人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体的构建

目的构建带信号肽和不带信号肽的人血小板衍生生长因子B(PDGF-B)链基因酵母表达载体,探讨该基因在酵母中的表达效率和活性。方法利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人血管内皮细胞总RNA中扩增出PDGF-B的cDNA,克隆入pGEM-T载体,进行序列测定。进而克隆至酵母表达质粒pMETB和pMETαA并进行重组子双酶切鉴定。结果扩增获得了含信号肽(578 bp)和不含信号肽(340 bp)的编码PDGF-B链基因;构建了PDGF-B的酵母表达载体pMETB-PDGFB1,pMETαA-PDGFB2。测序结果显示,重组载体中目的基因序列与GENE BANK公布的序列一致。结论人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体构建成功,为进一步在酵母中的高效表达奠定基础。

血小板衍生生长因子B链在pN0期非小细胞肺癌中的表达及与淋巴结微转移的关系

目的探讨血小板衍生生长因子B链(PDGF-B)在pN0期非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及与淋巴结微转移关系。方法采用免疫组化链霉菌蛋白生物素(LSAB)法检测PDGF-B在50例pN0期的NSCLC患者原发灶(152枚淋巴结)及22例癌旁组织中的表达,通过细胞角质蛋白(CK)抗体为标志物来检测pN0期NSCLC的淋巴结微转移情况。结果pN0期NSCLC组织中PDGF-B的阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.05);50例pN0期NSCLC患者中16例患者检测存在微转移;152枚淋巴结中,CK表达阳性率为18.42%(28/152);pN0期NSCLC患者淋巴结微转移与临床分型有关,ⅠB期和ⅡB期NSCLC患者的淋巴结微转移发生率较高(P均<0.05)。结论以CK细胞角质蛋白抗体为标志物检测pN0期NSCLC淋巴结微转移情况及pN0期NSCLC中PDGF-B与淋巴结微转移的关系可准确NSCLC的分期,为早期NSCLC患者的个体化治疗提供理论依据,并显著提高患者的长期生存率。

血小板源生长因子及其B链基因转录调控

血小板源生长因子 (PDGF)是机体内主要的促分裂剂和趋化剂之一 ,PDGF是一个二聚体家族 ,至少由四种不同的基因表达产物组成。最近 ,PDGF B链的基因转录调控日益受到重视 ,一些顺式调控元件和相应的反式作用因子已被证实。

人血小板衍生生长因子B链成熟肽基因克隆及表达

目的 获得足量的PDGF BB蛋白 ,作为PDGF BB促进骨折愈合及创伤修复等进一步功能研究和临床应用的基础。方法 用基因重组技术构建pQE PDGF B原核表达载体 ,在M15大肠杆菌中进行PDGF B单体蛋白的表达。结果 经酶切鉴定、PCR鉴定及基因测序证明 ,pQE30载体上成功地插入了PDGF B成熟肽基因 ;重组表达载体pQE PDGF B在M15大肠杆菌中得到了高效表达 ,表达量约占全菌蛋白的 15 % ,表达的PDGF B单体蛋白经SDSPAGE电泳 ,显示了一条特异蛋白带 ,分子量为 15kD左右。结论 PDGF B原核表达载体的成功构建和PDGF B单体蛋白制备纯化为生产活性PDGF BB蛋白及其进一步功能研究奠定了基础。

氧应激在TNF-α诱导人内皮细胞PDGF-B链基因表达中的作用

探讨氧应激在肿瘤坏死因子α(TNF α)诱导血管内皮细胞血小板衍生生长因子 B(PDGF B)链基因表达中的作用。培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)以TNF α处理或预先以小分子抗氧化剂N 已酰半胱氨酸 (NAC)处理 ,用ELISA和RT PCR法分别检测PDGF B的蛋白和mRNA表达 ,用氧化 还原敏感的荧光探针 2 ,7 Dichlorofluorescein(DCF)检测细胞内的氧化 还原水平。结果显示 ,TNF α(2 0 0U/mL)作用 2 4h后 ,HUVECs中PDGF B的蛋白含量和mRNA表达均明显增加 ,分别较对照组增加 5 0 %和 12 9% (P <0 0 5 ) ,但小分子抗氧化剂N 已酰半胱氨酸 (NAC ,2 0mmol/L)能明显阻断TNF α对PDGF B蛋白和mRNA表达的诱导作用。TNF α处理后 4hHUVEC的氧应激水平明显升高 ,至 2 4h时仍维持在较高水平 ,但可被NAC完全抑制。这些结果提示TNF α诱导血管内皮细胞PDGF

高胆固醇血症大鼠主动脉内皮细胞NF-κB的激活和血小板源生长因子B链的表达

目的 验证体外培养的内皮细胞经轻微修饰低密度脂蛋白 (mm LDL)刺激后激活细胞核因子κB(NF κB)的现象可否同样在高胆固醇血症大鼠主动脉内皮细胞内出现并促进血小板源生长因子B链 (PDGF B)的表达 ,以及年龄对NF κB PDGF B信号传导通路的影响。方法 胃饲高胆固醇乳剂建立高胆固醇血症大鼠模型 ,免疫组织化学染色法 [链霉素抗生物素蛋白 过氧化物酶 (SP)法 ]明确主动脉内皮细胞NF κB激活后发生核转位的情况 ;应用原位杂交技术观察内皮细胞PDGF BmRNA的表达 ,同时应用免疫组织化学染色法 (SP法 )观察内皮细胞合成PDGF B链的情况。结果 与对照组相比 ,胃饲高胆固醇乳剂 6周后 ,2个月龄大鼠出现高胆固醇血症 ,主动脉内皮细胞NF κB核转位的比例明显增加 ,PDGF BmRNA的表达也增多。 10个月龄对照组Wistar大鼠的主动脉内皮细胞几乎不表达PDGF BmRNA ,摄入高胆固醇乳剂 16周后 ,内皮细胞表达PDGF BmRNA明显增多。较之摄入胆固醇同时期的 2个月龄大鼠 ,NF κB的核转位及内皮细胞PDGF B链的合成均增多(0 4 6 1± 0 0 75比 0 35 0± 0 0 94 ;0 2 30± 0 0 4 0比 0 185± 0 0 37) ,其差异有显著性意义 (P <0 0 5 ;P <0 0 0 1)。结论 高胆固醇血症能激活大鼠主动脉内皮细胞的NF κB 。

靶向性血小板衍生生长因子siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的 构建靶向性血小板衍生生长因子(PDGF)B链的小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒,为进一步研究PDGF基因功能奠定基础.方法 根据PDGF-B链序列设计合成含靶向PDGF基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有Bam HI、HindIII酶切位点的pSilencer3.1-Hlhygro质粒连接,转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列.结果 PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实PDGF siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致.结论 成功构建了靶向性PDGF基因的siRNAs表达质粒.

三链形成寡核苷酸对大鼠脑胶质瘤生长和血管生成影响的研究

目的观察原位注射血小板源生长因子(PDGF)B链基因(PDGF-B)的三链形成寡核苷酸(TFO)对大鼠脑胶质瘤生长和血管生成的抑制作用。方法实验大鼠18只均在立体定向导引下行右尾状核区微量灌注1×106C6胶质瘤细胞,其中实验Ⅰ和Ⅱ组在细胞接种后第8d开始分别原位注射TFO1.5mg/20μl和3.0mg/20μl的生理盐水,以后每隔72h原位注射相同剂量的TFO,共注射3次。对照组仅在相同时间原位注射20μl生理盐水。实验3周时处死所有的大鼠,观察肿瘤的生长情况,观察肿瘤PDGF-B的表达、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤核增殖抗原(PCNA)表达。结果实验Ⅰ组的成瘤抑制率为66.0%,实验Ⅱ组为92.2%,两组比较差异有极显著性(P<0.01)。TFO对C6胶质瘤细胞PDGF-B、VEGF、PCNA表达有明显的抑制作用;原位应用TFO能抑制PDGF-B表达,使胶质瘤细胞增殖能力降低,抑制血管生成。结论TFO抑制肿瘤生长与抑制胶质瘤细胞增殖及抑制血管生成有关。

PDGF-A基因逆转录病毒载体的构建及其在猪骨髓间充质干细胞中表达的研究

目的克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bMSCs进行创面修复奠定基础。方法采用RT-PCR二步分离法,以人肝癌细胞总RNA为模板,扩增PDGF-A基因的全长cDNA编码序列,构建PDGF-A基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并将其导入病毒包装细胞PA317中,经G418筛选并扩增,以病毒液感染NIH3T3细胞,选出抗性克隆,测其病毒滴度,将高滴度病毒液感染bMSCs。采用RT-PCR、Southern blot和ELISA法,分别检测PDGF-A基因转染bMSCs的效率及PDGF-A在bMSCs中的表达水平;光镜、MTT法、成骨与成脂诱导分别检测bMSCs转染PDGF-A基因后的生长状态、增殖情况及干细胞特性。结果经测序验证,克隆到PDGF-A基因的全长cDNA序列与GenBank所报告的该基因序列完全一致。成功构建了PDGF-A链基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并实现了PDGF-A基因在bMSCs的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后的生长状态、增殖情况良好,且仍具干细胞特性。结论成功地将PDGF-A基因克隆到pLXSN载体中,并实现了PDGF-A基因在bMSCs中的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后仍具干细胞特性。

隆突性皮肤纤维肉瘤55例临床病理分析

目的:分析55例隆突性皮肤纤维肉瘤(dermatofibrosarcoma protuberans,DFSP)患者的临床表现和病理,讨论其诊断和鉴别诊断要点,提高对该肿瘤的认识。方法:回顾性分析昆山地区2007年1月—2021年1月期间诊断的55例DFSP患者的临床表现、病理组织学特点、治疗及预后。结果:DFSP临床多表现皮肤瘢痕或萎缩性斑块结节,表面可有破溃,肿块直径平均(3.31±1.04)cm。发病部位主要为躯干、头颈肩部,也可发生于乳房、腹股沟等少见部位。病变多位于真皮层,单发结节,偶为多发,切面呈褐色、粉红色、灰白色,与周围组织界限相对较清,可浸润皮下脂肪及横纹肌。组织形态大多为梭形、短梭形,可呈轮辐状、漩涡状或花边样排列,可伴有黏液变性,间质硬化,以及出现色素细胞分布。免疫组织化学染色显示肿瘤细胞主要表达CD34和Vimentin,也可在胞质表达BCL-2和β-Catenin。4例行FISH荧光原位杂交分子检测,结果均存在血小板衍生的生长因子B链基因重排。55例DFSP中行局部扩大切除术14例,行局部切除术41例。随访的30例患者中6例术后局部复发。结论:DFSP是易发生于真皮的低度恶性软组织肿瘤,掌握DFSP的临床病理特点,通过免疫组织化学染色标记及分子检测能有效地诊断,避免与其他皮肤梭形细胞肿瘤混淆;主要的治疗方式是外科手术扩大切除,局部切除易复发。

重组真核表达载体pEGFP-N1/PDGF-A的构建及真皮干细胞的转染

目的克隆血小板衍生生长因子A链(plateletderivedgrowthfactorAchain,PDGFA)基因,以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)载体pEGFPN1为骨架,携带PDGFA基因进入真皮间充质干细胞(dermisdrivedmesenchymalstemcells,DMSCs),为采用转入PDGFA基因的DMSCs修复创面奠定基础。方法采用RTPCR二步分离法,以人肝癌细胞系(SMC7721)的总RNA为模板,扩增PDGFA基因的全长cDNA编码序列,克隆入载体pMD18T,随后又将PDGFA基因亚克隆入pEGFPN1载体中,构建PDGFA基因的真核表达载体pEGFPN1/PDGFA,并采用Fugene6介导转染技术将PDGFA基因导入DMSCs。结果克隆到PDGFA基因的全长cDNA序列,经测序验证,其序列与GenBank所报告的该基因的序列完全一致。结论成功地将PDGFA基因克隆到pEGFPN1载体中,并实现了PDGFA基因在DMSCs的表达。

胃肠道间质瘤的诊断进展

胃肠道间质瘤(GIST)作为最常见的胃肠道间叶源性肿瘤,经常规方法及病理手段可诊断大部分病例,而大部分对酪氨酸激酶抑制剂(如伊马替尼)敏感,部分病例对伊马替尼不敏感,致病机制至今仍不明确。基本的诊断不能满足目前治疗的需要,通过基因突变及表达情况检测可进一步明确诊断,在判定GIST对小分子酪氨酸激酶抑制剂苯磺酸伊马替尼的敏感性方面有指导意义,从而指导靶向治疗。