效表达 ,产物以可溶形式存在 ,经亲和层析纯化后以蛋白酶裂解 ,再经亲和层析分离得到较纯的酶蛋白 ,采用高效液相色谱法 ( HPLC-ECD)检测酶活性 ,结果证明催化结构域活性高于全酶 ,是全酶活性的 2 .

新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶抑制剂细胞水平评价体系的建立

本文旨在建立以2009新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）为靶点的神经氨酸酶抑制剂（Neuraminidase Inhibitors，NAIs）细胞水平评价体系。NA有促进流感病毒释放的作用，本研究应用重组病毒技术，通过将表达NA（A／California／04／2009（H1N1））的质粒、表达流感病毒血凝素蛋白HA（Hemagglutinin）的质粒、以及表达敲除外壳基因并带1有荧光素酶报告基因的HIV-1基因组共转染至病毒生成细胞，产生以HA、NA为外壳蛋白包裹HIV-1核心的重组病毒。

新型甲型H1N1／季节性流感病毒神经氨酸酶抑制剂评价体系的建立

流感病毒（Influenza Virus）表面糖蛋白神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的主要作用为通过切割子代流感病毒血凝素蛋白（Hemagglutinin，HA）与唾液酸的连接，

人丙氨酸氨基转移酶基因(ALT1)的克隆、表达、纯化及酶活性的鉴定

目的克隆、表达、纯化重组人丙氨酸氨基转移酶(ALT1),并测定该酶活性,为建立特异性的ALT分型检测方法奠定基础。方法通过RT-PCR从肝癌细胞中扩增丙氨酸氨基转移酶(ALT1)基因,并将其克隆至pET-28 a表达载体中。重组表达质粒pET28 a-ALT1,转化大肠杆菌BL21,经1.0mmol.L-1IPTG诱导,表达可溶性重组融合蛋白,通过硫酸铵沉淀、镍离子柱亲和色谱及QHP柱色谱3步纯化,并检测融合蛋白活性。结果经过表达条件的优化增加了可溶性蛋白的表达,纯化后目的蛋白纯度达到85%,经测定重组蛋白具有很高的丙氨酸氨基转移酶活性(200 U.mg-1)。结论通过基因克隆及大肠杆菌表达,能得到活性较高的丙氨酸氨基转移酶蛋白。

苯丙氨酸CoA酰基转移酶原核表达系统的构建和表达

目的 :获得大量的重组红豆杉苯丙基转移酶 (BAPT) ,为紫杉醇半合成代谢提供廉价的催化剂。方法 :根据DNA重组技术 ,构建原核表达载体pET -BAPT ,使目的基因位于原核T7启动子下游 ,IPTG诱导基因表达。结果 :BAPT高效表达 ,重组蛋白主要以包涵体的形式存在。结论 :为获得可溶性重组蛋白BAPT奠定了理论基础。

8R-MUC1核心肽融合蛋白的原核表达及纯化

目的 :构建蛋白质转导结构域 8个精氨酸聚合体 (8R)与 MUC1核心肽融合蛋白的原核表达载体 ,并表达、纯化出具有生物学活性的 8R- MUC1核心肽融合蛋白。方法 :以 PCR法从 HSP6 5 - MUC1- p ET2 8a质粒中钓取 MUC1核心肽 2个重复序列片段 ,连入 p MD18- T载体 ,然后用酶切、连接的方法从 T载体上获得 MU C1核心肽 6重复序列片段 (MU CPT) ,将其克隆入含 8R的 p ET2 6 b+ 原核表达载体中构建 8R与 MU CPT融合蛋白(8R- MU CPT)表达载体。用 IPTG诱导转化 8R- MU CPT表达载体的大肠杆菌 BL2 1(DE3) ,并以镍螯合层析法纯化 8R- MU CPT融合蛋白。结果 :构建了 8R与 MU C1核心肽 6个重复序列片段的融合蛋白原核表达载体8R- MUCPT- p ET2 6 b+ ,并在 BL2 1(DE3)中表达了 8R- MU CPT融合蛋白 ,经镍螯合层析获得纯度为 95 .5 %的8R- MUC1核心肽融合蛋白。结论 :构建了 8R- MU C1核心肽融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出具有生物学活性的融合蛋白。

尿液跨膜丝氨酸蛋白酶2基因和ETS转录因子家族成员相关基因融合体在前列腺癌诊断中的价值

目的评价尿液跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）基因和ETS转录因子家族成员相关基因（ERG）融合体与前列腺特异性抗原（PSA）mRNA比值测定在前列腺癌诊断中价值。方法建立TMPRSS2和ERG基因融合体（TMPRSS2：ERG）mRNA及PSAmRNA荧光定量逆转录（FQ—RT）-PCR检测方法，TMPRSS2：ERGmRNA／PSAmRNA比值以2^-△ct。进行计算。同时，用该方法检测107例前列腺良性增生（BPH）患者和99例前列腺癌（PCa）患者尿液中的TMPRSS2：ERGmRNA／PSAmRNA比值，并分析该指标对PCa的诊断价值及与PCa临床分期、Gleason评分和PSA水平间的关系。结果PCa组TMPRSS2：ERGmRNA／PSAmRNA比值明显高于BPH组（0．101比0．000；U=2290．500，P〈0．01）；但其在PCa不同临床分期、Gleason评分、PSA组之间的差异均无统计学意义（X^2值分别为3．293、0．002、1．745，P均〉0．05）。TMPRSS2：ERGmRNA／PSAmRNA比值诊断PCa的ROC曲线下面积（AUC）为0．784（95％C1：0．707～0．860），当以3．0×10^-5。为临界值时，其诊断PCa的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为75．8％（75／99）、94．4％（101／107）、92．6％（75／81）、80．8％（101／125）和85．4％（176／206）；但其敏感度在PCa不同临床分期、Gleason评分、PSA组之间的差异均无统计学意义（X^2值分别为3．572、2．278、3．707，P均〉0．05）。结论尿液TMPRSS2：ERGmRNA／PSAmRNA比值在PCa诊断中具有较好的特异度和敏感度，有望成为PCa联合诊断的候选指标，但不能作为PCa病情监测和判断预后的指标。

科学家深度解析H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的跨种传播机制

A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)属于正黏病毒科,是一个有囊膜的、分节段的单股负链的RNA病毒。它是一种重要的人畜共患病原,在历史上曾引起多次流感大流行事件以及散发性禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)感染人事件,严重威胁公共卫生安全和社会经济发展。流感病毒表面有两个重要的囊膜蛋白——血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)。不同亚型流感病毒与受体的结合主要是靠HA蛋白实现的,HA与受体的结合具有种属特异性。

牛副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白在杆状病毒中的表达

目的在杆状病毒中表达牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type-3,BPIV-3)血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase,HN)。方法提取BPIV-3 BN-1株RNA,设计特异性引物扩增HN全长ORF,将其克隆至杆状病毒供体载体p Fast Bac HTA中,获得重组供体质粒p Fast Bac-HN。将p Fast Bac-HN转化至感受态细胞E.coli DH10Bac,制备穿梭质粒Bacmid-HN。将纯化的Bacmid-HN经脂质体转染至Sf21昆虫细胞,拯救重组杆状病毒,并进行Western blot鉴定。结果经PCR及测序鉴定证明,HN基因重组供体质粒p Fast Bac-HN及穿梭质粒Bacmid-HN构建正确。利用Sf21昆虫细胞成功拯救重组杆状病毒,连续传代扩增3代的病毒滴度为2×108 CPE/ml。重组HN蛋白的相对分子质量约70 000,可与BPIV-3阳性血清发生特异性反应。结论在杆状病毒表达系统中成功表达了BPIV-3重组HN蛋白,为BPIV-3的诊断及疫苗效力评价奠定了基础。

水禽流感病毒分离株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)膜蛋白基因遗传进化分析

采用常规的血清学收验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行两年多的监测,分离鉴定出多株H6亚型禽流感病毒。对其中的一株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)(简称DkYZ23302)(H6N2)的表面膜蛋白基因进行了序列测定,并与GenBank中收录的其它序列进行了比较,遗传进化结果表明DkYZ23302的血凝素基因(HA)与近年香港分离的鸭源毒株DkHK346199(H6N1)、中国台湾鸡源毒株CkTaiwanna398的亲缘关系最近;而神经氨酸酶基因(NA)遗传进化分析结果表明DkYZ23302(H6N2)的NA基因起源于禽源H9N2亚型流感病毒,这可能是不同亚型禽流感病毒在水禽体内发生基因重配的结果。DkYZ23302(H6N2)的HA推导的氨基酸剪切位点序列为P-Q-I-E-T-R-D,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列,与对SPF鸡的致病力试验相吻合。