血小板冻干保存的稳定性研究

目的评价我们研究的血小板冻干技术所获得的冻干血小板的稳定性。方法我们用前期筛选出的,最优血小板预处理液配方技术所获得的冻干血小板,分别置于-20℃、4℃和室温下密封保存,选取0、10、30、90、180 d5个时间点,检测复水化后冻干血小板,以血小板回收率、MPV冻干前后差值、血小板相对聚集率,以及血小板激活后生长因子PDGF-BB、VEGF、TGF-β释放量做为评价指标。结果血小板冻干保存的稳定性研究结果显示:同一时间点,-20℃、4℃和室温3种保存温度之间,血小板回收率、相对聚集率、血小板激活后上清中VEGF和TGF-β含量,均无统计学差异(P>0.05)。结论优选配方预处理后的冻干血小板在室温下保存,与置于4℃和-20℃保存效果相当,冻干血小板室温下可以稳定保存至少6个月。

血小板冻干基础保护剂及复水液的比较分析

目的探讨适宜甘油含量血小板冻干基础保护剂和复水液。方法应用不同浓度甘油血浆/甘油生理盐水/甘油纯水作血小板冻干基础保护剂,纯水/生理盐水作复水液,比较不同血小板冻干基础保护剂渗透压值,同时比较冻干血小板复水后平均血小板体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)和回收率的差异。结果不同血小板冻干基础保护剂组间、组内渗透压值存在差异,血小板冻干基础保护剂A组、B组和C组组内随着甘油含量增高基础保护剂的渗透压值增加。不同血小板冻干基础保护剂组间、组内复水后血小板的MPV和PDW值存在差别,A1组复水后血小板的MPV值最大,C2组复水后血小板的PDW最高。不同血小板冻干基础保护剂组间、组内复水后血小板回收率存在差异,A1组冻干血小板复水后回收率最佳,尤以7%甘油血浆基础保护剂纯水复水回收率最高,达(85.5±13.7)%。结论 7%甘油血浆基础保护剂和纯水为适宜的血小板冻干基础保护剂和复水液,此为开展冻干血小板基础保护剂中添加保护剂及血小板功能活性研究奠定了基础。

人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究

为研究人血小板冻干前负载海藻糖技术与方法,筛选出最佳负载海藻糖实验条件并进一步研究血小板在温度37℃条件下、负载海藻糖4小时后的平均体积、体外激活程度和聚集反应性的变化,绘制血小板胞内海藻糖负载效率及浓度随温度、时间、胞外海藻糖浓度变化曲线,筛选合适的负载条件,分别以凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素4种物质作为血小板激活诱导剂,用血小板聚集仪分别检测血小板负载海藻糖前后的聚集反应性,用流式细胞仪检测分析血小板负载海藻糖前后其膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达率,加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后血小板激活被抑制的程度。结果表明:海藻糖负载效率与孵育时间(2小时后)、温度(30-40℃)呈良好线性关系,在37℃条件下经4小时孵育后负载效率可达60%,载入到胞内海藻糖浓度随胞外海藻糖浓度(<50mmol/L)的升高而递增;同负载前相比较,血小板平均体积(MPV)、血小板对4种激活诱导剂的最大聚集率均无显著性差别(P>0.01),经4小时负载海藻糖后血小板膜表面CD62p表达率升高,但联合添加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后CD62p表达率显著下降。结论:37℃、4小时、胞外海藻糖浓度小于50mmol/L为合适负载条件,添加可逆性血小板激活抑制剂后,冻干前负载海藻糖过程对血小板的体外激活和聚集活性没有显著影响。

血小板冻干过程对其生长因子释放量和促HUVECs增殖作用影响的实验研究

目的探讨血小板冻干过程对其释放PDGF-BB、TGF-β1、VEGF、EGF、IGF-I和FGF-b 6种生长因子及其促HUVECs增殖作用的影响。方法采用ELISA法检测冻干前新鲜PRP激活上清液和FDP激活上清液中6种生长因子的含量。用含不同浓度的FDP激活上清液、新鲜PRP激活上清液和FBS的培养基分别培养HUVECs,CCK8法检测HUVECs增殖的状态。结果 FDP上清液中TGF-β1、VEGF、EGF、IGF-I和FGF-b含量均高于新鲜PRP激活上清液,差异均有统计学意义（P〈0.05）;而PDGF-BB含量略低于新鲜PRP激活上清液,差异无统计学意义（P〉0.05）。FDP激活上清液、PRP激活上清液和FBS均可促进HUVECs的增殖;随着FDP和PRP激活上清液浓度的增高,细胞增殖作用反而降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;在5%的浓度条件下,培养48 h,FDP激活上清液促进HUVECs增殖作用高于PRP激活上清液和FBS,差异有统计学意义（P〈0.05）;培养24 h和72 h,FDP激活上清液、PRP激活上清液和FBS促进HUVECs增殖作用无统计学差异（P〉0.05）。结论 FDP具有优于新鲜PRP释放生长因子的能力;FDP激活上清液促HUVECs增殖作用优于PRP激活上清液,与FBS具有可比性。

血小板冻干再水化的形态结构与凋亡

目的探讨冷冻干燥法对血小板的细胞形态、超微结构和细胞凋亡的影响。方法以新鲜血小板为对照,以保存30d后再水化的冻干血小板为实验对象,分别在倒置相差显微镜和透射电镜下观察血小板的细胞形态和超微结构,用流式细胞仪(FCM)检测血小板凋亡率,并以1×103U/L凝血酶为诱导剂检测再水化血小板的聚集活性。结果与新鲜血小板相比,冻干再水化后的血小板在形态上为圆盘状,未见有明显的细胞聚集,仅细胞透光性相对较弱;超微结构上也无明显变化,其内部基本结构清晰可辨,细胞膜、细胞器及分泌颗粒的包膜保持完整。新鲜血小板的细胞早期凋亡率为(0.44±0.19)%,显著低于冻干血小板的细胞凋亡率(3.25±1.68)%(P<0.05)。冻干再水化血小板的最大聚集率为(93.28±2.3)%。结论冻干再水化的血小板形态结构完整,细胞内超微结构完好,为本实验室成功建立血小板冻干保存方法提供了依据。

冻干富血小板纤维蛋白在造口周围溃疡治疗中的临床应用

目的:观察冻干富血小板纤维蛋白(Lyophilized platelet-rich fibrin,LPRF)在造口周围溃疡中的治疗效果。方法:选择2018年7月-2020年4月笔者医院收治的40例造口周围溃疡患者,按照随机数字表法分为LPRF组和对照组。对照组给予常规换药治疗;LPRF组抽取新鲜外周血经离心、冷冻干燥等处理得到LPRF,辐照灭菌处理后,填充至造口周围溃疡创面,无菌防水敷料贴覆盖。两组均外附造口袋,5~7 d后换药观察创面愈合情况。结果:治疗14 d后,LPRF组创面缩小面积大于对照组(P<0.05);LPRF组创面愈合时间短于对照组(P<0.05)。结论:LPRF可以促进造口周围溃疡创面愈合,为临床解决相关问题提供了新的治疗手段。

冻干血小板及衍生制品应用的研究进展

血小板为血液系统重要组成部分。浓缩血小板及其衍生制品种类较多,其中富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)、生长因子(growth factors,GFs)以及富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)等已广泛应用于临床。冻干血小板(lyophilized platelets,Lyo-P or freeze-dried platelets,FDP)由浓缩血小板冷冻干燥制备而成,冻干后具有常温下保存时间长、质量轻、便于运输、灭活病原体等优点。Lyo-P含有高浓度GFs、纤维蛋白、白细胞以及多种细胞因子等,除具止血和促凝功能外,Lyo-P及其制品越来越多应用于创面愈合、组织修复、美容及生殖医学等领域。

富血小板纤维蛋白对牙龈成纤维细胞生物学功能的影响

目的:探究冷冻干燥富血小板纤维蛋白(freeze-dried platelet-rich fibrin, FD-PRF)对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts, hGFs)功能的影响以及其抗菌性能,为口腔黏膜炎的防治提供新思路。方法:采用流式细胞术、CCK-8检测细胞增殖(cell counting kit-8,CCK-8)、细胞划痕和Transwell实验,检测FD-PRF对hGFs细胞周期、增殖和迁移的影响;采用倾注平板法和振荡培养法研究FD-PRF的抗菌作用。结果:CCK-8实验结果表明,随着FD-PRF浓度升高,hGFs的细胞数量显著增加。细胞周期结果显示,S-G2/M期的细胞比例:5%FD-PRF组>1%FD-PRF组>对照组,而G0-G1期细胞则相反。迁移实验结果显示,FD-PRF显著提升了hGFs的迁移速度。抗菌实验结果显示,FD-PRF组相比于对照组的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌数量明显减少。结论:FD-PRF促进hGFs进入细胞分裂期,进而促进细胞增殖。FD-PRF促进hGFs迁移。此外,本研究还证实FD-PRF具有一定的抗菌性。提示FD-PRF可以促进口腔黏膜炎的愈合。

冻干血小板运用于SD大鼠出血模型止血效果的初步研究

目的观察冻干血小板(FDP)对SD大鼠肝出血模型和股静脉出血模型的止血效果。方法将30只SD大鼠分别标号后随机分成3组,每组10只,分别为FDP组,云南白药组,空白对照组,每只大鼠均制作肝损伤出血和股静脉出血模型。以止血时间和出血量为监测指标,观察FDP的止血效果。结果方差分析结果显示,在肝损伤出血和股静脉出血模型中,FDP组的止血时间和出血量均明显少于空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.01);FDP组与云南白药组比较,2组间的止血时间和出血量均无统计学差异(P>0.05)。结论 FDP具有稍优于与云南白药的止血作用,将来它有可能作为1种止血药应用于临床。

冻干血小板对SD大鼠烫伤创面的修复作用研究

目的探讨冻干血小板对SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型创面愈合的影响。方法将40只SD大鼠(雄性)随机分成4组(n=10):冻干血小板(FDP)组、新鲜血小板(FPRP)组、烫伤膏组、生理盐水组。采用煮沸砝码加压法建立大鼠深Ⅱ度烫伤模型,分组给药,1次/d,连续20 d。记录动物烫伤模型创面愈合情况并做组织学检查。结果给药至d7,4组大鼠烫伤创面愈合率分别为:FDP组(41.27±5.90)%、FPRP组(41.62±13.93)%、盐水组(33.52±14.58)%、烫伤膏组(33.58±10.89)%,FDP组和FPRP组创面愈合率明显高于烫伤膏组和生理盐水组(P<0.05);病理组织学检查:给药d7、d21,冻干组和新鲜组对大鼠烫伤创面皮肤病理的修复作用明显优于烫伤膏组及盐水组,而这2组血小板组间比较无明显差异。结论冻干血小板促进大鼠烫伤模型创面早期愈合作用与新鲜血小板相近。

冻干血小板再水化后聚集

本研究旨在观察冻干血小板再水化后聚集反应性变化。以4种不同浓度的凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原作诱导剂,使用APACT2型血小板聚集仪,检测冻干再水化和新鲜血小板的最大聚集率,以ADP为诱导剂,检测胞内外海藻糖对再水化冻干血小板最大聚集率的影响。结果表明当凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1U/ml、1.6mg/ml、20μmol/L、2μg/ml时,新鲜血小板最大聚集率达100%左右,冻干再水化血小板最大聚集率分别达(70.17±7.36)%、(15.3±2.81)%、(68.67±6.86)%、(64.67±11.6)%。胞内外海藻糖组、胞外海藻糖组、空白对照组冻干再水化血小板最大聚集率分别达(66.0±4.69)%、(25.3±2.42)%、(11.5±1.87)%(P<0.01)。结论凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1U/ml、1.6mg/ml、20μmol/L、2μg/ml可作为血小板聚集实验的合适浓度,胞内外海藻糖使冻干再水化血小板最大聚集率显著提高。

不同冷冻温度、时间对冻干血小板回收率和残留水的影响

目的探讨不同冷冻温度、时间对冻干血小板回收率及残留水的影响。方法依据温度、时间不同的冻干流程分3组(A组、B组和C组),分别进行血小板冻干、复水试验。用干燥称重的方法检测冻干血小板残留水含量,比较不同冷冻温度、时间对冻干血小板回收率和残留水的差异,同时比较不同冷冻温度、时间冻干血小板复水后MPV、PDW的差异。结果不同冷冻温度、时间条件下,冻干前与冻干复水后血小板MPV结果的差异均无统计学意义(P>0.05);冻干前与复水后血小板PDW结果比较,A组和C组的差异均无统计学意义(P>0.05),而B组冻干复水后血小板PDW高于冻干前血小板PDW,且差异有统计学意义(P<0.05);A组、B组和C组冻干血小板复水回收率分别为(81.72±12.43)%、(81.40±8.79)%和(94.37±7.02)%,3组冻干血小板复水回收率的差异均无统计学意义(P>0.05);A组、B组和C组冻干血小板残留水分别为(6.55±0.96)%、(7.10±1.20)%和(5.18±0.89)%,3组冻干血小板残留水含量的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 3组不同冻干温度、时间冻干血小板残留水、复水回收率相比,选择C组血小板冻干流程为后续研究血小板冻干程序,为血小板冻干流程的建立奠定基础。

联合使用冻干血小板和冷沉淀对糖尿病难治创面的愈合作用

本文旨在研究联合使用冻干血小板和冷沉淀对糖尿病难治创面的愈合作用。首先,选择健康雄性小鼠作为研究对象,制作糖尿病难治创面模型。随后,分别将冻干冷沉淀、冻干血小板、冻干血小板和冻干冷沉淀联合作用于创面,作用5、10、15和20天后观察难治创面的再上皮化速率;作用第15天后收集创面组织并检测血管内皮生长因子、一氧化氮合酶和一氧化氮的表达量。结果表明,FDP组,FDC组和FDP-FDC联合组的再上皮化速率以及血管内皮生长因子、一氧化氮合酶和一氧化氮的表达量均显著高于糖尿病模型组,且FDP与FDC联合组对糖尿病难治创面的愈合效果显著高于FDP组或FDC组。因此,联合使用冻干血小板和冷沉淀对糖尿病难治创面具有较好的促愈合作用。

冻干血小板再水化后稳定性的实验研究

目的探讨冻干血小板再水化后的稳定性变化。方法使用血细胞计数仪测定冻干血小板再水化后细胞计数回收率,以及在室温条件下随放置时间的不同,胞内外海藻糖浓度变化的趋势。结果冻干血小板再水化后,细胞计数回收率在8h内保持稳定。胞外海藻糖浓度为30mM和1%人血清白蛋白混合物,可使冻干血小板回收率显著提高(P<0.01)。结论负载海藻糖的冻干血小板再水化后8h内仍保持较好的稳定性,海藻糖可使冻干再水化血小板的稳定性显著提高。

冻干血小板和冻干冷沉淀在新西兰白兔耳动脉出血中的应用分析

目的建立新西兰白兔耳动脉出血动物模型,探讨冻干血小板(FDP)和冻干冷沉淀(FDC)在新西兰白兔耳动脉出血中的止血效果。方法新西兰白兔32只,随机分为4组:FDP组、FDC组、冻干血小板及冻干冷沉淀联合组(FDPC)及空白对照组(BC),每组8只,建立耳动脉出血模型,并将止血材料敷于新西兰白兔出血创面,观察各组的止血时间及失血量。结果对于耳动脉出血,各组均可止血,FDP组、FDC组及FDPC组的止血时间和出血量均明显少于BC组,差异有统计学意义(P<0.05);而FDP组与FDC组间止血时间及失血量差异显著(P<0.05);与单独使用FDP或FDC相比,FDPC组止血时间显著性缩短,失血量明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 FDP和FDC联合使用对新西兰白兔耳动脉出血具有更显著的止血效果。

冻干血小板在促SD大鼠急性创面愈合中的实验研究

目的建立SD大鼠急性创伤模型,探讨冻干人血小板（Freezing-dried Platelets,FDP）对SD大鼠急性创伤的促愈合作用。方法 SD大鼠60只,在每只大鼠背部脊柱两侧各剪下2个直径为1.2 cm的圆形全层皮肤。将每只大鼠背部4个创面分配到4个组：FDP组、新鲜血小板（platelet rich plasma,PRP）组、重组型人表皮生长因子（Recombinant human epidermal growth factor,rh EGF）组和空白对照组（blank control,BC）。分别于造模后即刻给予FDP（0.85 m L/cm2）、PRP（0.85 m L/cm2）、rh EGF（0.5 m L/cm2）和凡士林纱布进行治疗,每间隔两天清洗伤口后更换敷料。于d5、d7、d10、d14肉眼观察、拍照,并记录创面愈合情况,计算创面愈合率,取各时间点创缘新生皮肤组织进行HE染色、Masson三色染色和CD34免疫组化三项病理学实验,并进行相关统计分析。结果肉眼观察各组大鼠创面均随治疗时间延长而趋于缩小,4个重点观测点得出的综合创面愈合率排序为PRP〉FDP〉rh EGF〉BC组。治疗d5的创伤愈合率相近,没有显著差异;d7,PRP组、FDP和rh EGF组的愈合率均高于BC组,差异有统计学意义（P〈0.05）,前三组组间差异没有统计学意义（P〉0.05）;d10时,前3组的愈合率均高于BC组,差异有统计学意义（P〈0.05）;组间比较,PRP组创面愈合率高于FDP和rh EGF组（P〈0.05）。d14,组间的创面愈合率没有明显差异。3种组织细胞学观察炎性细胞浸润、胶原纤维生成、血管生成增生和再上皮化等病理结果显示：FDP与PRP同样能缩短创伤愈合炎症期、促进胶原纤维的生成、加快血管生成、促进肉芽组织生长,从而促进急性创伤组织的修复作用。结论 FDP具有与新鲜血小板相近的促进SD大鼠急性创面愈合的作用,并具有优于单一生长因子（rh EGF）的促愈合效果。

冻干血小板用于动物创面治疗的初步安全性评价

目的对冻干血小板FDP用于动物创面愈合的治疗做初步安全性评价。方法 FDP单次皮肤刺激试验选择10只SD大鼠,采用自身对照,背部左侧皮肤为实验组:用棉签涂抹0.6 m L复水化FDP;右侧为空白对照组:涂抹0.6 m L生理盐水;于涂抹后1、24、48及72 h观察2组大鼠涂敷区皮肤是否出现红斑、水肿等刺激反应。重复给药毒性试验选择32只新西兰白兔建立皮损模型,随机均分为实验组与空白对照组,前者每天涂抹复水化FDP 0.6 m L/次,后者每天涂抹生理盐水0.6 m L/次,连续涂抹28 d,观察1次/d,测体重1次/周,于涂敷前及涂敷d7、d14、d21、d28分别采集动物血样检测血常规和相关生化指标,并取涂敷区皮肤组织行组织病理学检查。结果单次皮肤刺激试验:2组大鼠皮肤均未出现水肿、红斑等刺激反应。重复给药毒性试验:试验周期中2组动物均未出现体重减轻、一般行为异常及死亡,体重、血常规及生化指标检测结果相近(P>0.05),FDP组动物在实验d7 d14、d21及d28的WBC(×109/L)分别为12.20±1.28 vs 8.63±1.71 vs 6.90±1.21 vs 7.60±1.36(P<0.05);2组动物组内不同时间点的Cr波动明显(P<0.01)。组织病理学检查:2组受试动物涂敷区局部皮肤未见明显组织病理学改变。结论FDP对实验动物没有明显的刺激反应,对动物局部损伤皮肤连续涂敷28 d未见明显毒性反应,其作为外敷生物制剂的初步安全性评价合格。

冻干血小板保护液优化的实验研究

目的优化冻干血小板保护液,减少冻干过程对血小板的损害,有效保护其功能。方法采用3因素3水平的正交设计法,对血小板膜保护剂、血小板激活抑制剂、蛋白质类保护剂的3类成分组成的保护液进行优选。检测血小板最大聚集率、血小板活化标志PAC-1、CD62P的阳性表达率和血小板回收率,通过比较其差异,筛选出本实验的最优冻干血小板保护液。以优化保护液对血小板处理后进行冻干,并以此为实验组,与新鲜血小板和原保护液处理后冻干血小板进行比较验证,验证指标与优选指标相同,比较3者4项指标之间的差异。结果正交设计试验结果显示：血小板最大聚集率组间最高（74.33±24.01）%,血小板活化标志PAC-1和CD62P低于9组平均水平,血小板回收率高于9组平均水平。以主要体现血小板功能的血小板最大聚集率为优先指标,结合其余3项检测指标进行综合分析,在原保护液的基础上,筛选出添加了2%DMSO、第2信使调节剂、2 mmol/L维生素B6,75%的PPP保护液组为最优组合。验证实验结果显示,优化保护液组血小板最大聚集率（76.12±6.02）%,与原保护液组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）,与新鲜血小板组相比,差异没有统计学意义（P〉0.05）。最优保护液组血小板激活标志PAC-1和CD62P阳性表达率分别为（3.23±0.49）%和（36.83±8.21）%,2者与原保护液组、新鲜血小板组相比,差异无统计学意义（P〉0.05）;最优保护液组冻干血小板复水化后血小板回收率为（85.90±2.24）%,与原保护液组相比,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论本实验优化的血小板保护液优于原保护液,明显提高了冻干血小板复水化后最大聚集率,能更好地保护血小板的功能,但对血小板冻干过程的保存损害问题没有得到更好的改善,有待下一步深入研究。

冻干血小板制备技术的研究要点

本文介绍了近年来冻干血小板制备过程中几个关键问题的研究进展,包括冻干前预处理时不同保护剂、激活抑制剂,冻干过程中参数和冻干后复水方式的技术要点,及冻干血小板在应用方面的初步进展。

二甲亚砜对血小板冻存中功能保护作用的实验研究

本研究探讨二甲亚砜(DMSO)对血小板冻干保存中激活的抑制作用。以CD62p和PAC-1表达作为血小板的激活标志,CD62p和PAC-1再表达和血小板最大聚集率作为评价血小板功能的指标。对血小板经离心、洗涤及海藻糖负载等预处理过程中加与不加DMSO的实验组,分别进行血小板膜表面糖蛋白CD62p和PAC-1表达及再表达的流式细胞术(FCMs)分析,血小板最大聚集率和血小板平均体积(MPV)的测定,研究DMSO对血小板激活抑制作用的可逆性。结果显示,血小板经预处理后,不含DMSO组的CD62p和PAC-1表达率显著增高,分别达30.37%和15.01%;含DMSO的组,CD62p表达率为10.72%,PAC-1几乎不表达(0.11%),显著低于不含DMSO组(p<0.01)。DMSO稀释后,血小板CD62p再表达为54.39%,显著低于对照组(71.69%)和高于不含DMSO组(35.98%)(p均<0.01);PAC-1再表达率为49.28%,与对照组(54.48%)无显著差异,显著高于不含DMSO组(p<0.01)。在含DMSO组,血小板用原血浆稀释后,血小板聚集功能恢复,对restocetin,thrombin和propylgal late诱导的血小板聚集率分别为92.76%,91.24%和89.66%,与对照组和无DMSO组比无显著性差异,对ADP诱导的聚集率有34.33%,显著高于无DMSO组(p<0.01),但仍显著低于对照组(p<0.01)。结论:DMSO对体外处理所致的血小板膜表面CD62p和PAC-1表达具有抑制作用,且该抑制作用是可逆的,DMSO稀释后血小板仍具有CD62p和PAC-1表达能力和聚集反应功能,提示DMSO具有抑制激活损伤和低温保护的双重功能,这一生物学特性使DMSO在血小板的冻干保存中发挥重要作用。