重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白抗体中和活性检测方法的建立

目的:建立重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(TMP-Fc)抗体中和活性的检测方法,并应用于免疫原性研究中的样品分析。方法:基于MO7e细胞依赖于TMP-Fc增殖的活性检测方法,以及TMP-Fc的阳性中和抗体对MO7e细胞增殖的抑制作用,建立TMP-Fc抗体中和活性检测方法。结果:TMP-Fc对MO7e细胞的增殖具有促进作用,在3.2~80 ng/m L浓度范围内作用显著;阳性血清稀释率低于1/10 000时,对MO7e细胞的增殖有明显抑制作用;检测方法经优化,确定最佳血清稀释率为1/20,最佳药物浓度为16 ng/m L;实验阈值(CP)确定为23.78%。免疫原性结果显示,TMP-Fc与罗米司亭在300μg/kg剂量下中和抗体个体发生率分别为30%和40%,表明二者在免疫原性方面类似。结论:建立了一种TMP-Fc抗体中和活性检测方法,并应用于免疫原性研究的样品分析,为TMP-Fc在长期毒性实验中的免疫原性评价提供了有效的检测手段。

一种新型血小板生成素(TPO)模拟肽的合成及功能研究

为了获得具有与血小板生成素相似的生物学活性且没有其副作用的血小板生成素模拟肽 ,对一种从肽库中筛选到的血小板生成素模拟肽P1进行改构 ,运用多肽化学合成方法制备了模拟肽P2 ,然后进行P2与葡聚糖偶联以及自身氧化形成二聚体 ,利用MTT法测定其体外活性。结果表明 :所获得的血小板生成素模拟肽P2的EC5 0值较P1提高了 70 0倍 ,达到了 2 0nmol/L ,P2与葡聚糖偶联产物D P2以及P2的二聚体形式 (P2 ) 2 的EC5 0值则分别为 0 .35nmol/L和 0 .14nmol/L。将模拟肽给小鼠皮下注射后检测其外周血指标 ,测定结果证实该肽可以显著提高血循环中血小板数量 ,且不影响其他血液学指标。结论

促血小板生成素模拟肽二联体连接肽的筛选

比较不同Linker连接的促血小板生成素模拟肽二联体(d TMP)的生物活性,筛选高生物活性d TMP的Linker设计。全基因合成4个d TMP基因,将片段克隆到p GEX-4T-1载体,构建重组表达载体p GEX-4T-1/d TMP,筛选阳性目的克隆,转化大肠杆菌BL21(DE3),0.1 mmol/L IPTG诱导表达融合蛋白。超声细胞破碎仪破菌,Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和层析获得GST-d TMP融合蛋白,凝血酶酶切,再次亲和层析除去GST标签,收集目的 d TMP肽片段,双荧光素酶法检测各目的肽片段的活性。通过实验,正确构建了4个不同的p GEX-4T-1/d TMP表达载体,经表达纯化得到了GST-d TMP融合蛋白,酶切后再次亲和层析纯化,并获得了相对分子质量与理论值3 920,3 640,3 610,3 430相符的4个d TMP肽片段,它们的活性大小依次为:d TMP-Linker3>d TMP-Linker4>d TMP-Linker1>d TMP-Linker2。实验发现,不同的连接肽显著影响d TMP肽片段的生物活性,该实验成功筛选到了活性较高的连接肽Linker3。

重组双体化促血小板生成素模拟肽人血清白蛋白融合蛋白(HSA-TMP-TMP)体内生物活性与药效学研究

探索双体化重组人白蛋白与促血小板生成素模拟肽二联体融合蛋白(HSA-TMP-TMP)对正常小鼠促血小板生成活性的影响,并探讨双体化HSA-TMP-TMP对卡铂诱导继发性血小板减少症模型小鼠的治疗作用。给予正常小鼠不同剂量的双体化HSA-TMP-TMP,观察其促血小板生成活性;给予小鼠单次腹腔注射卡铂,建立化疗药物卡铂诱导的血小板减少症模型,并给予不同剂量的双体化HSA-TMP-TMP进行治疗,观察治疗效果。单体和双体HSA-TMP-TMP均可显著提高正常小鼠血小板计数水平,双体HSA-TMP-TMP提高正常小鼠血小板计数水平是单体HSA-TMP-TMP的1.57倍。而且,双体HSA-TMP-TMP对卡铂诱导继发性血小板减少症模型小鼠具有显著的治疗作用。双体HSA-TMP-TMP具有显著增加正常小鼠血小板计数水平的生物活性,而且对卡铂诱导的血小板减少症小鼠具有显著的治疗作用。

MO7e细胞增殖法检测注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白生物活性方法的建立和验证

目的:建立并验证用于检测注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(recombinant human thrombopoietin mimetic peptide-Fc fusion protein,TMP-Fc)生物活性的MO7e细胞增殖法,用于TMP-Fc的质量控制。方法:以人巨核细胞白血病细胞株MO7e作为基质细胞,不同浓度的TMP-Fc与MO7e细胞作用,与其表面血小板生成素(thrombopoietin,TPO)受体结合,刺激细胞增殖,通过比色法测定细胞增殖情况来评价TMP-Fc的生物学活性,其结果用质控参考品进行校正。从显色方法、作用时间、TMP-Fc稀释率等多个方面对实验条件进行优化。对方法的专属性、线性与范围、准确度及精密度进行验证。结果:MO7e细胞对TMP-Fc有很好的剂量反应关系,方法专属性良好;线性范围为0.006 4～2 500 ng·m L-1,相关系数≥0.99;回收率在80%～120%之间。3批原研品和3批TMP-Fc经3次重复测定,其RSD均在15%之内,说明方法精密度良好;其活性分别为(193 152±6 799)～(219 187±11 390)U·mg-1和(207 822±30 423)～(228 549±15 865)U·mg-1,采用One-way ANOVA统计分析,组间P值大于0.05,说明TMP-Fc生物学活性与原研品相似。结论:建立并验证测定TMP-Fc生物活性的MO7e细胞增殖法,该方法具有较好的专属性、准确度和精密度,可用于TMP-Fc的生物学活性评价和质量控制。

血小板生成素及其模拟物的研究进展

血小板生成素(TPO)是巨核细胞增殖、成熟和血小板产生的主要调节因子,并且在成熟血小板生成中,TPO的作用强于目前已知的几种相关造血因子。TPO模拟肽(TPOmimeticpeptide,TMP)或TPO非肽类模拟物(TPOnonpeptidemimics)是与TPO具有相似功能但不具有同源结构的小分子物质,能与TPO受体结合,产生类似TPO的生物学作用,且不具有免疫原性,因而越来越受到青睐。本文对TPO及其模拟物的研究进展进行综述。