可溶微针负载富血小板裂解液对糖尿病小鼠创面愈合的基础研究

目的采用羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMCS)负载富血小板血浆裂解液(platelet-rich plasma lysate,PL)制备微针,探究PL微针在治疗糖尿病创面领域的应用前景。方法使用CMCS作为基础材料,加入适量聚乙烯基吡咯烷酮K-60(Polyvinylpyrrolidone,PVPK-60)共同制备不同浓度的针体材料,通过考察成针率,形貌特征及力学性能等,确定最佳浓度,并考察PL微针中生长因子活性。制备糖尿病小鼠背部创面,随机分为4组治疗,对照组不做任何处理,PL涂抹组使用PL涂抹,空白微针组使用不含有PL的微针,PL微针组使用含有PL的微针,通过大体观察,H&E染色及免疫组化的检测结果,评价PL微针应用于糖尿病小鼠创面愈合的效果。结果当PVPK60为40 mg/mL时,成针率为100%,阵列完整,针体饱满,针尖锐利。根据力学-位移曲线与砝码压变实验结果显示制备的PL微针具有较好的机械强度。生长因子检测结果显示,PL中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量为(625±35)pg/mL,血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)含量为(18741±1287)pg/mL,制备成针后,VEGF含量为(183±2)pg/mL,PDGF-BB含量为(8049±1157)pg/mL,成针后生长因子浓度虽有所降低,但仍较好地保持了生长因子活性。糖尿病小鼠创面愈合实验结果显示,PL微针组愈合较好,创面愈合率相较于前3组有差异(P<0.01)。H&E染色结果显示PL微针组可见较少的炎细胞浸润和出血点;对照组组织内成纤维细胞,新生毛细血管数量均低于PL涂抹组与PL微针组。免疫组化结果显示PL微针组促炎因子IL-6表达下降,抗炎因子TGF-β表达上升,血管新生指标CD31表达上升,且于其他3组有明显差异(P<0.01)。结论本实验制备的PL微针具有较好的机械性能,能较好地保持生长因子活性,对糖尿病小鼠创面愈合有着积极的作用,为糖尿病创面愈合提供了新思路。

体外冲击波联合血小板裂解液局部注射治疗难治性肱骨外上髁炎的效果分析

分析难治性肱骨外上髁炎治疗中应用体外冲击波、局部注射血小板裂解液的效果。方法:选取2021年9月~2022年8月难治性肱骨外上髁炎患者70例,根据疗法分组,A组(体外冲击波+血小板裂解液)35例,B组(体外冲击波)35例,比较患处疼痛程度、肘关节功能、疗效。结果:疼痛程度比较,A组静息疼痛[(0.85 ± 0.49)分]低于B组[(1.06 ± 0.51)分](P<0.05),A组Thomsen疼痛[(3.17 ± 0.74)分]低于B组[(3.90 ± 0.46)分](P<0.05),A组触压疼痛与B组无显著差异(P>0.05);肘关节功能比较,A组[(59.68 ± 6.04)分]高于B组[(77.23 ± 4.92)分](P<0.05);疗效比较,A组[77.14 %(27 / 35)]高于B组[68.57 %(24 / 35)],组间差异显著(P<0.05)。结论:在体外冲击波治疗基础上针对患处注射血小板裂解液可缓解疼痛,促进肘关节功能恢复,提高疗效,应用价值显著。

血小板裂解液与血小板凝胶生长因子谱的表达差异研究

目的研究富血小板血浆(PRP)在不同制备条件下生长因子表达谱的变化,为临床治疗选择不同类型PRP提供实验依据。方法使用血液成分分离机单采7份PRP(30 mL/份),同一份PRP各留取10 mL并随机分成贫血小板血浆(PPP)对照组、PRP凝胶上清组和PRP裂解液组,PRP凝胶上清组采用牛凝血酶和葡萄糖酸钙制成预混剂,预混剂与PRP按照1∶9的比例添加以获取PRP上清液;PRP裂解液组采用在–20℃和37℃反复冻存融化5次,获取血小板裂解液。应用Quantibody®生长因子蛋白芯片检测获取的样品中生长因子谱的变化,并采用ELISA对差异生长因子进行验证。结果与PPP对照组比较,在PRP凝胶上清组中共有5个生长因子表达升高,分别为脑源性神经营养因子(BDNF,14.64倍),血小板衍生生长因子(PDGF-AA,4.53倍),表皮细胞生长因子(EGF,4.52倍),血管内皮生长因子(VEGF,3.45倍)和肝细胞生长因子(HGF,2.16倍),GO和KEGG分析表明这些因子主要富集于细胞迁移和Ras及PI3K-Akt信号通路激活,参与组织修复;而在PRP裂解液组中升高的生长因子分别为BDNF(20.74倍),EGF(11.12倍),转化生长因子-β1(TGF-β1,5.76倍),减少的生长因子是胰岛素样生长因子结合蛋白-6(IGFBP-6,1.46倍),这些因子主要富集于MAPK信号通路和FoxO信号通路发挥抗炎作用。结论PRP凝胶上清和PRP裂解液均可释放多种生长因子;PRP凝胶上清产生的生长因子主要参与创面修复和伤口愈合,而PRP裂解液产生的生长因子主要参与组织修复和抗炎,因此针对不同的临床治疗目的,应选择不同方式制备的PRP制品,以达到最佳的治疗效果。

BMSCs成骨分化的干预效应血小板裂解液对大鼠

目的观察血小板裂解液(platelet lysate,PL)对大鼠BMSCs成骨诱导分化的干预效应。方法成年健康清洁级Wistar大鼠24只,体重250～300 g,雌雄不限。取16只大鼠心内采血,采用3次离心结合反复冻融法制备PL,ELISA法测定PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量。另取8只大鼠,采用全骨髓分离培养法扩增传代BM SCs,取第4代细胞按1×104/cm2接种行成骨诱导培养。按诱导培养液的不同,实验分为3组,A、B组基础诱导培养基中分别含终浓度为5%和1%的PL,C组仅含基础诱导培养基。倒置相差显微镜动态观察各组细胞形态变化及生长状况;诱导培养7 d,各组行ALP染色;诱导培养2、8、10 d,ALP/总蛋白含量确定ALP活性;诱导培养20 d,茜素红染色观察矿化结节形成并定量分析。结果PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量分别为(300±30)、(140±25)、(80±35)和(70±20)pg/mL。倒置相差显微镜观察,各组BMSCs形态逐渐发生改变,出现类成骨细胞样形态特征;A组细胞形态变化不及B、C组明显,但细胞增殖较快;20 d A组细胞仍密集生长,ECM中形成的矿物沉积显著少于B、C组。诱导培养7 d,A组细胞胞浆中有少量颗粒,ALP染色呈弱阳性;B、C组细胞胞浆中有大量棕褐色颗粒,ALP染色呈强阳性。诱导培养2、8、10 d,ALP活性定量分析示A组显著低于B组和C组(P<0.05)。诱导培养20 d,茜素红染色显示A、B、C组钙结节数量分别为(7.67±1.10)、(12.87±0.81)和(15.59±1.25)个;矿化结节面积分别为(161 778.70±44 550.80)、(337 349.70±56 083.24)和(415 921.70±71 725.39)像素;A组均明显低于B组和C组(P<0.05),B、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论PL是多种生长因子的承载体系,以剂量依赖方式抑制BMSCs成骨诱导中ALP活性和矿化结节形成。

人血小板裂解液替代胎牛血清促进骨髓间质干细胞的增殖

目的探讨人血小板裂解液(human platelet lysates,HPL)对骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖以及生物学特性的影响。方法通过对机采血小板反复冻融获得HPL,采用密度梯度离心法从骨髓中分离MSCs,分别用10%胎牛血清(feotal calf serum,FCS)和LD-DMEM添加不同浓度的HPL进行培养,以确定最佳HPL浓度。分离6株人源MSCs,从原代开始分别用添加胎牛血清和最佳HPL浓度的LD-DMEM进行培养,对两种培养体系下6株不同来源的MSCs的增殖能力,表面标记表达量以及细胞周期进行研究,并利用t-test进行统计学分析,P<0.05视为有统计学差异。结果研究发现HPL中含有MSCs生长所必需的4种生长因子,PDGF-AB(人血小板衍生生长因子AB),bFGF(成纤维细胞生长因子),IGF-1(胰岛素样生长因子1),TGF-β1(转化生长因子β1),浓度分别为:(0.53±0.06)ng/ml,(37.5±4.31)pg/ml,(0.15±0.06)mg/ml,(5150±463)pg/ml。适合MSCs增殖的最佳HPL浓度为7.5%。两种培养条件下的细胞形态无明显区别,均为长梭形。8代以前,细胞增殖能力没有显著性差异(P>0.05),两种培养条件下的MSCs均表达CD105,CD106以及粘附分子CD29和CD44,不表达CD34,CD45,且其表达量没有显著性差异(P>0.05)。两种培养体系下绝大多数细胞处于G0-G1期,FCS培养的MSCs其G0-G1期占(96.97±0.95)%,7.5%的HPL培养的MSCs其G0-G1期占(94.58±1.56)%,两种培养条件下不同周期没有显著性差异(P>0.05)。结论本研究适合MSCs增殖的最佳HPL浓度为7.5%,HPL可以替代胎牛血清体外培养扩增人骨髓间质干细胞,并保持其生物学特性基本不变。

血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响

背景:血小板裂解液是将浓缩血小板进一步裂解后所获得的液体成分,含有多种生物活性因子。有研究认为血小板裂解液可促进成骨细胞的增殖,而其对骨髓间充质干细胞生物学功能的影响还不太了解。目的:探讨血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖的影响。设计、时间及地点:独立样本观察,于2007-09/2008-01在山西省医用组织库完成实验。材料:清洁级成年健康Wistar大鼠8只。方法:取2只大鼠股骨,全骨髓培养法传代扩增骨髓间充质干细胞。自6只大鼠心内采血,采用3次离心结合反复冻融法制备血小板裂解液。取第5代骨髓间充质干细胞,以含10%胎牛血清的L-DMEM/F12作为基础培养基组,在此基础上分别加入血小板裂解液至终浓度为1%和5%作为条件培养基组。主要观察指标:ELISA法测定血小板裂解液中生长因子含量。CASY细胞分析仪计数活细胞。双缩脲法全自动生化分析仪检测细胞总蛋白含量。倒置显微镜动态观察细胞形态变化与生长状况。结果:①血小板裂解液中的血小板衍生生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1和血管内皮细胞生长因子含量分别为(300±30),(140±25),(80±35),(70±20)ng/L。②自培养第3天开始,条件培养基组活细胞数均明显高于基础培养基组(P<0.05),且含5%血小板裂解液的条件培养基组升高幅度尤为显著,于第3天达到对数生长期,比基础培养基组提前约1d,细胞总数在第4,9天时达基础培养基组的近3倍。③培养1周后条件培养基组每106个细胞中的总蛋白含量均显著高于基础培养基组(P<0.05)。④骨髓间充质干细胞在不同浓度血小板裂解液培养条件下,细胞形态基本一致,多为长梭形,类似于成纤维细胞。结论:血小板裂解液是多种生长因子的承载体系,具有丝裂原功效,可在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞的生长增殖,且该效应存在一定程度的剂量依赖性。

富血小板血浆与血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞增殖影响的比较

目的通过对比分析富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)与血小板裂解液(platelet lysate,PL)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)生长增殖、细胞周期的作用,探讨二者对大鼠BMSCs生长增殖的影响。方法取20只4周龄SD大鼠,采用全骨髓分离培养法扩增传代BMSCs,并采用流式细胞仪鉴定;另取30只12周龄SD大鼠心内采血,梯度离心法获得PRP,采用3次离心结合反复冻融法制备PL。取生长状态良好的第3代BMSCs进行实验,根据培养基成分不同将实验分为7组,普通完全培养基组(A组)、1%PRP条件培养基组(B组)、1%PL条件培养基组(C组)、5%PRP条件培养基组(D组)、5%PL条件培养基组(E组)、10%PRP条件培养基组(F组)及10%PL条件培养基组(G组)。MTT检测BMSCs增殖情况;免疫荧光检测BMSCs中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况;流式细胞仪检测BMSCs细胞周期的变化;蛋白质印迹检测CyclinD1和p27Kip1蛋白表达。结果培养24、48、72h时,1%、5%、10%PRP与1%、5%、10%PL条件培养基组均可以促进BMSCs的增殖,并具有时间、剂量依赖性(P<0.05);相同浓度的PRP与PL对BMSCs增殖作用的差异均无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光检测显示,PRP与PL均可以促进PCNA蛋白表达(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.01)。流式细胞仪检测显示,不同浓度PRP及PL条件培养基组与普通完全培养基组比较,G0/G1期细胞比例逐渐减少,S、G2/M期细胞比例逐渐增多,增殖指数(PI)升高,差异具有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖性(P<0.05);然而,相同浓度的PRP及PL对BMSCs细胞周期的影响相似,差异均无统计学意义(P>0.05)。蛋白质印迹检测结果显示,5%PRP与5%PL能促进CyclinD1表达上调和p27Kip1表达下调。结论不同浓度PRP与PL能够通过上调CyclinD1以及抑制p27Kip1蛋白的表达,加快体外培养的大鼠BMSCs的细胞周期进程,促进BMSCs增殖,并呈现显著的时间、剂量依赖性;BMSCs增殖过程中,相同浓度PL与PRP的促增殖效果相同,PL可能代替PRP促进骨缺损修复。

血小板裂解液对人脐带间充质干细胞体外成骨分化的影响

背景:血小板裂解液是浓缩后血小板的裂解产物,含有多种活性成分。有研究表明这些活性成分可促进间充质干细胞的增殖和分化,但血小板裂解液作为一个整体,对间充质干细胞成骨分化的作用尚不明确。目的:分析血小板裂解液对人脐带间充质干细胞成骨诱导分化的干预效应。方法:采用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,体外培养扩增,流式细胞仪进行细胞表型鉴定。实验分为以下4组:普通矿化液组,血小板裂解液组,矿化液-血小板裂解液联合诱导组,对照组。加入相应诱导培养基诱导培养2周。结果与结论:分离得到的人脐带间充质干细胞的细胞表型CD34(-)﹑CD45(-)、HLA-DR(-),CD44(+)﹑CD105(+)﹑CD146(+)。茜素红染色在3个诱导组中皆为阳性,染色效果未见明显差异,而对照组阴性。碱性磷酸酶活性测定显示3个诱导组的碱性磷酸酶活性都明显高于对照组(P<0.05),矿化液-血小板裂解液联合诱导组碱性磷酸酶活性明显高于普通矿化液组和血小板裂解液组(P<0.05)。结果显示在体外条件下,单纯的5%血小板裂解液可以诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞定向分化,且联合应用矿化液时能更有效地诱导人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞。

血小板裂解液对人根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞体内外增殖、矿化能力的影响

目的:研究血小板裂解液(Platelet Lysate,PL)在体内外对人根尖牙乳头干细胞(SCAP)和牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖、矿化的干预效应,以期找到PL应用于这两种细胞的最佳方式。方法:在矿化诱导培养体系中按一定体积比加入PL,分别作用于体内、外复合HA-TCP支架材料三维生长的SCAP和PDLSCs,扫描电镜(SEM)以及组织学观察细胞生长、分化情况。结果:体外三维培养模式下,PL能够促进SCAP和PDLSCs的增殖以及矿化细胞外基质的形成,并利于在支架材料上形成完整的细胞膜片(cell sheet)样结构,以上效应对于PDLSCs作用更为显著。而在体内移植模式下,经50 mL/L、10 mL/L PL培养体系预培养的SCAP能形成包含成牙本质细胞样细胞、牙本质样基质和牙髓组织的牙本质牙髓复合体样结构;而PDLSCs经50 mL/LPL干预后,可分化为成牙骨质细胞样细胞,并生成牙骨质样基质、牙周膜样组织。结论:一定体积浓度比的PL能促进SCAP和PDLSCs在体内外的增殖以及成骨、成牙本质分化。

人血小板裂解液对骨髓间质干细胞成骨成脂分化的影响

目的探讨人血小板裂解液(HPL)体外培养人骨髓间质干细胞(MSCs)及其对MSCs成骨和成脂分化能力的影响。方法采用贴壁法分离培养3株人骨髓来源MSCs,每株细胞在培养时平行分为2个实验组,分别用含10%胎牛血清的低糖培养基和含7.5%HPL的低糖培养基培养,均培养MSCs至第5代,分别用成骨及成脂诱导液对每组MSCs做成骨、成脂分化诱导,诱导成功后分别用茜素红、油红O对成骨和成脂分化结果染色鉴定,并进一步对成骨、成脂诱导结果做定量分析:成骨分化染色后洗脱茜素红在562nm波长下测定OD值并对每个培养孔细胞做蛋白定量,以茜素红OD值与蛋白定量值的比值作为成骨分化的定量值;成脂分化染色后用异丙醇洗脱油红O,在510nm波长下测定OD值,以之作为成脂分化的定量值。对所得的结果做统计学分析。结果对第5代的MSCs做成骨诱导12d后,光镜下可见致密结节形成,茜素红染色及定量鉴定结果显示2种培养液培养的MSCs均能成功向成骨细胞分化,而7.5%HPL培养的MSCs成骨能力比10%FBS培养的MSCs强,定量鉴定结果分别为16.548±4.397、4.151±5.631(P<0.05)。成脂诱导12d后,细胞内有明显脂滴形成,油红O染色及定量分析结果显示MSCs成功向脂肪细胞分化,但7.5%HPL培养的MSCs成脂能力与10%FBS培养的MSCs相比较弱,定量鉴定结果分别为0.239±0.030、0.497±0.105(P<0.05)。结论 HPL可以促进MSCs成骨分化,抑制其成脂分化。

血小板裂解液快速扩增人羊膜来源间充质干细胞

目的:研究人血小板裂解液(HPL)扩增的羊膜来源间充质干细胞(AMMSCs)的细胞生物学特征。方法:分别以含7%HPL和10%胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培养介质扩增人AMMSCs,比较含HPL和FBS介质培养扩增的AMMSCs的形态、扩增效率、免疫表型和多向分化潜能。结果:含HPL和FBS培养介质扩增的AMMSCs形态和免疫表型类似。含HPL培养介质能显著加速间充质干细胞(MSCs)的扩增,扩增的AMMSCs能向成骨、软骨和脂肪细胞分化。结论:含HPL培养介质可促进AMMSCs扩增,可为相关临床治疗提供更多人源化、无伦理争议、临床应用障碍少的MSCs。

人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增人脐带间充质干细胞

背景:目前国内外大多数实验仍采用经典的培养基和胎牛血清进行脐带间充质干细胞培养,血清培养潜在的不安全因素限制了未来临床应用的可行性。目的:以人血小板裂解液替代胎牛血清培养、鉴定人间充质干细胞,以期进一步应用于临床低密度扩增人间充质干细胞。方法:人血小板裂解液通过反复冻融、离心、过滤、浓缩等方法制备。以IMDM为基础培养基,添加5%浓缩血小板裂解液作为实验组培养基;以添加体积分数10%胎牛血清为对照组培养基。采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,以3 000/cm2的浓度进行传代培养,待细胞扩增至P5代后,进行细胞形态与直径、免疫表型、成骨成脂分化、克隆形成率等细胞生物学特性检测,并比较两者之间的差别。结果与结论:人血小板裂解液扩增的脐带间充质干细胞形态细长,有更高的细胞累积群倍数;克隆形成检测结果显示两者形成的克隆效率差异无显著性意义,流式细胞术检测结果显示两者有相似的细胞表型,体外诱导分化显示两者都具有成骨、成脂分化能力,但人血小板裂解液扩增的间充质干细胞成骨分化能力更强。提示人血小板裂解液可以取代胎牛血清用于临床低密度扩增人间充质干细胞。

混合血小板裂解液对人骨髓间充质干细胞原代培养、增殖和成骨分化的影响

目的研究混合血小板裂解液(pHPL)对体外培养的人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)原代培养、增殖和成骨分化的影响。方法使用临床过期的多份浓缩血小板混合,多次冻融激活后制备pHPL,分别使用胎牛血清(FBS)和pHPL加基础培养液原代培养hBMMSCs,比较两组中的细胞形态、表面标志物、细胞骨架、细胞周期和增殖率,并在加入经典成骨诱导液后检测两组中碱性磷酸酶含量、成骨相关基因含量和矿化结节形成,比较其成骨分化能力。结果FBS和pHPL培养组均能较好地支持hBMMSCs的原代培养,两组中细胞形态、表面标志物、细胞骨架、细胞周期均无明显差异,但pHPL组在5、7d时的细胞增殖率明显高于FBS组(P<0.05);在成骨诱导后,pHPL组中碱性磷酸酶含量、成骨相关基因含量也明显高于FBS组(P<0.05),两组中细胞均可以形成成熟的矿化结节。结论pHPL能够很好支持hBMMSCs的原代培养、增殖和成骨分化,且较FBS能更好地促进其增殖和成骨分化。

血小板裂解液对人根尖牙乳头干细胞体外增殖的影响

目的:评价血小板裂解液(PL)对根尖乳头干细胞(SCAP)增殖的影响,为PL代替胎牛血清(FBS)提供依据。方法:用显微镜观察SCAP的生长特征,用流式细胞仪检测细胞的表面标志物,用茜素红染色检测细胞的成骨分化能力。将SCAP分为四组,分别在培养基中加入PL(2%、5%和10%)和10%FBS。培养第1、3、5、7d后用MTT检测各组SCAP的增殖情况。结果:流式细胞分析表明SCAP表达CD73、CD90和CD105呈阳性,CD14、CD34和CD45呈阴性。SCAP骨向分化呈阳性。2%PL与10%FBS组之间细胞增殖差异不具有统计学意义(P<0.05),5%PL组与10%FBS组之间细胞增殖差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在对SCAP的增殖方面,2%PL与10%FBS的作用相近。5%PL强于10%FBS。

关节腔注射血小板裂解液联合硫酸软骨素对膝关节炎患者膝关节功能的影响

目的探讨关节腔注射血小板裂解液联合硫酸软骨素对膝关节炎患者膝关节功能的影响。方法选择2018年12月~2020年12月收治的84例膝关节炎患者,应用双色球法随机分为对照组和试验组,各42例。对照组口服氨基葡萄糖、硫酸软骨素治疗,试验组在对照组基础上实施关节腔注射血小板裂解液治疗。比较两组治疗后的临床疗效,治疗前后的膝关节功能及血清因子水平。结果对照组总有效率为76.19%,低于试验组的95.24%(P<0.05)。两组治疗后,疼痛、不安定度、闭锁感、肿胀度、楼梯攀爬、蹲姿、跛行、使用支撑物及Lysholm总分均较治疗前提高,相比对照组,试验组更高(P<0.001)。两组治疗后Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)水平下降,相比对照组,试验组更低;胰岛素样生长因子(IGF)水平升高,相比对照组,试验组更高(P<0.001)。结论应用关节腔注射血小板裂解液联合硫酸软骨素治疗膝关节炎患者效果更佳,可以改善患者膝关节功能和血清因子水平,值得广泛推广。

血小板裂解液对人间充质干细胞生物学特性的影响

背景:血小板裂解液是自体或异体血小板富集物经裂解后获得的产物,不仅去除了残余的细胞结构,降低了免疫原性,而且保留了其中的多种生长因子,有研究表明它可替代传统培养基中的胎牛血清,对间充质干细胞进行体外扩增。目的:观察血小板裂解液对人骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞生物学特性的影响,为临床细胞治疗及再生医学提供科学的实验数据。方法:采集新鲜血液,经冻融获取血小板裂解液;采集健康成人骨髓和脂肪组织,分别采用密度梯度离心法和Ⅰ型胶原酶消化法获得骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞;对血小板裂解液培养后的骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的细胞形态、细胞表型、分化能力、增殖能力、集落形成能力和细胞因子分泌水平进行检测。结果与结论:应用血小板裂解液在体外成功地培养扩增了骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,两种细胞的细胞形态、细胞表型、集落形成能力、细胞因子分泌水平、成软骨、成骨和成脂肪分化能力等生物学特性无明显差异。脂肪间充质干细胞的累积群倍数高于骨髓间充质干细胞(P<0.05),表明脂肪间充质干细胞具有更强的增殖能力,在体外血小板裂解液培养体系下更适宜进行大规模扩增。

人血小板裂解液促进人羊膜来源间充质干细胞的成骨分化

目的:研究人血小板裂解液(HPL)对羊膜来源间充质干细胞(AMMSCs)成骨分化的作用。方法:分别以含7%HPL(HPL组)和10%胎牛血清(FBS,FBS组)的LG-DMEM培养介质扩增AMMSCs,比较两组扩增AMMSCs效率及其免疫表型SSEA-3和SSEA-4的表达差异。使用MSCs成骨分化培养液诱导AMMSCs成骨,对比观察两组钙盐沉积量、钙化结节、碱性磷酸酶(ALP)活性;提取两组成骨诱导后AMMSCs总RNA,采用RTPCR检测成骨分化调节因子RUNX-2和ALP mRNA相对表达量。结果:HPL组扩增速度快于FBS组;AMMSCs的SSEA-3和SSEA-4表达较FBS组明显下调(P<0.05)。HPL组钙盐沉积量、钙化结节数量、ALP活性以及RUNX-2和ALP mRNA表达量均明显高于FBS组(P均<0.05)。结论:含HPL培养介质可促进AMMSCs成骨分化。

浓缩血小板制备血小板裂解液及其质量特性的初步研究

目的探索浓缩血小板制备血小板裂解液的方法并初步确定所制备血小板裂解液的质量特性。方法富血小板血浆法制备浓缩血小板,以-80℃冰冻8 h/12 h/24 h,37℃空气浴融化反复冻融制备血小板裂解液,检测裂解效率。p H计检测p H值,生化分析仪检测TP、ALB浓度,ELISA方法检测PDGF、VEGF、EGF、TGF-β、IGF-1等细胞因子浓度,并以95%参考区间确定其质量特性。结果 -80℃12 h,37℃反复冻融6次血小板裂解达到>95%,p H、TP、ALB、PDGF-AA/AB/BB、VEGF、EGF、TGF-β、IGF-1 95%参考区间分别为6.72-7.38、(45-57)g/L、(22-38)g/L、(0.98-2.01)ng/m L、(122-293)ng/m L、(5.35-15.6)ng/m L、(0.49-1.82)ng/m L、(2.97-8.03)ng/m L、(177-290)ng/m L、(95-154)ng/m L。结论建立了以浓缩血小板反复冻融制备血小板裂解液的有效方法并初步确立了其质量标准。

血小板裂解液对脐带间充质干细胞增殖与分化的影响

背景:脐带间充质干细胞是近年来干细胞生物学研究中发现的重要细胞之一,在细胞治疗领域有着良好的应用前景。血小板裂解液对于干细胞的增殖及诱导分化都存在不同程度的有利作用,在一定程度上甚至可以代替甚至优于血清在培养基中的作用。目的:对血小板裂解液结合脐带间充质干细胞的研究作一综述。方法:于万方等中文数据库和PubMed等英文数据库中,以"脐带,间充质干细胞,血小板裂解液,分化,增殖"为关键词检索文献,总结脐带间充质干细胞及血小板裂解液的生物学特性和相关临床应用,并汇总有关血小板裂解液对脐带间充质干细胞增殖活性和诱导分化能力影响的研究结果。结果与结论:血小板裂解液对脐带间充质干细胞的增殖活性及诱导分化有正面影响,这使血小板裂解液在干细胞移植治疗中将会起到无可比拟的作用。

血小板裂解液对膝骨关节炎模型大鼠疼痛和软骨损伤的影响及作用机制研究

目的:探讨血小板裂解液(platelet lysate,PL)对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)模型大鼠疼痛和软骨损伤的影响及可能的作用机制。方法:取4只SD大鼠从其外周血中分离制备PL,并制成低(1×10~6个·mL^(-1))、中(1×10~7个·mL^(-1))、高(1×10~8个·mL^(-1))3种浓度的PL。取40只SD大鼠,随机分为空白组、模型组、PL低浓度组、PL中浓度组、PL高浓度组,每组8只。空白组不进行造模处理,其余4组大鼠通过向双侧膝关节腔内注射碘乙酸进行KOA造模。造模后第1天开始进行药物干预,PL低、中、高浓度组大鼠双侧膝关节腔分别注射50μL低、中、高浓度PL,空白组和模型组大鼠双侧膝关节腔分别注射等量生理盐水,每周1次,共注射4次。分别于造模结束后第2周和第4周测定各组大鼠的压痛阈值和热痛阈值。痛阈测定结束后处死大鼠,取双侧膝关节进行组织病理学观察并评定Mankin's评分。另取5只SD大鼠,从大鼠关节软骨中分离获取软骨细胞进行体外培养,将培养的第3代软骨细胞分为空白组、模型组、PL低浓度组、PL中浓度组和PL高浓度组,空白组以含10%FBS的培养基进行培养,模型组以含10%FBS和碘乙酸的培养基进行培养,PL低、中、高浓度组分别以含10%FBS和低、中、高浓度PL的培养基进行培养,以CCK-8法测定细胞增殖情况。结果:(1)压痛阈值测定结果。造模结束后第2周时,5组大鼠的压痛阈值比较,差异有统计学意义[(385.04±116.23)g,(179.23±74.75)g,(257.60±70.97)g,(306.79±56.91)g,(352.13±67.03)g,F=8.255,P=0.000]。模型组的压痛阈值低于空白组、PL低浓度组、PL中浓度组和PL高浓度组(P=0.001,P=0.045,P=0.002,P=0.000);PL高浓度组的压痛阈值高于PL低浓度组和PL中浓度组(P=0.000,P=0.001);PL中浓度组的压痛阈值高于PL低浓度组(P=0.001)。造模结束后第4周时,5组大鼠的压痛阈值比较,差异有统计学意义[(540.58±97.70)g,(352.81±54.41)g,(419.17±44.74)g,(460.43±63.73)g,(493.38±62.53)g,F=9.137,P=0.000]。模型组的压痛阈值低于空白组、PL低浓度组、PL中浓度组和PL高浓度组(P=0.000,P=0.018,P=0.003,P=0.000);PL高浓度组的压痛阈值高于PL低浓度组和PL中浓度组(P=0.000,P=0.002);PL中浓度组的压痛阈值高于PL低浓度组(P=0.002)。(2)热痛阈值测定结果。造模结束后第2周时,5组大鼠的热痛阈值比较,差异有统计学意义[(8.35±2.17)s,(5.90±1.67)s,(6.77±1.08)s,(7.48±0.91)s,(8.24±1.65)s,F=4.248,P=0.007]。模型组的热痛阈值低于空白组、PL中浓度组和PL高浓度组(P=0.013,P=0.014,P=0.007);模型组与PL低浓度组热痛阈值比较,差异无统计学意义(P=0.118);PL高浓度组的热痛阈值高于PL低浓度组和PL中浓度组(P=0.000,P=0.024);PL中浓度组的热痛阈值高于PL低浓度组(P=0.002)。造模结束后第4周时,5组大鼠的热痛阈值比较,差异有统计学意义[(9.75±2.10)s,(6.78±1.46)s,(7.15±1.58)s,(7.91±1.35)s,(8.67±1.55)s,F=4.310,P=0.006]。模型组的热痛阈值低于空白组、PL中浓度组和PL高浓度组(P=0.005,P=0.009,P=0.002);模型组与PL低浓度组热痛阈值比较,差异无统计学意义(P=0.634);PL高浓度组的热痛阈值高于PL低浓度组和PL中浓度组(P=0.000,P=0.019);PL中浓度组的热痛阈值高于PL低浓度组(P=0.025)。(3)膝关节软骨病理学观察结果。5组大鼠膝关节软骨Mankin's评分比较,差异有统计学意义[(1.63±1.11)分,(9.29±1.03)分,(5.14±1.64)分,(3.14±1.73)分,(2.57±1.40)分,F=37.299,P=0.000]。模型组的Mankin's评分高于空白组、PL低浓度组、PL中浓度组、PL高浓度组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);PL高浓度组的Mankin's评分低于PL低浓度组(P=0.013);PL中浓度组的Mankin's评分与PL高浓度组、PL低浓度组比较,差异均无统计学意义(P=0.541,P=0.062)。(4)膝关节软骨细胞增殖测定结果。5组软骨细胞的吸光度比较,差异有统计学意义(0.71±0.06,0.46±0.01,0.58±0.02,0.66±0.11,0.69±0.01,F=25.644,P=0.000)。模型组的吸光度低于空白组、PL低浓度组、PL中浓度组和PL高浓度组(P=0.001,P=0.000,P=0.016,P=0.000);PL高浓度组的吸光度高于PL低浓度组(P=0.000);PL中浓度组的吸光度与PL高浓度组、PL低浓度组比较,差异均无统计学意义(P=0.639,P=0.204)。结论:PL可提高KOA模型大鼠疼痛阈值,修复软骨损伤,且其作用效果与PL的剂量有关,其作用机制可能与PL能促进软骨细胞增殖有关。