副溶血弧菌的溶血毒素研究现况

副溶血弧菌可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病 ,其致病因子是该菌产生的多种溶血毒素 ,主要有不耐热溶血毒素、耐热直接溶血毒素、相对耐热直接溶血毒素。

实验室培养球形棕囊藻溶血毒素的提取、分离及其生成特征

研究从实验室培养的球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)提取溶血毒素的条件, 探讨不同生长期球形棕囊藻溶血毒素的生成特征, 用薄层色谱法对溶血成份进行了初步分析。结果表明, 球形棕囊藻细胞壁的超声波破碎最适条件为:功率600 W, 4℃下处理30 min。对数生长期、平稳期和衰亡期藻细胞适宜处理量分别为每次3 000、2 000、1 000 ml;在球形棕囊藻生长的平稳期和衰亡期具有明显的溶血活性, 对数生长期溶血活性很低, 甚至检测不到。球形棕囊藻溶血毒素至少含有4种糖脂类化合物。

猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素的克隆表达及其对小鼠免疫保护作用

将猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型分离株的ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA基因和血清5型分离株的ApxⅠA基因分别克隆到原核表达载体pGEX-5X-3,并在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果表明重组菌表达的最佳条件为诱导时间2小时和IPTG终浓度1mmol/L。通过硫酸铵盐析和SephadexG-200凝胶过滤层析纯化表达产物。Westernblot检测结果显示表达产物具有免疫活性。按照不同组合将表达产物与弗氏佐剂等比例混合,制备3种亚单位疫苗。并在30日龄和45日龄免疫小白鼠,在60日龄分别用血清1、3、5、7和10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒。血清1、5和7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒后,3种亚单位疫苗分别提供58.4%、66.6%和91.7%的保护率。试验结果表明重组蛋白具有免疫保护作用,且含有四种融合蛋白的亚单位疫苗免疫保护效果最佳。

米氏凯伦藻溶血毒素的溶血反应特征

探讨了温度、pH值、二价阳离子等对米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi Hasen）溶血毒素溶血活性的影响，分析了米氏凯伦藻溶血毒素的溶血反应特征。结果表明，实验室培养米氏凯伦藻的溶血活性约为64．69±6．43HU L^-1 ，单个藻细胞的溶血活性为6．17-t-0．61×10^-6 HU；在实验温度（0～37％）下，溶血活性随温度的增加而增加；pH6．0时的溶血活性最高；Cu^2＋、Mg^2＋、Mn^2＋、Ca^2＋、C0^2＋、Zn^2＋和№”等对米氏凯伦藻的溶血活性的影响不同。离子浓度为5mmol／L时，HG^2＋的抑制作用最强。高浓度Hg^2＋对红细胞的集合效应不但阻止了HG^2＋进入血细胞诱导的溶血作用，而且阻止了毒素对细胞膜的破坏，但这种抑制作用可被EDTA消除。

微小卡罗藻溶血活性的生长期特征及其溶血毒素种类分析

研究微小卡罗藻的生长曲线及不同生长期藻细胞提取液和去藻上清液溶血活性的大小,通过乙酸乙酯和Bligh-Dyer两种方法提取溶血毒素,利用柱层析和薄层层析对溶血毒素成分进行初步的分离与分析。结果表明,藻细胞提取液在4个生长阶段中都具有明显的溶血活性,去藻上清液在平稳期和衰亡期具有明显的溶血活性,延滞期及对数生长期溶血活性很低,表明微小卡罗藻的溶血物质是其自身正常生理代谢产物,且在细胞老化过程中可以释放至水体环境中。两种提取方法都可以将溶血毒素提取出来,进一步的色谱分离和生物活性检测发现微小卡罗藻主要含有3种不同性质的溶血毒素,其溶血作用可能与微小卡罗藻较高含量的多不饱和脂肪酸18:5n3和22:6n3有关。

海洋微藻溶血毒素研究进展

对海洋微藻溶血毒素的类型、理化性质、生物合成和毒性作用进行了综述,分析了存在的问题和应用前景的展望。

球形棕囊藻溶血毒素对兔红细胞作用的AFM观察

溶血性毒素是有毒藻类分泌较多的一类毒素,具有溶血活性。运用光学显微镜和原子力显微镜(AFM)观察了球形棕囊藻Phaeocystis globosa溶血毒素对兔红细胞的溶血现象。结果显示,经毒素处理后的兔血红细胞边缘凹凸不平,只剩下一小部分残骸。该毒素可能由于其双亲性质与血红细胞膜表面的膜脂连接,产生脂溶效应,使细胞膜破坏。

副溶血性弧菌直接溶血毒素基因的原核表达及产物的性质

目的实现副溶血性弧菌直接溶血毒素tdh基因在大肠杆菌中的表达,鉴定表达产物的生物学活性和免疫原性。方法构建tdh基因的原核表达系统NWⅡtdh/Trc99A/JM109,并在30℃条件下,用0.8mmol/LIPTG诱导表达。用SDS-PAGE分析蛋白表达;溶血试验检测表达蛋白的溶血活性。将表达产物腹腔注射免疫兔,用试管凝集反应试验检测特异性抗体。用溶血抑制试验检测该抗体体外对TDH溶血活性的抑制作用。结果NWⅡ在上述条件下诱导后,TDH呈可溶性、融合性表达。SDS-PAGE表明,表达蛋白的相对分子质量Mr约23000。薄层扫描显示,细菌的周质腔中的蛋白量最高,占总蛋白的13.4%。溶血试验表明,表达的蛋白具有溶血活性。用表达蛋白免疫兔产生的相应抗体,在体外具有抑制TDH溶血活性的作用。结论tdh基因在原核表达系统Trc99A/JM109中获得成功表达,为基因工程大规模制备TDH抗原,制备抗TDH的多克隆和/或单克隆抗体,构建基因工程菌苗,阐明该菌的致病机制打下了基础。

塔玛亚历山大藻溶血毒素对东海原甲藻的化感作用

为明确塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)对东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)生长的化感作用,揭示塔玛亚历山大藻和东海原甲藻的藻间竞争关系,本研究探讨了不同营养盐条件下塔玛亚历山大藻无藻细胞滤液中溶血毒素对东海原甲藻生长的影响.研究发现,塔玛亚历山大藻的无藻细胞滤液中溶血毒素对东海原甲藻的生长有显著的抑制作用;无藻细胞滤液中溶血毒素的活性强弱依次为:N-限制,Fe-限制,富营养与P-限制;溶血毒素的抑制作用大小与溶血毒素活性强弱一致.提示溶血毒素在塔玛亚历山大藻的化感作用中可能扮演重要角色.

副溶血性弧菌三种主要溶血毒素表达体系的构建研究

目的构建副溶血性弧菌三种主要溶血毒素(TDH、TRH和TLH)的重组融合表达体系,给后续这三种溶血毒素的大量获取及其特异性抗体的制备、副溶血性弧菌的致病机理等研究提供基础材料。方法首先将副溶血性弧菌标准菌株tdh、trh与tlh基因分别接入克隆载体pGM-T,并转入E.coliTOP10,进行BamHI、HindIII双酶切鉴定和克隆测序。然后从重组克隆质粒中将tdh、trh与tlh基因目的片段分别双酶切出,将其连接到带His标签的表达载体pET30a(+)中后转入E.coliBL21(DE3)中,先通过BamHI、HindIII双酶切以鉴定所构建表达载体的准确性。接着重组表达菌株经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE电泳和Western-blotting来分析鉴定表达结果。结果表达产物的SDS-PAGE电泳结果显示TDH在29000、TRH在30000、TLH在52000附近处出现明显的表达蛋白条带。利用His标签的特异性抗体进行Western-bloting分析,实验结果显示29000、30000、52000附近处的表达蛋白与His抗体均有特异性反应。结论成功构建了TDH、TRH和TLH溶血毒素的原核表达体系,为进一步免疫原性和特异性抗体制备奠定基础。

海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分离

海洋卡盾藻(Chattonella marina)是我国南方沿海主要的鱼毒性赤潮生物,近年来由该藻形成的赤成已造成多起近岸养殖鱼类大量死亡的事件。为了弄清该藻毒素的基本成分特征,本文研究了室内培养条件下海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取方法,观察了溶血毒素对红细胞的溶血过程,采用薄层色谱法对溶血成分进行了初步分析。结果表明:海洋卡盾藻藻细胞的超声波破碎最适条件为功率400W,4℃下处理15min;通过显微镜观察,证实提取的毒素对血红细胞膜具破坏作用;海洋卡盾藻合成的溶血毒素至少含有4种组分,其中1种可能为为脂类,3种为糖脂类。该研究成果有助于我国今后进一步开展鱼毒性赤潮生物毒素的研究。

高效液相色谱分析鱼毒性藻类海洋卡盾藻溶血毒素

采用高效液相色谱技术(HPLC)分离和分析了海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的甲醇粗提物,通过对比不同流动相、检测波长、等度和梯度洗脱方式,初步建立了分析其溶血毒素的HPLC方法。结果表明,采用梯度洗脱的方法,海洋卡盾藻溶血毒素的粗提物在50 min内取得了较好地分离。色谱条件为C8硅胶柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为乙腈和水,梯度洗脱(0～10 min,60%→80%乙腈;10～40 min,80%→90%乙腈;40～50 min,90%乙腈);紫外检测器检测波长为205和448 nm;流速为0.8 mL/min;柱温为25℃。用兔血红细胞法对各个主要色谱峰进行溶血活性检测显示,海洋卡盾藻(香港株)的溶血毒素至少含有5种成分。光谱分析显示一种成分的紫外吸收高峰在448 nm,一种未完全分离的混合组分的紫外吸收高峰为440和446 nm,另外3种成分的紫外吸收高峰为205 nm。

副溶血弧菌不耐热溶血毒素的表达与纯化

目的 表达和纯化融合表达的副溶血弧菌不耐热溶血毒素。方法 将表达载体 pET3 2a + -tlh转化大肠杆菌BL2 1(λDE3) ,诱导表达副溶血弧菌不耐热溶血毒素 ,表达产物用聚丙稀酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)鉴定 ,8mmol/L的尿素溶解包涵体 ,用 6×his组氨酸蛋白质镍亲和层析树脂亲和层析纯化目的蛋白。结果 诱导表达的目的蛋白以包涵体形式存在 ,其含量约占菌体总蛋白的 10 % ,纯化获得了高纯度的融合表达的副溶血弧菌不耐热溶血毒素。结论 转化有重组质粒pET3 2a + -tlh的BL2 1(λDE3)可稳定高效地表达目的蛋白 ,采用低浓度的咪唑、β -巯基乙醇和Tritonx -10 0等方法减少杂蛋白污染 ,亲和层析纯化目的蛋白 。

卵圆卡盾藻溶血毒素产毒的影响因素研究

研究了卵圆卡盾藻（Chattonella ovata）在不同环境因子下的溶血活性特征。根据卵圆卡盾藻的生长曲线,分别收集对数生长期、稳定期、衰亡期的藻细胞进行溶血毒性的测定。采用不同温度、盐度和营养元素结构的培养基对卵圆卡盾藻进行培养,对不同培养条件下的藻细胞进行溶血活性的测定。结果表明,卵圆卡盾藻衰亡期藻细胞的溶血活性最强,达到29.5×10-7HU/cell（HU,Hemolytic Unit,溶血单位）,其次为对数生长期（21.9×10-7HU/cell）。在10~25℃培养条件下,温度对藻细胞溶血活性无显著影响;在盐度15~25 psu范围内,藻细胞溶血活性变化不明显,而高盐度（33 psu）能够刺激溶血毒素的产生。在Fe限制时,藻细胞溶血活性最强（37.4×10-7HU/cell）,为正常培养条件下（f/2培养基）溶血活性值（18.8×10-7HU/cell）的2.0倍;其次为P限制,藻细胞的溶血活性值为24.1×10-7HU/cell;N、Mn限制条件下藻细胞溶血活性与正常培养条件无显著性差异。

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已有的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列,设计并人工合成引物。将耐热直接溶血毒素的基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达载体tdhA/pGEX-4T-1和tdhS/pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达的工程菌株。优化诱导表达条件,表达耐热直接溶血毒素。转化有重组质粒tdhA/pGEX-4T-1,tdhS/pGEX-4T-1的BL21可稳定高效地表达可溶形式的目的蛋白。表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,用GST琼脂糖珠柱亲和层析纯化。溶血实验表明,表达的蛋白具有溶血活性。

环境胁迫对微小卡罗藻溶血毒素分泌的影响

在实验室条件下,利用溶血实验将培养于不同盐度、pH、温度和光照强度下微小卡罗藻的培养液做溶血检测,探讨不同环境因子胁迫下微小卡罗藻溶血毒素的分泌情况.结果表明:适宜盐度下该藻分泌少量溶血毒素(2hHs30=2.1%),高盐或低盐胁迫下分泌较多(2hHs50=134.7%,2 hHs20=38.8%).pH<7及pH>9时,分泌的溶血毒素较多(2 hHp5=101.7%,2 hHp10=107.4%);pH在7～9之间,分泌很少(2 hHp7=1.5%).高温胁迫能促进溶血毒素的分泌(2 hHt50=70.7%),适宜温度下不分泌溶血毒素.短时间内(48h),随着光照强度的增加(0～20000lx),该藻的生长不受影响,溶血毒素分泌很少.因此,溶血毒素的分泌与该藻的生长环境密切相关,一旦生长受到抑制,毒素分泌量就会明显增大.