不同激活条件下血小板来源的细胞外囊泡的生物学特征分析

目的探究不同激活条件对血小板来源的细胞外囊泡(platelet-derived extracellular vesicles,PEVs)的粒径分布、浓度、蛋白质浓度和含量的影响。方法采集健康志愿者全血经离心分离制备血小板悬液,将其随机均分为6组,其中1组为自身对照,其余5组分别采用胶原、二磷酸腺苷、凝血酶、钙离子载体、反复冻融法激活血小板,超速离心法提取外泌体和微囊泡,Western-blot法检测血小板来源标志物(CD41)、外泌体阳性标志物(CD9、CD81及TSG101)和阴性标志物(Calnexin),经透射电镜和纳米流式仪分别对PEVs进行形态观察、粒径分布和浓度检测,并检测PEXOs的蛋白质浓度及含量。结果外泌体均表达CD9、CD81、TSG101,不表达Calnexin,外泌体和微囊泡均表达CD41;透射电镜观察外泌体呈双层膜的杯托状结构,而微囊泡表现为较不规则的膜状结构;纳米流式结果显示85%~95%的外泌体<100nm,87%~94%的微囊泡分布在100~300nm。反复冻融组的外泌体和微囊泡浓度(205.67±65.27、102.73±15.48)都高于对照组(4.83±2.79、0.76±0.21)和其他实验组,差异具有统计学意义(P<0.05),钙离子载体组的外泌体和微囊泡浓度(44.42±17.07、11.4±4.81)仅次于反复冻融组,高于对照组及其他3个实验组(P<0.05)。不同激活条件下PEVs在同一粒径分布范围的数量存在差异。反复冻融组PEXOs蛋白质浓度(1.11±0.51)高于对照组(0.32±0.39)、ADP组(0.41±0.31)和凝血酶组(0.38±0.37)(P<0.05),而其蛋白质含量(125.40±58.32)高于对照组(25.53±25.96)和其他3个实验组(ADP组37.21±15.73、凝血酶组36.28±24.18、钙离子载体组47.09±23.29)(P<0.05)。结论血小板的激活条件影响PEVs的生物学特征,不同激活条件诱导的外泌体包裹蛋白质的能力可能和粒径大小密切相关。反复冻融法可以诱导血小板释放高浓度的细胞外囊泡,可能是一种理想的PEVs制备方法。

不同激活条件下血小板来源的细胞外囊泡的蛋白组学研究进展

活化的血小板可以分泌大量生物活性分子和细胞外囊泡,血小板来源的细胞外囊泡(platelet-derived extracellular vesicles, PEVs)富含丰富的蛋白质,参与细胞间通讯和物质交换,不仅在凝血与止血过程中起重要作用,还在先天与后天免疫、组织修复等过程中发挥重要功能。近年来,在PEVs的分离、表征和应用研究上已取得许多进展,不同激活条件下PEVs的蛋白组学特征存在差异,这可能是影响其生物学功能的重要因素。本文对不同激活条件下PEVs的蛋白组学特征及其功能研究进展进行了综述。

血小板来源的细胞外囊泡与疾病的研究进展

血小板是从巨核细胞释放的小而无核的细胞,主要功能是止血,调节炎症,促进血栓形成,促进肿瘤的增殖、侵袭、转移以及调节免疫等,血小板活化是其发挥作用的关键,研究表明这些功能与血小板活化后释放的细胞外囊泡有关。血小板活化后释放的细胞外囊泡包括微粒和外泌体,均表现出原细胞的特性,细胞外囊泡是一种非均匀的纳米级小泡,携带遗传物质(微小RNA、信使RNA等)、酶、蛋白质和小分子,介导细胞通讯。该文就血小板来源的细胞外囊泡与疾病的相关研究进行综述,揭示其作为疾病标志物、靶向治疗的潜能。

富血小板血浆来源的血小板细胞外囊泡分离技术与应用

背景:血小板细胞外囊泡是循环中最丰富的囊泡,富含丰富的生物活性分子、遗传物质及蛋白质等信息分子,参与细胞通讯和物质交换,不仅具有良好的促凝活性,还具有促进组织修复和再生的巨大潜力,在再生医学具有广泛的应用前景。目的:从血小板细胞外囊泡的分泌机制、在再生医学领域的应用及临床转化的限制因素进行阐述,为血小板细胞外囊泡的临床转化提供一些理论支撑。方法:应用计算机检索2005年1月至2023年8月PubMed数据库与血小板细胞外囊泡有关的文章,英文检索词为“platelet-derived,plateletrich plasma,extracellular vesicles,isolated,microvesicles exosomes,applications”,最后纳入符合主题标准的文献62篇进行综述分析。结果与结论:(1)活化的血小板细胞外囊泡可产生血小板微囊泡和血小板外泌体两种类型的囊泡,前者的分泌可能与肌动蛋白细胞骨架的不对称性相关,后者的分泌可能与H^(+)-ATP酶的调节相关。(2)血小板细胞外囊泡是血小板浓缩物和血小板本身的潜在效应物,可能通过促进血管生成、影响细胞行为、促凝与止血以及发挥炎症作用等几方面影响组织再生。(3)血小板细胞外囊泡在组织损伤、肌肉再生、软骨再生、骨关节炎等再生医学领域已有临床前报道,作为伤口愈合的潜在治疗方法已有临床试验数据,但血小板细胞外囊泡的分离方法、样本来源以及激活剂的种类等因素限制了血小板细胞外囊泡在再生医学领域的临床转化。(4)未来血小板细胞外囊泡可能成为再生医学中替代富血小板血浆的无细胞疗法,其临床转化还需要积极寻找鉴别血小板细胞外囊泡和血小板外泌体的特异性标志物,在激活剂刺激血小板细胞外囊泡产生的机制以及血小板细胞外囊泡的最佳收集方式、最佳储存方法、保质期限、临床应用的推荐剂量和最佳临床适应证还需要继续深入研究。

外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡促进神经元轴突的伸长

背景:神经元轴突损伤可致神经功能障碍,促进轴突伸长有望在神经系统疾病治疗中发挥重要作用。目的:探究外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡(ectomesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles,EMSC-EVs)能否促进神经元轴突伸长。方法:(1)组织贴壁法获取鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞,免疫荧光鉴定特异性标志物;超速离心法获取EMSC-EVs并进行鉴定;(2)EMSC-EVs(0,0.5,1.0,1.5 mg/mL)与PC12细胞共孵育72 h,CCK-8分析EMSC-EVs对PC12细胞的细胞毒性及增殖作用;(3)EMSC-EVs(1.0 mg/mL)与PC12细胞或神经元共孵育72 h,显微镜下观察轴突长度变化,实时荧光定量PCR及Western blot分析轴突相关标志物微管蛋白β3(早期)、生长相关蛋白43(中期)和神经丝蛋白200(成熟)表达变化,以探究EMSC-EVs是否能够促进PC12细胞或神经元轴突伸长。结果与结论:(1)所获取外胚层间充质干细胞大部分呈长梭形,少数呈不规则形,高表达间充质干细胞特异性标记物Nestin、CD44及Vimentin;所获取EMSC-EVs符合细胞外囊泡的生物学标准;(2)在0.5-1.5 mg/mL质量浓度范围内,EMSC-EVs促进PC12细胞增殖,且随浓度增加而增强;(3)EMSC-EVs促进PC12细胞及神经元轴突长度增加,促进轴突相关标志物微管蛋白β3、生长相关蛋白43和神经丝蛋白200的表达。这些结果说明,EMSC-EVs能够促进神经元轴突伸长。

血小板来源的细胞外囊泡在乳腺癌中的作用

血小板来源的细胞外囊泡(platelet-derived extracellular vesicles,PEVs)是血小板被激活或凋亡后产生的直径为40 nm~1μm的亚细胞双层膜结构,是血浆中含量最丰富的囊泡。PEVs中包括各种生物活性分子,广泛参与包括血栓与止血、免疫应答与炎症、血管生成与伤口愈合以及肿瘤发生发展与转移在内的多种生理病理过程。在乳腺癌患者中,PEVs水平明显升高,且与肿瘤分期密切相关。PEVs可能通过多种分子机制及信号通路影响乳腺癌细胞诸如生长、侵袭在内的多种生物行为,且对肿瘤微环境、免疫调节、血管生成等过程产生影响。本文对血小板来源细胞外囊泡与乳腺癌发生发展中的研究进展进行简要综述。

间充质干细胞及其衍生细胞外囊泡靶向巨噬细胞干预自身免疫性疾病

背景:巨噬细胞是机体固有免疫的重要组成部分,当机体内环境发生改变时巨噬细胞可以产生不同的极化表型,并发挥相应的炎性免疫作用。间充质干细胞能够分泌较多数量的细胞外囊泡到机体内环境中,具有细胞间信号传导及免疫调节功能。研究表明,间充质干细胞及间充质干细胞来源细胞外囊泡可以影响巨噬细胞M1/M2极化平衡,从而治疗机体免疫炎症性疾病。目的:探讨间充质干细胞及其来源细胞外囊泡通过调节巨噬细胞极化来干预自身免疫性疾病的信号机制,以及工程化细胞外囊泡在此领域的相关研究进展。方法:第一作者检索PubMed、中国知网等数据库自建库到2024年6月发表的相关文献,以“间充质干细胞,细胞外囊泡,外泌体,凋亡小体,凋亡囊泡,巨噬细胞极化,M1极化,M2极化,自身免疫性疾病,多发性硬化,类风湿性关节炎,系统性红斑狼疮,1型糖尿病,炎症性肠病,自身免疫性泪腺炎,工程化细胞外囊泡,工程化外泌体,药物递送”为中文检索词;以“macrophage polarization,M1 macrophage,M2 macrophage,autoimmune disease,type 1 diabetes,multiple sclerosis,rheumatoid arthritis,systemic lupus erythematosus,autoimmune dacryadenitis,inflammatory bowel disease,mesenchymal stem cells,extracellular vesicles,engineered extracellular vesicles,engineering exosomes,drug delivery”为英文检索词,阅读每篇文献的文题、摘要进行初筛,最终筛选出70篇文献进行归纳分析。结果与结论:①间充质干细胞可以通过释放或间接作用于功能性蛋白来调节M1/M2极化;②间充质干细胞可以通过作用于炎症小体调控巨噬细胞M2极化;③间充质干细胞可以与常用药物组合以增强药物疗效;④间充质干细胞受到炎性刺激后可以调控细胞外囊泡的释放影响巨噬细胞极化;⑤间充质干细胞来源细胞外囊泡可以通过PTEN、NOTCH、核因子κB、Toll样受体、PI3K/AKT等通路靶向巨噬细胞极化调节自身免疫性疾病;⑥工程化细胞外囊泡可以实现非侵入式靶向给药,延长药物半衰期,推动外泌体口服给药,减轻移植物异体反应,提高中草药生物利用度并攻克血脑屏障,开辟了一条药物递送新路径。

植物源外泌体样纳米囊泡刺激成骨细胞、抑制破骨细胞并促进成骨

背景:骨质疏松症易引发病理性骨折且严重影响患者的生活质量,植物源外泌体样纳米囊泡在调节骨质疏松症骨平衡方面发挥着重要作用。目的:综述不同植物源外泌体样纳米囊泡在骨质疏松症治疗中的研究现状与展望。方法:通过计算机在PubMed、Web of Science、中国知网中检索1995年1月至2024年3月发表的相关文献,以“osteoporosis,plant-derived exosome-like nanovesicles,exosomes,osteoblasts,osteoclasts”为英文检索词,以“骨质疏松症,植物源外泌体样纳米囊泡,外泌体,成骨细胞,破骨细胞”为中文检索词,最终纳入53篇文献进行分析。结果与结论:植物源外泌体样纳米囊泡具有生物相容性、低毒性和天然靶向性等优点,这些特性不仅确保了其在体内的稳定存在与有效作用,还避免了不必要的免疫反应,为长期治疗策略的设计奠定了基础。植物源外泌体样纳米囊泡可以通过刺激成骨细胞增殖、抑制破骨细胞分化以及促进成骨-抑制破骨双重作用抗骨质疏松症;此外,部分植物源外泌体样纳米囊泡因具有骨靶向性,未来或将成为新型示踪靶标和治疗方案广泛应用于骨质疏松症治疗过程中。

细胞外囊泡在口腔鳞状细胞癌诊疗中的作用

背景:细胞外囊泡在不同的生理和病理生理条件下由多种细胞类型(包括肿瘤细胞)分泌到细胞外环境中,存在着广泛的生物学信号及细胞之间的信号传导。肿瘤衍生的细胞外囊泡可能会加剧癌症的进展、存活、侵袭和促进血管生成。目的:综述细胞外囊泡在口腔鳞状细胞癌诊疗中的研究进展。方法:由第一作者在Pub Med、万方和中国知网数据库中进行文献检索,关键词为“EVs,Oral squamous cell carcinoma,Diagnosis and treatment,Biopsy,Tissue engineering”及“细胞外囊泡,口腔鳞状细胞癌,诊疗,活检,组织工程”,最终纳入63篇文献进行分析。结果与结论:(1)在口腔鳞状细胞癌唾液活检中,细胞外囊泡作为肿瘤细胞与周围微环境间的信息传递工具,携带包括可溶性蛋白、脂质、DNA和RNA在内的多种生物分子,对口腔鳞状细胞癌的进展起着至关重要的作用,这些微小囊泡不仅在肿瘤的生长和扩散中扮演着关键角色,还提供了有关肿瘤生物学特性的重要信息。(2)唾液活检作为一种非侵入性诊断方法,通过分析其中的细胞外囊泡,可以为口腔鳞状细胞癌的早期诊断和靶向治疗开辟新的可能性。(3)研究发现,细胞外囊泡内含的生物活性分子,如micro RNAs(mi RNAs)和特定蛋白质,能作为口腔鳞状细胞癌的生物标志物,提高早期诊断的准确性。细胞外囊泡中的特定蛋白质如EHD2,CAVIN1,PF4V1和CXCL7等显示了作为新型预测性生物标志物的潜力。(4)此外,文章还强调了细胞外囊泡在口腔鳞状细胞癌治疗中的应用潜力,通过工程化改造,细胞外囊泡可以作为新一代纳米级药物输送系统,增强肿瘤靶向治疗的效率和特异性。(5)未来的研究将进一步深入探索细胞外囊泡在口腔鳞状细胞癌治疗中的作用及其机制,有望改善患者的生存率和生活质量。

独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响

背景:独活寄生汤是治疗类风湿关节炎的经典方剂,但具体作用机制尚不清楚,细胞外囊泡具有细胞间通讯及传递信号的强大功能,可能是该方剂发挥作用的信号载体。目的:探讨独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。方法:肿瘤坏死因子α体外诱导构建类风湿关节炎滑膜成纤维细胞模型,实验分为5组:正常组、模型组、独活寄生汤含药血清组、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡组、生理盐水血清细胞外囊泡组。采用CCK-8法筛选独活寄生汤含药血清及独活寄生汤含药血清细胞外囊泡作用的最佳浓度及时间;ELISA检测细胞上清炎症因子水平;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力及迁移能力;Hoechst染色检测细胞凋亡情况;qRT-PCR及Western blot检测细胞凋亡相关基因及蛋白表达。结果与结论:(1)独活寄生汤含药血清作用的最佳体积分数为10%,独活寄生汤含药血清细胞外囊泡作用的最佳质量浓度为10 ng/mL,二者作用的最佳时间均为24 h;(2)与模型组相比,独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡均能抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的炎症因子表达(P<0.05)、划痕愈合(P<0.05)、迁移及侵袭(P<0.05),且独活寄生汤含药血清细胞外囊泡的抑制作用更为突出(P<0.05);(3)独活寄生汤含药血清及独活寄生汤含药血清细胞外囊泡均可促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的凋亡;(4)与模型组相比,独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡均可增加促凋亡因子Caspase-3、Caspase-9、Bax表达(P<0.05),降低抑凋亡因子Bcl-2表达(P<0.05),且独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对凋亡相关因子的调节作用更显著。上述实验结果表明独活寄生汤含药血清细胞外囊泡可以抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的过度增殖、迁移、侵袭并促进其凋亡。

单采血小板不同储存期细胞外囊泡含量变化、储存损伤与临床疗效的研究

目的分析单采血小板不同储存期细胞外囊泡的含量变化,跟踪患者的细胞外囊泡和输注疗效,探讨血小板细胞外囊泡在单采血小板储存损伤和输注疗效间存在的机制。方法对本站2022年11月—2024年4月采集的85份单采血小板使用流式细胞仪检测采集当天和输注前的血小板细胞外囊泡含量,观察储存d1-5血小板细胞外囊泡的含量变化,并选择急性白血病患者为输注对象,跟踪其输注前血小板计数和血小板细胞外囊泡的含量,输注后24 h内检测血小板计数、血小板细胞外囊泡的含量和临床疗效,分析探讨血小板细胞外囊泡与储存损伤和临床输注疗效的机制。结果单采血小板输注前的细胞外囊泡含量(8.73±4.84)明显高于采集当天血小板细胞外囊泡含量(5.11±3.33),差异有统计学意义(P<0.01)。单采血小板储存d2~5血小板细胞外囊泡含量增加值依次为(2.55±1.38,3.49±2.63,3.86±3.55,4.50±3.91),差异有统计学意义(P<0.05)。患者输血后血小板细胞外囊泡含量与输血前细胞外囊泡含量及输注时单采血小板血袋内细胞外囊泡含量呈正相关,差异有统计学意义(P<0.001)。输注单采血小板85例,有效输注61例CCI值为(13.43±4.70),无效输注24例CCI值为(2.27±3.67),差异有统计学意义(P<0.001)。输注不同储存期的单采血小板后,患者输注有效率d2-5依次为(88.89%、68.42%、68.18%、57.14%),对应的CCI值为(11.18±6.10,10.43±6.77,9.53±6.75,9.48±8.86),CCI组间差异无统计学意义(P>0.05)。患者输血前和输血后血小板细胞外囊泡含量与输注疗效CCI无显著性相关(P>0.05)。单采血小板输注前血小板细胞外囊泡含量与输注疗效CCI无显著性相关(P>0.05)。结论单采血小板细胞外囊泡含量随储存时间延长而增加,可作为潜在储存期内的血液质量评价监测指标,但与输注疗效CCI无显著性差异。

间充质干细胞及细胞外囊泡修复子宫内膜损伤

背景:子宫内膜损伤是育龄期女性常见的良性疾病,严重影响女性的生育和生殖健康。近年来,间充质干细胞及其分泌的细胞外囊泡作为一种新的治疗策略,在子宫内膜损伤修复中备受关注。目的:综述间充质干细胞及其细胞外囊泡在子宫内膜损伤治疗中的应用,全面介绍子宫内膜损伤的发病机制、治疗效果,探讨间充质干细胞及细胞外囊泡治疗子宫内膜损伤的潜力与挑战,以期为进一步的基础和临床研究提供理论依据。方法:检索中国知网和中华医学全文数据库的中文文献,检索词为“间充质干细胞,间充质干细胞来源细胞外囊泡,外泌体,子宫内膜损伤,宫腔粘连,Asherman综合征”;检索PubMed数据库中的英文文献,英文检索词为“mesenchymal stem cells,extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells,exosome,endometrial injury,intrauterine adhesion,Asherman’s syndrome”,通过人工阅读的方法,排除重复文献或与子宫内膜损伤不相关的文献,最终纳入87篇文献。结果与结论:间充质干细胞及其细胞外囊泡能够通过多种分子机制参与子宫内膜损伤的修复,如抗纤维化、促进血管生成和细胞增殖、细胞归巢、免疫调节、内膜容受性调节等,细胞和动物实验已取得大量研究成果,临床研究的初步结果也取得了一定的疗效,包括增加子宫内膜厚度、改善月经量和生育能力。但是,间充质干细胞及其细胞外囊泡治疗子宫内膜损伤的应用研究仍面临着困难和挑战。在治疗过程中,需要进一步提高间充质干细胞及其细胞外囊泡的质量和稳定性,明确其在细胞增殖、迁移、分化等过程中的调控作用。此外,还需开展大规模、多中心的临床试验,以验证间充质干细胞及其细胞外囊泡在子宫内膜损伤修复中的长期安全性和有效性,并确定最佳的治疗剂量和给药途径。随着科学技术的进步和生物工程材料的辅助应用,未来有望解决上述难题,开发出疗效更好、安全性更高的治疗手段。

系统性红斑狼疮患者血栓性事件与血浆血小板来源的细胞外微囊泡水平的关联性

[目的]探讨血小板来源的细胞外微囊泡(PEV)与系统性红斑狼疮(SLE)血栓性事件的关联性。[方法]采用横断面研究方法,纳入2019年1月—2022年4月于开滦总医院风湿免疫科就诊的SLE患者144例。收集入选患者的一般情况、实验室数据以及血栓性事件资料,采用流式细胞术检测血浆PEV。比较合并和未合并血栓性事件的SLE患者之间血浆PEV水平,并进一步将144例SLE患者分为高水平PEV组(PEV≥300.48个/μL)和低水平PEV组(PEV<300.48个/μL),比较不同PEV水平组间血栓性事件发生情况和凝血指标间的差异,采用Spearman相关分析血浆PEV与凝血指标的相关性,多因素Logistic回归分析血浆PEV与血栓性事件的关联性。[结果]合并血栓性事件的SLE患者血浆PEV水平高于无血栓性事件的SLE患者[306.65(150.98,342.75)个/μL比227.04(178.23,281.36)个/μL,P<0.01]。与低水平PEV组比较,高水平PEV组血栓性事件发生率更高(38.29%比20.61%,P<0.05)。Spearman相关分析显示,PEV与SLE患者血浆纤维蛋白原、D-二聚体水平呈正相关(r=0.799、0.6044,P=0.001、0.027)。多因素Logistic回归分析发现,外周血PEV与SLE患者总血栓性事件、动脉血栓性事件显著相关(OR=1.78、2.23,P<0.001、0.019),但与静脉血栓性事件的相关性未有统计学差异(P>0.05)。[结论]合并血栓性事件的SLE患者血浆PEV水平增高,与高凝状态和血栓性事件相关,可能是SLE患者动脉血栓性事件的有效标志物。

血小板来源的细胞外囊泡在皮肤科的研究进展

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)作为再生医学和药物递送的亚细胞疗法,近年来广受关注,而血小板作为治疗性EV的一个来源,具有独特的优势。血小板来源的细胞外囊泡(platelet extracellular vesicles,P-EV)具有抗凝、抗炎、促进细胞再生和免疫调节等作用,并具有药物递送载体的潜能,其应用的主要领域包括促进伤口愈合、血管生成,促进神经、肌肉、骨骼的生成。现对目前P-EV在皮肤再生领域的研究进展作一综述。

干细胞来源的细胞外囊泡治疗急性缺血性卒中的研究进展

急性缺血性卒中(AIS)具有致残率高、病死率高、复发率高的特点。基于细胞外囊泡的无细胞疗法,尤其是干细胞来源的细胞外囊泡(SC-EVs),由于具有与干细胞相似的再生能力及优于干细胞的血脑屏障穿透力和低免疫原性,为AIS的治疗提供了新的视角。本文将对SC-EVs治疗AIS的作用机制和临床研究进展作一述评,以期为AIS的治疗提供新的思路。

神经元来源细胞外囊泡促进神经干细胞的神经生成

背景:已有研究表明,神经干细胞能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。间充质干细胞来源细胞外囊泡被证实能够透过血脑屏障到达中枢神经损伤部位,促进神经修复。然而,神经元来源细胞外囊泡是否促进神经干细胞向有益于神经生成的方向分化,帮助神经修复,还不是很明确。目的:探究神经元来源细胞外囊泡是否有利于神经干细胞向神经生成的方向分化。方法:用胰酶消化法从新生SD大鼠大脑皮质中提取神经元和神经干细胞。收集培养神经元的细胞上清,提取神经元来源细胞外囊泡。将培养10 d的神经干细胞与神经元来源细胞外囊泡或PBS共培养7 d,采用免疫印迹、免疫荧光和RT-qPCR技术分别检测神经元、神经干细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞特异性标志蛋白的表达。结果与结论:神经干细胞与神经元来源细胞外囊泡共培养后,高表达神经元特异性蛋白β3微管蛋白、神经丝蛋白200和少突胶质细胞特异性蛋白髓鞘碱性蛋白,低表达星形胶质细胞特异性标志蛋白胶质纤维酸性蛋白。这些结果说明,神经元来源细胞外囊泡能够促进神经干细胞向神经元和少突胶质细胞分化,抑制其向星形胶质细胞分化。

辣椒来源外泌体样纳米囊泡通过ERK1/2通路拮抗巨噬细胞向泡沫细胞转化

[目的]研究辣椒来源外泌体样纳米囊泡(CDELN)抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导THP-1源性巨噬细胞泡沫化的作用机制。[方法]通过组织破碎、差速/超速离心及蔗糖密度梯度离心等步骤,分离提纯CDELN。利用ox-LDL刺激THP-1源性巨噬细胞24 h建立泡沫细胞模型,并进一步研究CDELN对巨噬细胞泡沫化的作用及其机制。采用激光共聚焦显微镜检测THP-1源性巨噬细胞对CDELN和人DiL标记乙酰化低密度脂蛋白(DiL-ac-LDL)的摄取;采用油红O染色检测细胞内胆固醇含量,通过分析细胞油红O染色阳性面积评估细胞内脂质累积影响;RT-qPCR和Western blot检测清道夫受体A(SRA)、脂肪酸转运蛋白(CD36)、凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)、ATP结合盒转运体A1/G1(ABCA1/G1)以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路p-ERK、p-p38 MAPK和p-c-Jun的mRNA和蛋白表达水平。[结果]CDELN是大小均一、具有双层膜结构、富含蛋白质和核酸的外泌体样纳米囊泡,能被巨噬细胞摄取。DiL-ac-LDL摄取实验提示CDELN可抑制巨噬细胞的胆固醇摄取。油红O染色实验提示CDELN可减轻ox-LDL诱导下的胞内胆固醇蓄积。RT-qPCR及Western blot显示,CDELN能够显著降低ox-LDL诱导的THP-1源性巨噬细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)、SRA、CD36、LOX-1的mRNA水平,以及降低p-ERK、SRA、CD36、LOX-1蛋白水平。加入p-ERK激动剂Yoda1后,CDELN的保护作用被明显逆转。[结论]CDELN可显著抑制巨噬细胞泡沫化,该作用可能与抑制MAPK通路ERK1/2的磷酸化水平有关。

不同来源的细胞外囊泡在肝细胞癌发生进展中的作用

肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌类型,也是癌症相关死亡的第三大原因,严重威胁人体健康,成为目前亟待解决的临床难题。细胞外囊泡(EV)是一种含有多种成分的膜囊泡,在HCC的发生和进展中发挥着重要作用,本文通过总结不同来源的EV对HCC的影响,分析EV对HCC的作用机制,以期为HCC的诊断及治疗提供新视角。

干细胞来源与组织来源小细胞外囊泡诱导脂肪新生的比较

背景:再生医学近几十年的发展,使胞外囊泡诱导脂肪组织再生成为修复软组织缺损的可行方法。但由于实验模型不同以及胞外囊泡使用剂量不同,目前仍无法对不同来源胞外囊泡在脂肪再生中的应用效果进行定量比较。目的:比较干细胞来源小细胞外囊泡与组织来源小细胞外囊泡在体内诱导脂肪新生的效果。方法:采用超速离心法提取脂肪干细胞来源小细胞外囊泡和脂肪组织来源小细胞外囊泡,采用纳米颗粒跟踪分析、透射电镜和Western blot鉴定比较2种小细胞外囊泡的数量、粒径、形态和标志蛋白表达;使用定制硅胶管建立C57小鼠皮下脂肪新生定量评估模型,通过细胞计数和苏木精-伊红染色比较2种小细胞外囊泡体内促进脂肪组织新生的效果。结果与结论:①通过超速离心法提取2种小细胞外囊泡,粒径均位于50-200 nm之间,在透射电镜下均为典型的圆形,均表达小细胞外囊泡的特征性蛋白CD81、CD63、TSG101;②使用定制硅胶管,将等粒子数小细胞外囊泡与Matrigel凝胶混合于硅胶管中植入小鼠背部皮下,建立小鼠体内无细胞、可定量的脂肪新生模型;③植入后3,7 d,硅胶管内容物苏木精-伊红染色和细胞计数显示,加入了小细胞外囊泡的2组都比空白对照组募集到更多的宿主细胞,且脂肪组织来源小细胞外囊泡组优于脂肪干细胞来源小细胞外囊泡组;④体内植入4周的硅胶管内容物苏木精-伊红染色显示,小细胞外囊泡促进脂肪新生,且脂肪组织来源小细胞外囊泡组优于脂肪干细胞来源小细胞外囊泡组。以上结果表明,组织来源小细胞外囊泡促进脂肪新生的效果优于干细胞来源小细胞外囊泡。

原代成骨细胞来源胞外囊泡促进破骨细胞分化

目的:观察原代成骨细胞来源胞外囊泡(OB-EV)对破骨细胞增殖、分化的作用,探究胞外囊泡参与成骨细胞和破骨细胞之间通信的可能分子机制。方法:采用酶消化法分离原代成骨细胞,并以β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松成骨诱导液诱导培养,通过碱性磷酸酶染色及茜素红S染色鉴定成骨细胞分化及矿化功能。收集成骨细胞培养上清液,采用超速离心法提取囊泡分泌物,并通过透射电镜观察囊泡形态,蛋白质印迹法鉴定胞外囊泡表面特征性标志物肿瘤易感基因101(TSG101)、ALG-2相互作用蛋白X(Alix)和分化抗原9(CD9)。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测OB-EV对RAW264.7的增殖作用。进一步通过蛋白质印迹法检测OB-EV与核因子κB受体活化因子配体(RANKL)联合作用后RAW264.7破骨分化标志物的表达水平。将OB-EV处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察并比较破骨细胞数,明确OB-EV对破骨细胞分化的影响。结果:透射电镜观察提取的OB-EV呈直径为30~150 nm的双层杯状结构,且TSG101、Alix、CD9呈阳性表达。CCK-8实验结果显示高浓度(20μg/mL以上)OB-EV抑制RAW264.7增殖(P<0.05)。蛋白质印迹法检测发现RAW264.7中c-Fos、活化T细胞核因子(NFATc1)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等破骨细胞分化标志蛋白表达明显增加,且随OB-EV浓度增加而增加(P<0.05)。此外,将OB-EV与RANKL联合作用于BMM,结果显示TRAP阳性细胞较RANKL对照组显著增多(P<0.05)。结论:OB-EV可促进破骨前体细胞向破骨细胞分化,但高浓度OB-EV会抑制细胞增殖。