海洋寄生甲藻血卵涡鞭虫孢子活力评估及抑制药物筛选研究

血卵涡鞭虫(Hematodinium spp.)是一类主要寄生于海洋甲壳类动物的寄生甲藻,其引发的流行病严重危害我国沿海重要养殖经济蟹类(三疣梭子蟹、拟穴青蟹)的渔业生产。孢子是血卵涡鞭虫水体传播过程中的关键生活史阶段,准确评估孢子活力并筛选可抑制其活力的药物,可为防控该寄生甲藻流行性病害提供重要依据。为此,本研究建立了基于计算机图像分析的血卵涡鞭虫孢子运动活力评估方法,评估了4种水产常用药物(苯扎溴铵、戊二醛、辛硫磷、聚维酮碘)对血卵涡鞭虫孢子运动活力的影响。结果显示,2 h苯扎溴铵、戊二醛、辛硫磷、聚维酮碘对大孢子的半数效应浓度(EC_(50))依次为0.380 mg·L^(–1)、1.411 mg·L^(–1)、1.808 mg·L^(–1)、108.694 mg·L^(–1),2 h苯扎溴铵、戊二醛、辛硫磷对小孢子的EC50依次为0.172 mg·L^(–1)、0.038 mg·L^(–1)、0.101 mg·L^(–1)。苯扎溴铵抑制两种孢子运动活力的效果明显优于其余3种药物,可作为水产养殖中防控血卵涡鞭虫流行病的候选药物,建议防治血卵涡鞭虫大孢子的泼洒浓度为0.38~1.72 mg·L^(–1),小孢子泼洒浓度为0.17~0.35 mg·L^(–1)。以上研究结果为丰富血卵涡鞭虫孢子活力评估方法,筛选水产养殖应用药物防控血卵涡鞭虫流行病提供了参考。

池塘养殖脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)感染血卵涡鞭虫的研究

通过现场取样、显微镜检、细菌培养、组织病理、电镜观察以及PCR检测等研究手段,对2008年9月浙江省舟山市普陀区某梭子蟹养殖塘混养的脊尾白虾"白浊病"进行了系统的病原学研究。结果表明,病虾体色发白,反应迟钝,血淋巴液呈浊白色,严重患病白虾血淋巴中的血细胞几乎没有或者极少,代之以大量与血细胞形似的寄生虫;组织病理切片及电镜观察发现,病虾心脏、肝胰腺、肌肉、鳃部等组织寄生有大量单细胞寄生虫,该寄生虫虫体形态特征、显微结构及宿主临床症状与本实验室之前研究报道的感染三疣梭子蟹和锯缘青蟹的血卵涡鞭虫类似;采用已建立的针对血卵涡鞭虫ITS1基因的引物对"白浊病"病虾的血淋巴样品进行PCR检测,可扩增出585bp左右的特异条带。综合以上研究结果,确定该寄生虫为血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)。有关脊尾白虾感染该寄生虫的报道在国内外尚属首次。

养殖梭子蟹血卵涡鞭虫感染的初步研究

2004年7—9月,浙江舟山人工养殖梭子蟹相继发生一种被当地渔民称为"牛奶病"的流行性疾病,并引起大量死亡。病蟹蟹体消瘦,肌肉白浊,蟹盖内可见大量乳白色液体。对带有典型病症的濒死病蟹进行细菌分离,未分离到细菌。组织病理学观察发现,病蟹血淋巴急剧下降,代之以大量的寄生原虫,该寄生虫在病蟹的肝胰腺、鳃、心脏、肌肉等部位大量侵袭,并引起这些组织发生以坏死为主的变质性病变,其病理特征主要表现为:细胞肿胀、变性、坏死,某些细胞的细胞核固缩、碎裂或崩解。电镜观察乳白色体液及病变组织,可见大量寄生原虫,该寄生虫大小约5—7μm,多数呈卵圆形,单核或多核,具有2根鞭毛。进一步通过分子生物学方法,确定该寄生虫为血卵涡鞭虫Hematodinium sp.,初步认定其是引起养殖梭子蟹"牛奶病"的一种重要病原。

血卵涡鞭虫在养殖锯缘青蟹中的寄生

利用光镜和电镜对2005年9月浙江三门湾地区某养殖场发生的养殖锯缘青蟹规模性死亡病蟹进行观察,并对病原进行分子生物学鉴定。组织病理学研究发现,病蟹蟹体消瘦,肌肉白浊,头胸甲内可见大量乳白色液体,血淋巴细胞的量急剧减少,代之以大量寄生原虫,该原虫在病蟹的肝胰腺、鳃、心脏、肌肉等部位大量寄生,引起这些组织发生以坏死为主的变质性病变。电镜下,乳白色液体及病变组织内可见大量寄生虫体,其形态特征、内部结构及宿主表现的症状,与血卵涡鞭虫相类似。采用Small等[5]的血卵涡鞭虫ITS特异引物,扩增出分子量为300 bp左右的条带,并对其进行了测序及序列相似性比较,确定该寄生原虫为一种血卵涡鞭虫Hematodiniumsp。血卵涡鞭虫是海水甲壳类的重要病原寄生虫,我国尚未有该寄生虫病的研究报道,文中首次发现其在养殖锯缘青蟹中的寄生,为靳一步研究该寄生虫病积累了资料。

海产甲壳类血卵涡鞭虫病研究进展

血卵涡鞭虫是导致海产甲壳类疾病的主要寄生虫病原之一,国内迄今尚未见相关报道。本文结合作者近年来对海水养殖甲壳类病害的研究结果,较系统地综述了国外甲壳类寄生血卵涡鞭虫的研究进展,包括分类地位、生活史、传播途径、流行病学、组织病理以及诊断方法,并提出了相应的防治措施,旨在为中国海水养殖蟹类血卵涡鞭虫病害的研究与防治提供参考。

应用PCR方法检测患“黄水病”锯缘青蟹中的血卵涡鞭虫

"黄水病"是目前锯缘青蟹养殖过程中的主要疾病之一,病蟹主要症状表现为肌肉白浊,体液呈土黄色或浊白色牛奶状。因该病流行范围广、发病率和死亡率高,给青蟹养殖业主造成巨大经济损失,严重地影响了青蟹养殖的健康发展。本研究从病蟹体液中发现大量疑似血卵涡鞭虫的寄生原虫,应用已建立的梭子蟹血卵涡鞭虫病的PCR检测方法对患"黄水病"青蟹进行检测。结果从患病青蟹组织的DNA中扩增出产物大小为585bp的特异性目的片段,经序列分析比较,与三疣梭子蟹上发现的血卵涡鞭虫的序列同源,同源性达99.7%。综合病原流行病学调查、组织病理学、电镜观察等分析结果,初步确定血卵涡鞭虫是引起养殖青蟹"黄水病"的重要病原。

海产蟹类血卵涡鞭虫间接荧光抗体快速检测技术

以寄生于三疣梭子蟹血淋巴中的血卵涡鞭虫虫体为抗原,制备了多克隆血清抗体。抗体经健康梭子蟹血淋巴吸附处理后,间接ELISA检测效价达7 680。应用该抗体建立了血卵涡鞭虫的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。采用常规显微镜检、PCR及IFAT 3种方法对采集的养殖青蟹、梭子蟹及海捕梭子蟹等18个样本进行了检测。检测结果显示:常规显微镜检阳性检出率为33.3%,而IFAT及PCR检测阳性率77.8%,符合率达100%;阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血细胞则未被染色;可检测到血卵涡鞭虫不同生活阶段的营养体、腰鞭孢子及合孢体阶段。为血卵涡鞭虫的流行病学调查及生活史研究提供了简便实用的方法。

三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫PCR检测方法的建立

血卵涡鞭虫病是近年来三疣梭子蟹养殖过程中发生的一种危害较大的流行性疾病，患病蟹的体液和肌肉组织中有大量的血卵涡鞭虫寄生。该病多发生于每年9～11月份的夏秋季节，会在短时间内出现死亡高峰。因该病流行范围广、死亡率高、危害严重，对三疣梭子蟹养殖业发展影响很大。本文根据GenBank中登陆的血卵涡鞭虫18S rDNA和ITS1基因序列设计了1对特异性引物，建立了血卵涡鞭虫病的PCR检测方法，从感染血卵涡鞭虫的三疣梭子蟹组织DNA中扩增出产物大小为585bp的DNA片段。本方法可快速、特异地检测出三疣梭子蟹感染和携带血卵涡鞭虫的状况，为三疣梭子蟹的健康养殖和血卵涡鞭虫病的流行病学调查提供了快速、简便的手段。

血卵涡鞭虫感染三疣梭子蟹的病原形态学及组织病理学变化

血卵涡鞭虫是一类主要感染海产甲壳类的致病性寄生性甲藻。近年来,该寄生性病原在我国沿海主要经济蟹类养殖区域流行性发病,给当地蟹类养殖业造成了严重经济损失。为厘清血卵涡鞭虫的生活史形态,了解宿主的病理损伤机制,本文通过血涂片法和H&E染色法系统研究了感染过程中该寄生虫的形态变化和宿主的组织病理变化。结果表明,血卵涡鞭虫在感染过程中经历丝状滋养体、单核/双核/多核滋养体、团聚体、蛛网状滋养体、孢子前细胞及孢子等不同生活史阶段。感染导致三疣梭子蟹发生系统性病理变化,肝胰腺、心脏、鳃、肌肉等器官和组织在不同感染阶段均发生相应程度的组织病理变化,主要表现为体细胞破损或坏死、细胞间隙模糊、疏松结缔组织充斥大量寄生虫细胞。最终由于寄生虫在宿主主要器官组织间隙内大量增殖,导致重度感染的梭子蟹器官或组织功能破坏、丧失而死亡。

血卵涡鞭虫核糖体18SrDNA和ITS1-5．8SrDNA-ITS2序列测定与系统发育分析

血卵涡鞭虫是一类寄生性的原生动物，是近年来引起三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、“牛奶病”及锯缘青蟹（Scylla serrata）“黄水病”的一种主要病原，该虫对宿主感染时间长，流行范围广、发病率、死亡率较高，危害严重，给梭子蟹和青蟹的养殖业造成了巨大的经济损失。

血卵涡鞭虫单克隆抗体的制备与初步应用

用血卵涡鞭虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经常规融合、间接ELISA方法筛选,将所得阳性克隆再经3次亚克隆后,共获得3株针对血卵涡鞭虫的单克隆抗体(2B2、3G4、4G7),单克隆抗体亚类鉴定表明,三者为IgG类抗体。用筛选的杂交瘤细胞株制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为5.12×10-4和8.00×10-4。进一步利用单克隆抗体建立间接荧光抗体方法对单抗特异性进行鉴定,阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血淋巴则未被染色。用单克隆抗体和多克隆兔抗血清以羊抗鼠HRP-IgG为酶标抗体,建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法,该方法对血卵涡鞭虫阳性标本检测符合率为100%。结果表明,制备的单克隆抗体效价高、特异性好,可用于血卵涡鞭虫的早期临床诊断。

海洋寄生甲藻血卵涡鞭虫生活史及温度对其发展的影响

血卵涡鞭虫(Hematodinium spp.)是一类感染海水甲壳类的致病性寄生甲藻,在全球主要经济蟹、虾类中频繁导致流行性病害,严重危害我国沿海重要经济蟹类的渔业生产。为进一步厘清血卵涡鞭虫的生活史,通过血涂片法、H&E染色法(hematoxylin-eosin staining,苏木精-伊红染色法)和体外培养方法系统研究了从我国沿海天津厚蟹(Helice tientsinensis)中分离的血卵涡鞭虫株系的生活史,描述并比较了血卵涡鞭虫在宿主体内(血淋巴、组织)和体外培养体系中各生活史阶段的细胞形态,并进一步探究了温度对血卵涡鞭虫生活史发展的影响。结果表明,血卵涡鞭虫在感染宿主过程中经历了丝状滋养体、类变形虫滋养体、蛛网状滋养体、团块状聚合体、孢子母细胞、孢子前细胞和孢子等生活史阶段。温度显著影响血卵涡鞭虫的细胞生长发育与增殖过程;在实验低温(10℃)和高温(30℃)条件下,血卵涡鞭虫不能在宿主体内顺利寄生增殖;在15~25℃范围内,温度越高其细胞生长发育及细胞增殖速度越快,而在15℃和20℃条件下,血卵涡鞭虫可在感染的天津厚蟹体内产生大量游动孢子并释放到水体中。

双抗体夹心ELISA法检测海产蟹血卵涡鞭虫方法的初步建立

以针对血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体为捕获抗体,纯化的抗血卵涡鞭虫的兔抗血清为检测抗体,初步建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法。方阵滴定确定最佳反应条件:包被的单克隆抗体浓度为10μg/mL,多抗兔血清工作浓度为14.3μg/mL,待检样品稀释度为1:800;HRP-羊抗鼠IgG按1∶20 000稀释。用建立的ELISA方法对86份已知背景样品进行检测,阳性检出为97.6%,血卵涡鞭虫抗原检测的灵敏度为100 pg/mL;与蟹血淋巴细胞、假丝酵母菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等样本均无交叉反应。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法灵敏度高、特异性强,可用于诊断梭子蟹乳化病血卵涡鞭虫病的检测。

拟穴青蟹血卵涡鞭虫病的组织病理和超微病理观察

利用组织切片及超薄切片电镜技术对患血卵涡鞭虫病拟穴青蟹的肝胰腺、步足肌、心肌和鳃4种组织进行病理学分析,探讨该病的致病机理。组织病理显示:呈变质性炎症,肝小管缩小,空泡化;心肌、步足肌肌纤维断裂,排列疏松;鳃上皮组织变性、坏死;在肝小管管腔间、肌纤维间和鳃腔中寄生有大量血卵涡鞭虫。超微病理显示:肝胰腺细胞形态不规则,细胞核萎缩;心肌、步足肌肌丝断裂,线粒体脊断裂、萎缩、空泡化;鳃组织细胞结构破坏,线粒体数量减少。实验结果表明:拟穴青蟹血卵涡鞭虫病的组织细胞结构发生明显的病理变化,伴随有毒代谢产物的释放,病理损伤加重,病蟹的摄食能力逐渐衰退或丧失,终致死亡。

日照沿海养殖三疣梭子蟹血卵涡鞭虫流行病发生过程研究

血卵涡鞭虫(Hematodinium spp.)是一类严重危害海洋甲壳类动物的新型寄生性病原,可引发养殖三疣梭子蟹“牛奶病”,导致梭子蟹大量死亡,造成巨大经济损失。目前,对于血卵涡鞭虫在日照养殖梭子蟹中的流行发生情况还未见报道,2020年8月和2021年5~11月期间在日照主要梭子蟹养殖区开展流行病学调查研究,通过形态学观察、组织病理检测和分子生物学鉴定发现了血卵涡鞭虫(Hematodinium perezi)在日照地区的流行分布,并发现其流行病发生在6~9月间,高发期为7~8月,感染率高达52.5%。感染宿主的血淋巴和心脏、肝胰腺、鳃、肌肉等组织中发现了丝状滋养体、类变形虫滋养体、蛛网状滋养体、团块状聚合体、孢子前细胞和孢子等血卵涡鞭虫的多个生活史阶段。在养殖池塘环境水体中检测到血卵涡鞭虫存在,水体中血卵涡鞭虫丰度与宿主感染率存在错峰现象,间隔3~4周。流行病的发生与水体温度和盐度变化密切相关,7~8月较高的水温(26.2~28.6℃)促进了血卵涡鞭虫在宿主体内快速增殖及流行病爆发,而较低的盐度(20.7~25.3)可能抑制了环境水体中血卵涡鞭虫的存活及其传播扩散。以上研究结果初步揭示了海洋寄生甲藻血卵涡鞭虫在日照地区的流行分布情况,解析了该地区流行病发生的生态学过程,为后续血卵涡鞭虫流行病的针对性防控提供了重要参考依据。

血卵涡鞭虫的发生及流行研究进展

血卵涡鞭虫(Hematodinium)是一类危害海水甲壳类动物的致病性寄生甲藻,自1931年以来感染超过40多种甲壳类动物,导致了一些经济类甲壳动物的大量死亡。为有助于加强对血卵涡鞭虫的防控,从季节、环境、宿主类型和传播模式方面,总结了血卵涡鞭虫流行和发生的原因。

津冀地区养殖三疣梭子蟹大量死亡的病原和病理分析

2014年7月,津冀沿海地区池塘养殖三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴发疾病,导致大量死亡。患病梭子蟹有两种不同表现症状:一种症状为停止摄食,空胃、空肠,行动迟缓;肌肉白浊、不透明,最后乳化呈牙膏状;该病死亡率达60%~70%,称之为"肌肉白浊病"。另一种症状为壳软,停止摄食,行动迟缓;肌肉变白浊、水样变化、萎缩;体腔液及组织坏死液化后从组织中大量渗出,不凝固;死亡率可达90%以上,称之为"牛奶病"。通过疾病流行特征、组织病理、病原超微结构等分析,初步判断肌肉白浊病由一种微孢子虫感染而致,虫体大小(1544±250)nm,呈椭球形,极丝圈数8~9圈,具孢壁[厚(130±22)nm],纤毛(长120~500 nm)、极体[(726±200)nm]、极管、固定盘、质膜、核等结构;牛奶病则是由一种血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)感染而致,虫体大小8~10μm,卵圆形,体表多皱褶、凸起,由细胞壁、多核、纤毛等组成。两种患病蟹的肌肉组织病变明显不同:患肌肉白浊病的蟹肌纤维断裂、溃散、浆质化,肌束减少并被团状集聚的寄生虫充斥、占据。电镜观察显示肌纤维细胞破碎、融合,出现大量空泡结构;肌纤维细胞的线粒体、内质网等细胞器解体、消失。患牛奶病的蟹肌束间隙变大,大量血卵涡鞭虫或充斥在间隙中或附着在肌纤维上,导致肌纤维断裂、离散解体,甚至溶解性坏死,组织呈水样变化。电镜观察也证实这两种寄生虫可同时感染三疣梭子蟹个体的同一组织;当肌纤维细胞破碎融合后,两种寄生虫均能寄生在融合后的胞浆中。从发病史来看,肌肉白浊病和牛奶病的发生有蔓延趋势,死亡率趋向更高,已逐步成为三疣梭子蟹养殖的重要疾病。

海捕三疣梭子蟹一寄生性动基体目原生动物的初步研究

从自然海区捕获的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)上检测到一种寄生性原生动物,主要寄生于蟹血淋巴液中。通过普通光学显微镜检发现,病蟹的血淋巴细胞急剧减少,代之以大量的原生动物,此原生动物可以被中性红染液着色。运用PCR技术对该原生动物进行了18S rDNA基因和ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因序列扩增,同时对扩增片段进行了序列测定,应用软件MEGA 3.1和DNAStar对测序结果进行了同源性比较和系统发育树构建。18S rDNA同源性比较结果显示:获得的18S rDNA序列与动基体目(Kinetoplastida)新波豆科(Neobodonidae)新波豆属(Neobodo)的同源性最高,达88.3%;获得的18S rDNA序列和GenBank中已登录新波豆属的其它原虫的18S rDNA序列在系统发育树中位于同一集群,初步确定该原生动物为新波豆虫(Neobodo sp.),是原生动物门(Protozoa)鞭毛虫纲(Flagellata)动基体目新波豆虫科新波豆属的一员。

三疣梭子蟹“乳化病”病理学研究

为从病理学角度阐明三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)“乳化病”的致病机理,选取中度和重度感染“乳化病”的三疣梭子蟹进行了病理研究。结果显示:河北省黄骅地区池塘养殖三疣梭子蟹“乳化病”的致病病原为血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.);患病三疣梭子蟹的血淋巴、心脏、肝胰腺、鳃、体肌肉、螯足、第一步足和性腺等重要的组织器官均会受到不同程度的破坏。中等程度感染的病蟹多数组织器官尚存比较完整的组织结构;而重度感染的病蟹组织器官被严重破坏,其中肝胰腺和螯足肌肉已经失去原有组织结构,性腺也几乎完全消失。

脊尾白虾“黄育1号”

一、品种概况(一)培育背景脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、白虾属(Exopalaemon),其肉质细腻,味道鲜美,营养价值高,深受广大消费者和养殖业者欢迎。脊尾白虾主要分布于中国大陆沿岸和朝鲜半岛西岸的浅海低盐水域,以渤海和黄海产量最大。上世纪80年代,我国开始了脊尾白虾的繁殖生物学研究,经过多年发展,目前全国脊尾白虾年养殖面积超过40万亩,年产量约5万吨,年产值超过30亿元,已发展成为我国海水养殖特色经济虾类之一。