Mip3β、血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因双表达重组质粒的构建及鉴定

目的:构建Mip3β、血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因双表达重组质粒。方法:通过RT-PCR的方法从扁桃体中扩增的Mip3β基因片段,然后将基因工程合成的血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因经双酶切后分别连接至pIRES质粒,测序验证碱基序列。结果:扩增出了Mip3β的全长CDNA,并成功构建Mip3β、血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因双表达重组质粒,测序结果正确。结论:成功构建了Mip3β、血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因双表达重组质粒,为进一步探讨血型抗原模拟多肽对肿瘤微环境的影响奠定分子学基础。

血型A抗原的模拟多肽的表达及功能研究

目的融合表达血型A抗原的模拟多肽,初步鉴定融合蛋白结合抗A抗体的能力。方法PCR克隆扩增血型A抗原模拟多肽(P5)和谷胱苷肽S-转移酶(GST)编码基因,并连接成P5-GST。双酶切后克隆入原核表达质粒pET28b,经E.coli DH5a扩增后纯化并酶切、测序鉴定。以BL21(DE3)为表达菌,在IPTG诱导下表达P5-GST融合蛋白,Ni-NTA柱纯化蛋白。红细胞凝集抑制实验分析融合蛋白模拟血型A抗原的能力。ABO-ELISA初步分析P5-GST融合蛋白检测血型抗体的效能。结果成功构建P5基因和GST基因融合的原核表达质粒pET28b-P5-GST,目的基因可以高效表达,纯化的融合蛋白具有良好的模拟血型A抗原的能力。基于P5-GST融合蛋白的ABO-ELISA具有一定的检测血浆抗A抗体的能力。结论血型A抗原的模拟多肽序列与GST的融合表达蛋白具有特异性结合抗A抗体的特性,本融合蛋白具有替代血型A多糖抗原潜能,为发展新型的抗A抗体检测方法提供依据。

人红细胞血型A抗原的亲和层析纯化

ＡＢＯ抗原是人红细胞上一类重要的血型抗原，抗Ａ、Ｂ型抗体在临床检验中是必不 可少的试剂．为了提高抗Ａ单克隆抗体的生产效率，用ＩｇＭ抗体新和层析法提纯了Ａ糖脂蛋白的 可溶性部分，并在用一些免疫生化的方法加以鉴定之后，将它通过抗体分子的中介与胶颗粒连结， 成为颗粒性抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，以探讨这种纯化和免疫方法的可行性。

血型A抗原模拟多肽与抗A抗体的分子对接

目的:从分子结构水平研究血型A抗原及其模拟多肽(肽P1 QIWYERTLPFTF,肽P2EYWYCGMNRTGC)与血型A抗体的相互作用。方法:利用Chimera软件构建血型A抗原模拟多肽(P1,P2)的三维结构;将天然血型A抗原及其模拟多肽通过Autodock软件与血型A抗体Fv段(PDB:1jv5)对接。结果:天然血型A抗原和多肽P1、P2都能与1jv5分子中一个由疏水性氨基酸组成的凹槽对接,且对接部位重叠。天然A抗原和P1可以与1jv5形成2个氢键,且天然抗原和模拟多肽都能够与1jv5中的多个氨基酸相合作用。结论:通过生物信息学计算软件成功模拟了血型A抗原及其模拟多肽与抗体1jv5的相互作用情况。此2个模拟多肽是从功能上对天然A抗原进行模拟的。

血型A抗原模拟肽表位分析

目的:通过计算机辅助的氨基酸定点突变及分子对接研究血型A抗原模拟多肽(EYWYCGMNRTGC)中关键的氨基酸残基。方法:通过在线服务器PEP-FOLD构建丙氨酸突变后多肽的三维结构,通过软件Autodock Vina将多肽与血型A抗体(PDB:1jv5)进行对接,计算亲和力,通过分析亲和力的变化确定模拟多肽中的关键氨基酸残基。结果:肽EYWYCGMNRTGC与1jv5的对接最小自由能为-6.3kcal/mol,其中E1、W3、T10、C12经丙氨酸替换后与1jv5的亲和自由能分别增加为-6.1kcal/mol、-5.4kcal/mol、-6.0kcal/mol、-6.1kcal/mol。结论:血型A抗原模拟肽EYWYCGMNRTGC中的关键氨基酸可能是E1、W3、T10、C12。

用噬菌体展示随机7肽库筛选血型A抗原模拟肽

目的:通过血型A单克隆抗体从噬菌体展示随机7肽库中筛选血型A抗原的模拟多肽。方法:通过对噬菌体随机7肽库进行3轮亲和筛选,从第三轮筛选后获得的洗脱物中挑选多个噬菌体克隆,采用ELISA方法鉴定阳性克隆,测序并推导噬菌体展示短肽的氨基酸序列,化学合成短肽、红细胞凝集抑制试验鉴定短肽模拟A抗原的能力。结果:三轮筛选后特异性噬菌体被富集了200多倍,对ELISA鉴定信号较强的16个噬菌体克隆DNA测序并推导氨基酸序列的结果显示两个克隆展示相同的序列FSYLPSH。化学合成肽能抑制A型红细胞与抗A的凝集作用。结论:肽FSYLPSH具有模拟血型A抗原表位的作用,具有代替天然血型A抗原在临床中应用的潜能。

A抗原表位模拟多肽融合表达载体的构建及鉴定

目的:构建血型A抗原模拟多肽融合表达载体,初步鉴定融合表达蛋白结合抗A抗体的能力。方法:PCR扩增血型A抗原模拟多肽(P17)和谷胱苷肽S-转移酶(GST)编码基因,并连接成P17-GST。双酶切后克隆入原核表达质粒pET28b,酶切、测序鉴定。以BL21(DE3)为表达菌,在IPTG诱导下表达P17-GST融合蛋白,Ni-NTA柱纯化蛋白。红细胞凝集抑制实验分析融合蛋白模拟血型A抗原的能力。结果:成功构建P17基因和GST基因融合的原核表达质粒pET28b-P17-GST,目的基因可以高效表达,纯化的融合蛋白以浓度依赖的方式抑制A型红细胞的凝集作用。结论:血型A抗原的模拟多肽序列与GST的融合表达蛋白可特异性结合抗A抗体,具有替代血型A多糖抗原潜能,为发展新型的抗A抗体滤除材料提供了依据。