抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-21基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的将能与血小板膜糖蛋白 a特异结合的单克隆抗体 SZ- 2 1构建成单链抗体 ,为其临床应用奠定基础。方法通过逆转录及多聚酶链反应 ,扩增并克隆 SZ- 2 1的可变区基因 VH、VL ,经测序后构建 SZ- 2 1单链抗体 (SZ- 2 1Sc Fv) ,在大肠杆菌中进行表达。EL ISA和 Western印迹检测其与血小板的结合特性。结果 VH、VL 可变区基因符合小鼠抗体可变区特征 ,SZ- 2 1Sc Fv基因拼接正确。表达产物除少量为分泌型外 ,主要以包涵体形式存在 ,表达量占菌体蛋白的 2 1%。经过变性和复性后 ,该单链抗体保留了与血小板特异结合的能力。结论成功表达了 SZ- 2 1单链抗体 ,该小分子抗体具有特异结合血小板的能力 ,有望用于抗血栓治疗。

国际各类品种血小板膜糖蛋白单克隆抗体试剂对血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测技术的影响

本研究按国际输血学会第14届国际血小板免疫学研讨会和合作研究项目的要求,分析比较国际常用血小板膜糖蛋白单克隆抗体(McAb)各类品种对血小板抗原McAb特异性免疫固定检测技术(MAIPA)检测血小板抗体结果的影响。向参加该研究的30个实验室发放10份含已知血小板抗体特异性的血清和1份阴性对照血清样本,以及9份不同类别(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ及GPⅣ)及克隆编号的血小板膜糖蛋白McAb和统一的实验研究技术方案,各参加实验室按方案进行检测并反馈结果数据,比较同一糖蛋白种类不同的McAb对MAIPA检测结果的影响。结果表明:GPⅡb/Ⅲa中AP2,Gi-5,PL2-73等几种McAb的平均S/CO值较高;GPⅠa/Ⅱa的McAb中MBC202.2和143.1的平均S/CO值较高;GPⅠb/Ⅸ的McAb中142.11和CLB-MB45(CD42b)的平均S/CO值较高;GPⅣ的McAb中131.4的平均S/CO值较高。结论不同的McAb品种对样本的检测结果存在差异,McAb对MAIPA的灵敏度有重要影响。用MAIPA法检测血小板抗体时应同时使用相同糖蛋白种类而不同克隆号的McAb,以防止血小板抗体的漏检。

抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体洗脱性血管内支架体外实验研究

采用一种涂覆左旋聚乳酸《L-PLA)的镍钛合金支架,进行涂层基质的荧光染色和图像分析,探讨吸附法制备药物洗脱性涂层的可行性,同时通过吸附标记同位素125I的抗GP Ⅱb／Ⅲa单克隆抗体制备药物洗脱性涂层,利用放射性检测方法, 建立了药物的吸附和缓释曲线,并评价相关影响因素。

抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-2单链抗体的构建、表达及功能研究

目的 :降低鼠源性抗体的免疫原性及分子量 ,为其进一步研究、应用奠定基础。方法 :应用RT PCR技术 ,克隆SZ 2重链、轻链可变基因。应用基因重组技术构建SZ 2单链抗体表达载体pET2 2 2scFv ,导入大肠杆菌BL2 1(DE3)Plys ,诱导表达。流式细胞术、ELISA、Westernblot检测SZ 2scFv与血小板结合能力 ,瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导血小板聚集试验对表达产物功能进行研究。结果 :克隆基因序列符合小鼠轻、重链可变区基因特征 ;pET2 2 2scFv表达质粒拼接正确 ;表达产物以包涵体形式为主 ,表达量占菌体总蛋白的 2 5 % ;纯化、复性后证明表达产物具有与血小板结合的活性 ,并可抑制瑞斯托霉素、凝血酶诱导的血小板聚集。结论 :成功表达了SZ 2单链抗体 ,该小分子抗体具有与血小板结合的活性 ,并可抑制瑞斯托霉素、凝血酶诱导的血小板聚集。

原发与继发免疫性血小板减少症患者血小板膜糖蛋白特异性抗体及其与出血评分关系的研究

目的探讨原发与继发免疫性血小板减少症(ITP)患者抗GPⅡb/Ⅲa及GPΙb/Ⅸ抗体的表达、抗体阳性表达与出血评分的关系,以及不同抗体类型出血评分的差异,为原发与继发ITP患者的诊治和出血严重程度提供临床依据。方法选取2013年10月—2020年8月在新疆医科大学第一附属医院诊断为原发ITP患者(42例)及继发ITP患者(42例)为研究对象,所有患者入院时采用ITP出血评分量表行出血评分。应用改良MAIPA法检测患者抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPΙb/Ⅸ抗体。结果原发与继发组患者抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPΙb/Ⅸ抗体阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05),原发组患者抗体表达以抗GPⅡb/Ⅲa抗体为主,继发组抗体表达以抗GPΙb/Ⅸ抗体为主,两者抗体阳性构成比较,差异有统计学意义(P<0.05)。继发组患者整体出血程度较原发组重(P<0.05)。抗体阳性表达与出血程度的关系:(1)抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性患者出血程度较抗体阴性患者重(P<0.05)。(2)抗GPΙb/Ⅸ抗体阳性患者出血程度较抗体阴性患者重(P<0.05),双抗体阳性患者出血程度较抗体阴性患者重(P<0.05)。结论抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPΙb/Ⅸ抗体阳性表达对原发与继发ITP无鉴别意义,但原发ITP患者抗体表达以抗GPⅡb/Ⅲa抗体为主,继发ITP患者抗体表达以抗GPΙb/Ⅸ抗体为主。继发ITP患者临床出血程度较原发ITP患者重。抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPΙb/Ⅸ抗体及抗体双阳性患者出血程度较抗体阴性患者重。

^(99)Tc^m标记人源化抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ21F(ab)_2血栓栓塞显像

目的用动物血栓栓塞模型显像评估^(99)Tc^m 标记人源化抗人血小板膜糖蛋白(GP)Ⅲa单克隆抗体(简称单抗)F(ab)_2片段 SZ21F(ab)_2的应用价值。方法通过体外抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的犬血小板聚集实验,评估 SZ21F(ab)_2与血小板结合的亲和性和特异性。以2-亚氨基噻吩盐酸盐(IT)法修饰 SZ21F(ab)_2分子的亚氨基,以^(99)Tc^m-葡庚糖酸钠(GH)转换络合法进行标记。分别用快速薄层层析(ITLC)法和 ELISA 测定标记物的放化纯及生物活性。对3条肺动脉血栓和8条(包括上述3条)后肢深静脉血栓栓塞比格犬模型进行显像研究。结果 SZ21F(ab)_2抑制 ADP 诱导的犬富含血小板血浆(PRP)聚集实验的半数有效剂量(IC_(50))为(2.49±1.88)μg/ml。ITLC 法测得标记物的放化纯为90%～95%,ELISA 测定结果表明标记后抗体保留了免疫活性。注射显像剂后1 h,肺动脉血栓部位和后肢深静脉血栓部位均出现放射性浓聚。注射后3 h,在体显像肺动脉血栓和后肢深静脉血栓栓塞模型的放射性靶/本底(T/B)比值分别为3.03±1.18和3.51±0.62。肺动脉血栓部位和后肢深静脉血栓部位的每克组织百分注射剂量率(%ID/g)分别为0.083%ID/g 和0.076%ID/g。体外检测结果表明:肺动脉血栓与正常肺组织的单位质量放射性比值平均为12.8,后肢深静脉血栓与血液的单位质量放射性比值平均为5.2,与肌肉的比值平均为127.0。结论 ^(99)Tc^m-SZ21F(ab)_2与人血小板具有较高的亲和力,有潜在的血栓显像应用前景。

血小板膜糖蛋白特异性抗体在ITP患儿中的表达及其与疗效、出血程度的关系分析

目的分析血小板膜糖蛋白(GP)特异性抗体在免疫性血小板减少症(ITP)患儿中的表达情况及其与疗效、出血程度的关系。方法选取2018年2月至2020年12月于唐山市妇幼保健院儿科就诊的102例ITP患儿为研究对象,并将其纳入病例组,另选取同期同院进行体检的110例健康儿童纳入健康组。病例组患儿均接受糖皮质激素冲击疗法,以4周为1个疗程,共治疗5个疗程,并随访3个月。检测并比较两组GP特异性抗体表达情况,统计ITP患儿出血部位并分析不同GP特异性抗体出血程度、疗效及预后。结果病例组抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体表达水平高于健康组,差异有统计学意义(t值分别为16.521、51.718,P<0.05);102例ITP患儿抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性、双抗体阴性检出率分别为15.69%、4.90%、30.39%、49.02%,0级、1级、2级出血率分别为16.67%、50.00%、33.33%;且0级出血以双抗体阳性占比(0)最低,1级出血以抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性占比(80.00%)最高,2级出血以抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、双抗体阳性占比(62.50%、48.39%)较高,差异有统计学意义(H=38.237,P<0.05);102例ITP患儿治疗5个疗程后有效率为78.43%,随访3个月后完全缓解率为68.63%;双抗体阴性ITP患儿有效率、完全缓解率均高于抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性ITP患儿,差异有统计学意义(χ^(2)值分别为19.866、27.709,P<0.05)。结论ITP患儿抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体表达水平较高,且其不同表达水平与患儿出血程度、疗效及预后均有密切关系,临床可通过监测GP特异性抗体来对ITP患儿进行早期诊断,并对其出血程度、疗效、预后等进行预测。

利用抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ—21测定生物材料表面粘附血小板数的新方法

本课题对三种血小板膜糖蛋白单克隆抗体进行了筛选.研究了由单克隆抗体SZ—21,用固相放射免疫技术测定生物材料表面粘附血小板的新方法.对聚氨酯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸乙酯、聚酰胺-胺等47种医用高分子材料进行了定量测定。

抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体抑制兔血栓形成的实验研究

目的 评价抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ2 1抑制兔血栓形成的能力。方法不同浓度的SZ2 1( 0、10及 2 0 μg/ml)分别加入兔富血小板血浆 (PRP)中 ,进行二磷酸腺苷 (ADP)诱导的兔血小板聚集试验 ;体内注射SZ2 1( 1 5mg/kg) ,注射前及注射后 5、30及 6 0分钟时制备兔PRP ,分别进行聚集试验 ;用颈动静脉旁路血栓模型研究SZ2 1对兔血栓形成的作用 ,2 0只新西兰兔随机分成 4组 ,体内注射SZ2 1,剂量为A组 0 1mg/kg ,B组 0 4mg/kg ,C组 0 75mg/kg ,D为对照组 (SZ391mg/kg) ,然后测定血栓重量。 结果 体外 2 0 μg/ml的SZ2 1对兔血小板抑制率为 80 % ;SZ2 1体内注射 6 0分钟时完全抑制血小板聚集功能 ;血栓模型分组试验 ,各组平均栓重为A组 31mg ,B组 2 1mg ,C组 2 0 2mg ,D组 31mg ,B、C组与对照组间有明显统计学差异 (P <0 0 1)。 结论 单克隆抗体SZ2

抗血小板膜糖蛋白Ib单克隆抗体的制备、鉴定及其功能的初步研究

目的:制备抗人血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)单克隆抗体(mAb),并进行生化鉴定与初步探讨其临床应用。方法:采用血小板免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA法筛选和克隆化培养,获得1株抗人GPIbmAb的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得mAb;免疫双扩散鉴定其抗体亚类;流式细胞术和免疫放射法鉴定其识别的抗原;ELISA法检测该抗体对血浆血管性血友病因子(vWF)的瑞斯托霉素辅因子活性的影响。结果:成功制备了1株抗人GPIbmAb,命名为SZ-151。ELISA法测定其腹水效价为1∶20 000,免疫双扩散鉴定其为IgG1亚类。免疫放射法和流式细胞术检测结果证实SZ-151和mAb SZ-2识别同一抗原GPIb,且作用位点不同。ELISA结果显示,SZ-151对瑞斯托霉素辅因子活性无抑制作用。结论:获得1株新的抗血小板膜糖蛋白Ib的mAb,可用于血浆vWF的瑞斯托霉素辅因子活性检测,为血管性血友病的诊断和分型提供了有效的工具。

抗血小板糖蛋白VI单克隆抗体的制备及其功能研究

目的:制备抗血小板糖蛋白VI(GPVI)单克隆抗体,观察其在体外抗血小板黏附和聚集功能。方法:采用基因重组技术体外表达血小板糖蛋白VI胞外区重组蛋白(rGPVI)。以rGPVI免疫小鼠,经细胞融合及筛选后制备抗GPVI单克隆抗体。采用血小板聚集实验观察该单抗对胶原、Convu lxin及ADP诱导的血小板聚集的影响;利用平行板流动小室技术研究在高剪切力条件下该单抗对血小板在胶原表面黏附的抑制效果。结果:正确构建了rGPVI表达载体pET-20b(+)-GPVI,rGPVI在原核细胞中有效表达。rGPVI能够被抗Penta-H is单抗和抗GPVI多抗识别。制备的抗GPVI单克隆抗体SZ118能够识别rGPVI,并与血小板有特异的结合能力。SZ118能明显抑制纤维状胶原和Convu lxin诱导的血小板聚集,呈抗体剂量依赖性;对ADP诱导的血小板聚集无明显影响。血小板黏附实验表明,SZ118能够明显阻断在高剪切力条件下血小板与纤维状胶原表面的黏附。结论:成功制备抗GPVI单克隆抗体SZ118,该抗体与血小板有良好的结合能力,显著抑制胶原诱导的血小板聚集并明显降低血小板与胶原的黏附反应。

小鼠抗西方马脑炎病毒E2蛋白胞外区(E2ecto)单克隆抗体的制备

目的制备针对西方马脑炎病毒(WEEV)E2包膜糖蛋白胞外区(E2ecto)的小鼠特异性单克隆抗体(mAb)。方法构建表达WEEV E2ecto的原核表达质粒pET-28a-WEEV E2ecto,转化BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,主要为包涵体形式。包涵体纯化后,通过变性、复性、超滤等制备得到E2ecto蛋白;以QuickAntibody-Mouse5W为佐剂,将E2ecto蛋白肌肉免疫BALB/c小鼠,间隔21 d加强1次。免疫后35 d,取效价超过1×104的小鼠腹腔接种1次E2ecto蛋白,3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。通过有限稀释法筛选稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,接种小鼠腹腔后制备腹水;利用ELISA检测抗体亚型及腹水中抗体效价的水平;将真核表达质粒pCAGGS-WEEV-CE3E2E1转染BHK-21细胞,通过免疫荧光法(IFA)鉴定上述mAb的生物学活性;利用东方马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的E2ecto蛋白进行ELISA鉴定上述抗体的特异性。结果成功表达及复性获得了纯化的WEEV E2ecto蛋白;制备了3G6G10、3D7G2、3B9E8、3D5B7四株mAb,其亚型分别为IgG2c(κ)、IgM(κ)、IgM(κ)、IgG1(κ);3G6G10、3B9E8、3D7G2腹水抗体效价均为105,3D5B7达到107;该4株抗体与VEEV和EEEV等其他脑炎甲病毒无交叉反应。结论成功制备了4株特异性结合WEEVE2ecto的小鼠mAb。

抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa单克隆抗体对原发性血小板减少性紫癜诊断价值的研究

目的 旨在探讨血小板膜糖蛋白 b/ a单克隆抗体 ( b/ a Mc Ab)检测对原发性血小板减少性紫癜 (ITP)的诊断价值。方法 共检测成人慢性 ITP1 1 4例 ,应用 b/ a Mc Ab(SZ- 2 1 +SZ- 2 2 )与 ITP患者的血小板共同孵育 ,用吸光度计检测其吸光度值并与正常值相比较 (做为结合值 ) ,如此值 <0 .5为阳性 ,即判定患者血小板膜上原已结合有抗 b/ a的自身抗体。同时用竞争性酶联免疫吸附法检测患者的血小板相关 Ig G(PA Ig G)。以非 ITP性血小板减少患者做为对照组。结果 1 1 4例成人慢性 ITP中 ,GP b/ a检测阳性率为 49% ;非 ITP组无 1例假阳性。ITP组 PAIg G阳性率为 6 4 % ;非 ITP组假阳性率为 2 6 .6 %。结论 实验证实本检测法特异性好 ,操作简单技术稳定 ,对 ITP的诊断、疗效观察及发病机理研究具有实用价值。

免疫性血小板减少症时检测血小板相关抗体及血小板膜糖蛋白的意义

为探讨血小板表面血小板相关抗体 (血小板相关免疫球蛋白 )及血小板膜糖蛋白在免疫性血小板减少症中的诊断及预后评价方面的应用价值 ,采用流式细胞术 (FCM)测定了 76例血小板减少症患者及 30名正常人血小板表面血小板相关免疫球蛋白 (PAIg)及血小板膜糖蛋白 (CD4 1,CD6 1,GPIIb/IIIa)。结果发现 ,初治 38例特发性血小板减少性紫癜 (ITP)患者中血小板相关抗体 (PAIgG、PAIgM、PAIgA)在血小板表面阳性百分率均高于正常对照组 (P <0 .0 0 1) ,血小板膜糖蛋白均低于正常对照组 (P <0 .0 1) ;9例经激素治疗的ITP患者PAIgG ,PAIgM ,PAIgA与正常对照组相比差异无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ,血小板膜糖蛋白与正常对照组相比差异无统计学意义(P >0 .0 2 ) ;继发性血小板减少症患者 (慢性再生障碍性贫血、白血病、SLE、Evans综合征、甲亢、乙肝后肝硬化脾功能亢进 )血小板相关抗体在血小板表面阳性百分率均高于正常对照组 (P <0 .0 0 1) ,血小板膜糖蛋白均低于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ;12例治疗有效患者治疗后血小板相关抗体较治疗前下降 (P <0 .0 5 ) ,血小板膜糖蛋白上升 ,其差异有统计学意义 (P <0 .0 1)。结论 :FCM用于免疫性血小板减少症患者的血小板相关抗体及血小板膜糖蛋白检测 ,具有灵敏、快速、简便的?

登革热患者血小板减少与血小板膜糖蛋白特异性抗体相关

【目的】了解登革热患者血小板膜糖蛋白特异性抗体(抗GPIIb/IIIa和抗GPIb/IX)的表达,探讨登革热患者血小板减少是否与血小板膜糖蛋白特异性抗体相关。【方法】用改良的血小板抗原单抗特异性固相化法(MAIPA法)检测51例登革病毒1型(DENV-1)登革热患者和50例健康者血清的抗GPIIb/IIIa和抗GPIb/IX特异性抗体,分析血小板膜糖蛋白特异性抗体水平和血小板计数的相关性。【结果】51例DENV-1登革热患者血清中血小板膜糖蛋白特异性抗体抗GPIIb/IIIa、抗GPIb/IX和双抗体总体阳性率分别为35.3%(18/51)、37.3%(19/51)和43.1%(22/51);与50例健康者的阳性率8.0%(4/50),6.0%(3/50)和10.0%(5/50)相比,差异有统计学意义(P<0.001)。重度血小板减少登革热患者(PLT<50×109/L)血清中,抗GPIIb/IIIa和抗GPIb/IX抗体检出率为100%(6/6)和83.3%(5/6),血小板计数无减少登革热患者血清中抗体阳性率为14.8%(4/27)和29.6%(8/27),差异有统计学意义(P=0.0001,P=0.015)。在登革热血小板计数减少患者血清中,抗GPIIb/IIIa和抗GPIb/IX抗体水平与血小板计数呈负相关(r=-0.58,P<0.001;r=-0.44,P<0.05)。【结论】登革热患者血小板减少与血小板膜糖蛋白特异性抗体抗GPIIb/IIIa和抗GPIb/IX相关;免疫因素参与登革热患者血小板减少的破坏过程。

抗J亚群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特异性单克隆抗体的研制及其特性

:J亚群禽白血病病毒 (ALV -J)是一种主要感染肉用型鸡的反转录病毒。本研究用表达ALV -J囊膜蛋白基因产物的Sf9细胞免疫Balb/c小鼠 ,取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞NS1进行融合 ,获得了 4株特异性抗ALV -J的单克隆抗体。免疫荧光分析结果表明 ,3株单克隆抗体仅与所试验的ALV -J毒株反应 ,而不能与ALV的A、B、C、D和E亚群的毒株反应。有趣的是 ,有一株单克隆抗体可以与所有试验的外源性ALV毒株反应 ,但不与内源性的E亚群反应。WesternBlot和免疫沉淀试验结果表明 ,单克隆抗体识别的ALV -J囊膜糖蛋白的分子量为 90 - 94kD ,识别未糖基化的囊膜蛋白分子量约为 5 3kD。用这些单克隆抗体能检测出ALV -J病毒感染鸡胚成纤维细胞中的病毒抗原。这些结果提示这些单克隆抗体可用于ALV

血小板膜糖蛋白特异性抗体与免疫性血小板减少症患者疗效及出血程度的关系

目的探讨血小板膜糖蛋白(GP)特异性抗体与原发免疫性血小板减少症(ITP)患者临床疗效及出血程度之间的关系。方法 2013年10月至2015年6月40例新诊断ITP患者纳入研究,所有患者均接受口服大剂量地塞米松(40 mg/d×4 d)治疗。应用改良单克隆抗体俘获血小板抗原技术(MAIPA)检测患者体内抗血小板GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ抗体,分析抗体与ITP患者疗效及出血程度的关系。结果大剂量地塞米松治疗后,血小板膜糖蛋白特异性抗体阴性的患者疗效(95.0%)明显优于抗体阳性的患者(60.0%)(P<0.05),抗GPⅠb/Ⅸ抗体阴性的患者疗效(90.9%)优于抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性的患者(61.1%)(P<0.05)。抗体阳性患者2级出血(55.0%)高于抗体阴性患者(20.0%)(P<0.05)。1级出血时抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性(9.5%)、抗GPⅡb/Ⅲa与抗GPⅠb/Ⅸ双抗体阳性(28.6%)出血程度均高于抗GPⅠb/Ⅸ阳性,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。2级出血时抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性(33.3%)、抗GPⅡb/Ⅲa与抗GPⅠb/Ⅸ双抗体阳性(40.0%)出血程度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性的ITP患者对大剂量地塞米松治疗的反应差,血小板膜糖蛋白特异性抗体阳性的患者较抗体阴性患者临床出血程度重。

清热凉血法对特发性血小板减少性紫癜血小板相关抗体和膜糖蛋白特异性自身抗体的影响

目的:观察清热凉血法对血小板相关抗体、血小板膜糖蛋白自身特异性抗体的影响,探讨中药疗效的作用机理。方法:将60例特发性血小板减少性紫癜患者随机分为治疗组30例、对照组30例,治疗组采用清热凉血法中药煎剂,对照组服用维血宁颗粒,两组疗程均为3个月,并检测两组治疗前后血小板相关抗体(PAIgA、PAIgG、PAIgM)和膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ)特异性自身抗体的水平。结果:治疗组与对照组均能够有效的降低血小板PAIgA、PAIgG含量(P<0.01),且治疗组效果优于对照组(P<0.05);治疗后两组PAIgM均下降,但与治疗前相比无明显差异(P>0.05);治疗后两组膜糖蛋白特异性自身抗体阳性率均降低,治疗组治疗后与治疗前对比有明显差异(P<0.05),对照组治疗后与治疗前对比无显著差异(P>0.05)。结论:清热凉血法能够有效地降低血小板表面PAIgA、PAIgG的含量及血浆中血小板膜糖蛋白特异性抗体。

人源性抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIa Fab噬菌体抗体库的构建

目的:构建人源性Fab噬菌体抗体库,为进一步从抗体库中筛选人源性抗GPIIb/IIIaFab抗体奠定基础。方法:利用RT-PCR和噬菌体表面展示技术,直接从血小板膜糖蛋白抗体(抗-GPIIb/IIIa)阳性的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者脾细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA,扩增抗体轻链和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次将PCR产物插入噬粒载体pComb3H相应位点,电转化大肠杆菌XL1-blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建成人源性Fab噬菌体抗体库。结果:成功地构建库容量达6.2×106的抗血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIaFab噬菌体抗体库。结论:构建了人源性Fab抗体库,并达到建库标准,可进一步从中筛选人源性Fab抗体。

人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab噬菌体抗体库的筛选与鉴定

目的从已构建的人源性抗血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP)Ⅱb/ⅢaFab噬菌体抗体库中筛选人源性抗血小板膜GPⅡb/ⅢaFab抗体,并对特异性阳性克隆进行鉴定。方法以表达GPⅡb/Ⅲa的CHO123细胞包板,对人源性抗血小板膜GPⅡb/ⅢaFab噬菌体抗体库进行富集筛选,采用细胞ELISA法筛选特异性阳性克隆,用Western blot法鉴定表达蛋白与GPⅡb/Ⅲa结合的特异性,将阳性克隆进行扩增、测序。结果以CHO123细胞富集淘筛3轮,并用ELISA法检测到2个高亲合力的特异性识别血小板膜GPⅡb/Ⅲa的克隆,Westernblot鉴定结果显示在阳性克隆的培养上清和细菌冻融上清均有特异性条带出现。对核苷酸序列进行同源性分析,证实这两个克隆轻链基因与人免疫球蛋白κ轻链的同源性分别高达97%和98%,重链基因与人免疫球蛋白Fd段的同源性分别高达94%和93%。结论利用噬菌体抗体库技术,成功地从人源性抗血小板膜GPⅡb/ⅢaFab抗体库中筛选出抗血小板膜GPⅡb/Ⅲa的特异性阳性克隆,该克隆具有较高的特异性,其克隆基因符合抗体可变区结构特点。