重组人干细胞因子／血小板生成素融合基因的克隆、表达及其蛋白质结构预测

目的:获得重组人干细胞因子／血小板生成素(SCF-TPO)融合蛋白的高表达,预测该全新型融合蛋 白的蛋白质结构。方法:设计引物,利用RT-PCR从胎肝细胞中扩增SCF和TPO氨基端功能区片段,采用基因融合 新策略将其融合成SCF-TPO融合基因,构建pET32a／SCF-TPO融合基因重组表达载体,在E．coli BL21(DE3)plysS 中获得正确高表达,采用生物信息学方法对融合蛋白的结构特征进行模拟分析。结果:首次成功构建了pEF32a／SCF -TPO原核表达载体,并获得了融合蛋白的高表达,表达量高达40％,主要以包涵体形式表达。蛋白结构预测结果 显示,融合蛋白的等电点、抗原性及亲水性无显著改变,接头序列具有高柔性。融合蛋白除一级结构有4个氨基酸发 生改变外,原来的α螺旋和β片层无改变。结论:获得了SCF-TPO融合蛋白的高表达,结构预测融合蛋白的设计符 合要求。为进一步研究SCF-TPO融合蛋白的生物学特性奠定了基础。

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体pMAL—c2构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒pMAL-TPOM。方法：采用基因重组和表达、SD-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白纯化技术。结果：SDS-PAGE分析表明，IPTG诱导5h后大肠杆菌JM109表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的36．6％。除了大肠杆菌RR1不表达以外，大肠杆菌DH5a、H101均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋白经SephacyIS-200和DEAE-SepharoseFF层析纯化后，蛋白纯度约为87．6％。结论：人血小板生成素突变体融合蛋白在大肠杆菌JM109、DH5a和H101中均获得高效表达。

重组人血小板生成素融合蛋白工程菌发酵工艺的研究

对表达重组人血小板生成素融合蛋白 (rhTPO/GST)工程菌的发酵条件进行了较详细的研究 ,优化了影响工程菌发酵的条件 ,探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响。结果发现采用复合培养基分阶段流加有机营养物 ,用异丙基硫代 -B -D -半乳糖苷 (IPTG)进行诱导 ,使rhTPO/GST融合蛋白的湿菌重达 2 5 g/L以上 ,表达水平约占菌体总蛋白的 3 0 %左右。在此基础上 。

重组人干细胞因子/血小板生成素融合蛋白的纯化及复性研究

目的 探讨重组人干细胞因子/血小板生成素(SCF TPO)融合蛋白纯化及复性的最佳方法。方法 裂解 法提取包涵体,在变性条件下利用金属螯和层析获得融合蛋白,经透析及谷胱甘肽氧化还原法对纯化的融合蛋白进 行复性。结果 获得具有初步生物学活性的SCF TPO融合蛋白,其纯度高达90%。结论 该纯化方法操作简捷, 特异性高,纯化效果好,获得率高。

重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白抗体中和活性检测方法的建立

目的:建立重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(TMP-Fc)抗体中和活性的检测方法,并应用于免疫原性研究中的样品分析。方法:基于MO7e细胞依赖于TMP-Fc增殖的活性检测方法,以及TMP-Fc的阳性中和抗体对MO7e细胞增殖的抑制作用,建立TMP-Fc抗体中和活性检测方法。结果:TMP-Fc对MO7e细胞的增殖具有促进作用,在3.2~80 ng/m L浓度范围内作用显著;阳性血清稀释率低于1/10 000时,对MO7e细胞的增殖有明显抑制作用;检测方法经优化,确定最佳血清稀释率为1/20,最佳药物浓度为16 ng/m L;实验阈值(CP)确定为23.78%。免疫原性结果显示,TMP-Fc与罗米司亭在300μg/kg剂量下中和抗体个体发生率分别为30%和40%,表明二者在免疫原性方面类似。结论:建立了一种TMP-Fc抗体中和活性检测方法,并应用于免疫原性研究的样品分析,为TMP-Fc在长期毒性实验中的免疫原性评价提供了有效的检测手段。

血小板生成素双体分子的融合构建、原核表达及其分子结构特性预测

目的为了研制更稳定、高效、低毒的血小板生成素(TPO),拟设计构建TPO的双体分子(TT)并在原核中表达,同时预测其融合蛋白的分子结构特性。方法采用分子克隆方法分别构建TPO单体分子与双体分子的原核表达载体pET32/TPO和pET32/TT,并在大肠杆菌中进行表达,以Westernblot鉴定表达产物;用生物信息学方法DSGene1.1和ProtScale软件,对该融合蛋白的结构特征如电点、柔性、抗原性及亲水性等进行模拟分析。结果成功构建TPO双体分子pET32/TT的原核表达载体,并经NcoI和NotI双酶切电泳及测序证实。通过转化origamiTM(DE3)感受态菌及IPTG诱导获得高效表达,其产量在40%以上;Westernblot显示表达产物能与抗TPO单克隆抗体特异性结合。对TT双体分子融合蛋白的结构特性预测表明,其融合蛋白中的两个TPO单体分子等电点、抗原性及亲水性均无显著改变,接头处具有高柔性。与TPO的原始序列相比,TT的一级结构中有2个氨基酸发生改变,在接头(L)后插入一段34个氨基酸的新序列(N)。此序列具有一定的抗原性和亲水性,呈现β片层结构。结论本研究所构建表达的TPO单体和TT双体分子均可在大肠杆菌中获高效表达,TT双体分子的结构预测符合设计要求,为进一步研究新型TT双体分子融合蛋白的生物学特性提供了基础。

促血小板生成素对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤后JAK2/STAT3信号通路的影响

目的探讨促血小板生成素(TPO)对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用及相关信号转导通路机制。方法采用大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤模型。将80只雄性SD大鼠随机分为4组,分别为假手术组、模型对照组、TPO组、TPO+蛋白质酪氨酸激酶抑制药(AG490)组。于缺血-再灌注前30 min,TPO组给予5μg·kg-1TPO腹腔注射,TPO+AG490组于缺血-再灌注前30 min先腹腔内注射5μg·kg-1TPO,再给予8μg·kg-1AG490腹腔注射,模型对照组给予等剂量0.9%氯化钠溶液。再灌注6,12,24,48 h后处死取脑组织、切片,进行苏木精-伊红染色、免疫组化染色、Western blotting和细胞凋亡检测。结果与模型对照组比较,缺血-再灌注24 h后TPO组细胞凋亡数减少[(67.50±9.37)比(40.20±7.47)个],Bcl-2、蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)及信号转导和转录激活因子3(STAT3)蛋白表达水平升高,分别为(35.40±7.39)比(78.70±9.75),(35.68±6.75)比(62.35±7.53),(25.40±9.45)比(55.36±9.69),均差异有统计学意义(P<0.05)。与TPO组比较,TPO+AG490组Bcl-2、JAK2及STAT3蛋白表达水平降低,分别为(78.70±9.75)比(55.40±9.35),(62.35±7.53)比(40.68±5.89),(55.36±9.69)比(30.40±9.39),细胞凋亡数增多[(40.20±7.47)比(55.23±7.65)个],均差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TPO可降低缺血-再灌注所诱导的细胞凋亡,其机制可能与激活JAK2/STAT3信号转导通路上调Bcl-2有关。

促巨核细胞和血小板生成素的研究进展

促巨核细胞／血小板生成素自概念提出至今已有近40年的历史。近年来在传统的生物化学方法的基础上，结合细胞生物学、分子生物学等方法，将其蛋白质纯化，并克隆到基因，成功地进行了染色体的定位。本文综述了这几方面近年来的最新进展。

用酵母双杂合系统筛选与人血小板生成素受体c-Mpl相互作用的蛋白质的初报

血小板生成素（ｔｈｒｏｍ ｂｏｐｏｉｅｔｉｎ， ＴＰＯ）是调节血小板生成最主要的细胞因子，其生物学效应由其受体ｃ－Ｍｐｌ介导．利用酵母双杂合系统（ｔｗ ｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ）筛选与ｃ－Ｍｐｌ相互作用的蛋白质因子，以Ｇａｌ４ ＢＤ融合ｃ－Ｍｐｌ膜内部分ｃＤＮＡ 的ｐＡＳＭＭ 为靶蛋白质粒，筛选了人胎盘ｃＤＮＡ 文库，分离到人波形纤维蛋白（ｖｉｍ ｅｎｔｉｎ）的部分编码序列，首次检测到波形纤维蛋白与ＴＰＯ 受体之间的相互作用，这提示细胞骨架蛋白可能在ＴＰＯ

血小板生成素突变体的克隆和扩增及其融合蛋白在大肠杆菌中高效表达的研究

目的：通过获得编码血小板生成素（Ｔｐｏ）成熟肽Ｎ端１～１９６个氨基酸的突变体ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＪＭ１０９中的表达，为Ｔｐｏ进一步的结构和功能研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术，将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体并测序，然后克隆到表达载体ｐＭＡＬ－ｃ２上。结果：转化重组质粒ｐＭＡＬ－ＭＢＰ／ＴｐｏＭ的大肠杆菌经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷诱导４～５小时，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白（ＭＢＰ／ＴｐｏＭ）的分子量约为６．３万。薄层扫描分析表明该蛋白占菌体总蛋白量的３７％。结论：经ＰＣＲ方法扩增的Ｔｐｏ基因突变体可在大肠杆菌中高效表达，为Ｔｐｏ突变体的进一步结构和功能研究以及Ｔｐｏ抗体的制备打下了基础。

血小板、红细胞生成素双功能融合蛋白的构建

为探索TPO EPO融合蛋白在肿瘤化疗中作为辅助治疗药物 ,同时纠正红细胞贫血和血小板减少症的可能性 ,首先通过PCR分别扩增了TPON 端 1 5 3肽和EPO成熟肽的编码cDNA ,并构建成功TPO EPO融合基因 .融合基因在COS 7细胞和CHO细胞中的表达产物能够维持TPO依赖株Ba/F3 mpl细胞和EPO依赖株Bet 2细胞的生长 ,能够在半固体培养体系中刺激巨核系集落和红系集落的形成 ,表明它同时具有TPO和EPO的生物活性 .初步体内实验表明 ,含有融合蛋白的培养上清可以使小鼠血小板数目升高 40 % ,对红细胞的作用有待进一步确定 .以上结果初步表明融合蛋白构建成功 ,为进一步探讨融合蛋白的体内活性和应用前景打下了基础 .

重组人干细胞因子-血小板生成素融合蛋白的表达及活性初步研究

目的研究重组人干细胞因子血小板生成素(SCFTPO)融合蛋白表达的最佳条件及其生物学活性。方法设计引物,利用RTPCR从胎肝细胞中扩增到SCF和TPO氨基端功能区片段,采用基因融合新策略将其融合成SCFTPO融合基因,克隆到pGEMT载体中,构建pET32a/SCFTPO融合基因原核表达载体,在宿主菌E.coliBL21(DE3)plysS中经异丙基βD硫代半乳糖(IPTG)诱导其高表达SCFTPO,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot检测。目的蛋白经包涵体变性,金属螯合层析纯化,透析复性,用细胞因子依赖细胞系MO7e进行细胞增殖实验。结果获得SCFTPO融合基因的高表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。Westernblot法鉴定表达正确,MTT法证明该融合蛋白具有细胞增殖活性,浓度为100ng/ml时刺激活性更强。结论表达并复性后的重组人SCFTPO融合蛋白具有刺激MO7e细胞生长活性。

rhTpo/GM-CSF融合蛋白的构建、表达及活性测定

本研究的目的是找出一个治疗由于放化疗等原因造成的造血组织损伤导致的贫血、感染和出血的有效方法。通过RT-PCR的方法从人胎肝中克隆了重组人血小板生成素(rhTpo)的基因,利用基因工程的手段将其与重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的基因相融合,并在原核细胞中表达。研究结果表明,大肠杆菌JM101表达的融合蛋白rhTpo/GM-CSF在体外小鼠骨髓造血祖细胞的培养中保留了Tpo对巨核细胞系和红细胞系的刺激作用,并增加了GM-CSF对粒细胞系的刺激活性。结论提示,原核细胞表达的融合蛋白rhTpo/GM-CSF具有刺激骨髓红细胞系、粒细胞系及巨核细胞系造血的活性。

重组人血小板因子4的表达、纯化及活性鉴定

目的: 用基因工程手段去获取有活性的重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步的基础理论研究和临床应用奠定基础.方法: 用PCR手段获得人PF4的编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET- PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,用SDS- PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白,用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验(CAM)验证rhPF4的活性.结果: 成功构建了表达载体pRSET PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.CAM实验表明,经纯化获得的rhPF4对鸡胚血管形成具有抑制作用.结论: 成功地获得了具有高度生物学活性的rhPF4蛋白.

重组双体化促血小板生成素模拟肽人血清白蛋白融合蛋白(HSA-TMP-TMP)体内生物活性与药效学研究

探索双体化重组人白蛋白与促血小板生成素模拟肽二联体融合蛋白(HSA-TMP-TMP)对正常小鼠促血小板生成活性的影响,并探讨双体化HSA-TMP-TMP对卡铂诱导继发性血小板减少症模型小鼠的治疗作用。给予正常小鼠不同剂量的双体化HSA-TMP-TMP,观察其促血小板生成活性;给予小鼠单次腹腔注射卡铂,建立化疗药物卡铂诱导的血小板减少症模型,并给予不同剂量的双体化HSA-TMP-TMP进行治疗,观察治疗效果。单体和双体HSA-TMP-TMP均可显著提高正常小鼠血小板计数水平,双体HSA-TMP-TMP提高正常小鼠血小板计数水平是单体HSA-TMP-TMP的1.57倍。而且,双体HSA-TMP-TMP对卡铂诱导继发性血小板减少症模型小鼠具有显著的治疗作用。双体HSA-TMP-TMP具有显著增加正常小鼠血小板计数水平的生物活性,而且对卡铂诱导的血小板减少症小鼠具有显著的治疗作用。

具创新分子结构的更优长效性重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白的表达、制备和特性研究

目的研究作为药物级别重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白的生产制备工艺;开展详尽的融合蛋白理化特性研究;提出作为长效创新药物的质量基础和技术指标。方法利用基因工程技术构建1个能稳定表达全新分子结构和更优长效性的重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白(rH SA/EPO)的基因工程CHO细胞株;研究建立悬浮、无血清培养基,批次化、可线性放大的规模化生产工艺,并就分离纯化的融合蛋白进行详尽的理化特性分析。结果获得的r HSA/EPO蛋白质单体纯度达到97%以上;经不同作用位点蛋白酶水解的r HSA/EPO产物通过MALDI-TOF/TOF质谱肽质量指纹谱和Nano LC-MS/MS液质联用串联质谱检测得到总序列覆盖率100%;N-端氨基酸序列前15个氨基酸与理论序列相符;rH SA/EPO为糖基化蛋白,定位了糖基化位点;原液中融合蛋白的质谱分子量测定值为93 k D;酶深度脱糖后的质谱分子量测定结果为84205 D,与理论分子量84849.52 D值相近;融合蛋白含有1个自由巯基,表明仅有1个游离半胱氨酸存在;经圆二色光谱分析比对表明,HSA和EPO各自的空间二级构象未变;毛细管电泳测定有多个电荷异构体范围在pI 5.1~5.8,等电聚焦获得的等电点值(p I)约为p I 4.9;紫外光谱呈现典型蛋白质光谱特征;原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA的残留量均符合药物原料药的要求。免疫学鉴别为阳性;小鼠体内生物比活性测定结果值为0.9×105 IU/mg;体外UT7细胞法与小鼠体内生物活性测定较大差异,但体内与体外生物活性测定方法可用于不同试验目的,且相互间也具有一定的相关系数。结论理化特性研究获得较为全面的药学数据,其结果可作为指导"注射用重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白(CHO细胞)"原料药的质量标准和制造检定规程的基础,并显示出原创的r HSA/EPO(之间无连接肽)具有创新性,符合作为药物的更优分子结构要求。

MO7e细胞增殖法检测注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白生物活性方法的建立和验证

目的:建立并验证用于检测注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(recombinant human thrombopoietin mimetic peptide-Fc fusion protein,TMP-Fc)生物活性的MO7e细胞增殖法,用于TMP-Fc的质量控制。方法:以人巨核细胞白血病细胞株MO7e作为基质细胞,不同浓度的TMP-Fc与MO7e细胞作用,与其表面血小板生成素(thrombopoietin,TPO)受体结合,刺激细胞增殖,通过比色法测定细胞增殖情况来评价TMP-Fc的生物学活性,其结果用质控参考品进行校正。从显色方法、作用时间、TMP-Fc稀释率等多个方面对实验条件进行优化。对方法的专属性、线性与范围、准确度及精密度进行验证。结果:MO7e细胞对TMP-Fc有很好的剂量反应关系,方法专属性良好;线性范围为0.006 4～2 500 ng·m L-1,相关系数≥0.99;回收率在80%～120%之间。3批原研品和3批TMP-Fc经3次重复测定,其RSD均在15%之内,说明方法精密度良好;其活性分别为(193 152±6 799)～(219 187±11 390)U·mg-1和(207 822±30 423)～(228 549±15 865)U·mg-1,采用One-way ANOVA统计分析,组间P值大于0.05,说明TMP-Fc生物学活性与原研品相似。结论:建立并验证测定TMP-Fc生物活性的MO7e细胞增殖法,该方法具有较好的专属性、准确度和精密度,可用于TMP-Fc的生物学活性评价和质量控制。

人体c-Mpl分子配体蛋白XP1的表达、纯化及活性初步鉴定

TPO是近年发现的血小板生成素 ,它通过与其受体c Mpl的结合刺激巨核细胞的发生 ,调节动物或人体血小板的生成。利用酵母双杂交系统 ,以人体c Mpl受体作为诱饵蛋白 ,我们从人体肝脏cDNA文库筛选到另一与c Mpl相结合的新配体 ,命名为XP1。将xp1 cDNA构建到 pET 2 8b大肠杆菌融合表达载体 ,经金属离子亲和层析柱和DEAE阴离子层析柱分离纯化 ,获得纯度为 99%的His XPI水溶性融合蛋白。表达产物利用小鼠巨核细胞集落形成单位测定活性。结果表明 :xp1基因在大肠杆菌中获得高效水溶性表达 ;

促血小板生成素模拟肽二联体连接肽的筛选

比较不同Linker连接的促血小板生成素模拟肽二联体(d TMP)的生物活性,筛选高生物活性d TMP的Linker设计。全基因合成4个d TMP基因,将片段克隆到p GEX-4T-1载体,构建重组表达载体p GEX-4T-1/d TMP,筛选阳性目的克隆,转化大肠杆菌BL21(DE3),0.1 mmol/L IPTG诱导表达融合蛋白。超声细胞破碎仪破菌,Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和层析获得GST-d TMP融合蛋白,凝血酶酶切,再次亲和层析除去GST标签,收集目的 d TMP肽片段,双荧光素酶法检测各目的肽片段的活性。通过实验,正确构建了4个不同的p GEX-4T-1/d TMP表达载体,经表达纯化得到了GST-d TMP融合蛋白,酶切后再次亲和层析纯化,并获得了相对分子质量与理论值3 920,3 640,3 610,3 430相符的4个d TMP肽片段,它们的活性大小依次为:d TMP-Linker3>d TMP-Linker4>d TMP-Linker1>d TMP-Linker2。实验发现,不同的连接肽显著影响d TMP肽片段的生物活性,该实验成功筛选到了活性较高的连接肽Linker3。

脓毒症时血小板生成素具有心肌负性肌力调节作用

以往研究发现，血小板生成素（TPO）可通过增加血小板的活性进而影响某些肌肉的收缩功能。脓毒症患者TPO水平增高，从而使血小板活性增加，这可能与患者多器官功能衰竭的发病机制有关。近日意大利学者对脓毒症患者体内TPO水平升高能否影响心肌收缩从而抑制心肌功能进行了研究。研究人员应用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫组化及蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）对心肌组织中TPO受体c—Mpl的表达进行检测，并评估了TPO对大鼠心肌收缩功能的影响。