表达血小板膜糖蛋白GPIb-Ⅸ复合物的中国仓鼠卵巢细胞株研究模型的建立

本研究旨在建立表达重组野生型和突变型血小板膜糖蛋白GPIb-Ⅸ复合物的中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞研究模型,为进行GPIb-Ⅸ生理功能的相关研究奠定基础。从表达野生型或缺失突变型GPIbα的大肠杆菌宿主菌中抽提质粒并用EcoRI酶切鉴定,然后将分别表达GPIbα、GPIbβ和GPIX3种基因的质粒共转染到中国仓鼠卵巢细胞中,通过免疫共沉淀、Western blot和流式细胞仪检测其表达效果。结果表明,转染48小时后,CHO细胞裂解物和细胞表面均可检测到GPIb-Ⅸ复合物的表达。结论:成功构建了表达血小板膜糖蛋白GPIb-Ⅸ复合物的CHO细胞研究模型。

抗血小板膜糖蛋白Ibα胞内段多肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的制备兔抗人血小板膜糖蛋白（GP）IbαC端557～561氨基酸序列多肽的多克隆抗体，并初步用于人血小板GPIbαC端559位丝氨酸磷酸化状态的检测。方法应用化学方法合成C—R—G-S—L-P（559位丝氨酸非磷酸化，Ser559）和C—R—G—S（P）-L-P（559位丝氨酸磷酸化，pSer559）多肽。将2种多肽分别与钥孔蜮血蓝蛋白交联后，以皮下注射法分别免疫新西兰大白兔，分离获得2种抗血清（抗Ser559多抗和抗pSer559多抗）。应用斑点印迹和酶联免疫吸附试验（ELISA）方法对抗血清进行鉴定并检测效价。从人血小板裂解液中分离纯化血小板GPIbα，利用抗Ser559多抗和抗pSer559多抗、采用ELISA方法检测人血小板GPIbαC端559位丝氨酸磷酸化状况。结果所制备的2种多抗分别特异性识别各自抗原，效价分别为1：32000和1：64000。2种多抗均可与纯化的人血小板GPIbα特异结合，表明人血小板GPIbα559位点丝氨酸存在磷酸化与非磷酸化两种状态。结论应用人工合成多肽成功制备出2种可特异性识别丝氨酸磷酸化状态的兔抗人血小板GPIbα胞内段多肽多抗，并证明人血小板GPIbcαC端559位丝氨酸存在磷酸化状态。