急性髓系白血病患者血浆循环DNA动态监测及其临床意义

本研究旨在动态监测急性髓系白血病(AML)患者血浆循环DNA的含量,探讨其临床意义。采集66例AML患者不同临床状态的静脉血,以60例体检健康者、20例良性血液病患者、20例实体肿瘤患者为对照,用磁珠法提取血浆标本中循环DNA和内参照质粒DNA,双重荧光定量PCR技术进行DNA定量检测。结果表明:AML患者诊断时血浆DNA含量为168.5(73.4-245.1)ng/ml,显著高于各对照组,男性患者血浆DNA含量显著高于女性患者(P=0.019),不同年龄、不同FAB型别的患者间血浆DNA含量无统计学差异。化疗后血浆DNA水平显著低于化疗前,完全缓解、部分缓解组患者血浆DNA水平与健康对照组已无显著差异,但与未缓解组有显著性差异(P<0.05)。缓解后复发的6例患者中有5例(83.3%)复发时血浆DNA水平明显升高,未复发的25例患者中有22例(88.0%)血浆DNA水平保持稳定。结论:血浆DNA定量检测对AML的化疗疗效判断及复发监测具有重要意义。

血浆循环DNA浓度在原发性干燥综合征和系统性红斑狼疮诊治中的意义

目的比较原发干燥综合征(pSS)、系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血浆中循环DNA(cDNA)浓度的差异性,探讨cDNA浓度在pSS、SLE诊治中的意义。方法选用人类基因组管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)设计引物,测定pSS、SLE及健康对照组中血浆cDNA浓度,同时测定血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)并评定不同疾病的活动指数和损害指数,分析血浆cDNA浓度与疾病活动性、相关参数的关系。结果 pSS组cDNA浓度[(368.24±196.68)ng/ml]明显高于SLE组[(244.51±164.10)ng/ml]及健康对照组[(24.56±16.76)ng/ml],差异均有统计学意义(均P<0.05);pSS组中的cDNA浓度值与干燥综合征活动指数(SSDAI)呈正相关(P<0.05),与干燥综合征损害指数(SSDDI)无相关性(P>0.05);SLE组中cDNA浓度值与SLE活动指数(SLEDAI)无相关性(P>0.05)。结论 cDNA浓度可作为pSS与SLE鉴别指标之一,pSS患者cDNA浓度与SSDAI呈正相关,可作为pSS疾病活动性观察指标之一。

血浆循环DNA和CK-MB联合检查用于诊断手足口患儿心肌损伤的价值

目的探讨联合检测血浆循环DNA与心肌酶CK—MB在诊断手足口病（HFMD）患儿心肌损伤的应用。方法选择30例健康儿童和40例HFMD患儿发病后3日内静脉血．用双重荧光定量PCR技术检测血浆DNA水平，同时检测心肌酶CK—MB。结果血浆循环DNA在HFMD并发心肌损伤组的水平为（21．93±8．82）ng／mL，显著高于未并发心肌损伤组的（9．724±5．870）ng／mL（P〈0．05）。血浆CK—MB在重型HFMD患儿组显著升高．在普通比例组和正常对照组无显著差别；血浆循环DNA在普通病例组和重型病例组均较对照组显著升高．而且重型病例组升高程度显著高于普通病例组；HFMD患儿外周血血浆循环DNA与CK—MB呈显著正相关。结论联合检测HFMD患儿心肌酶CK—MB和血浆循环DNA有助于早发现心肌损伤。

荧光定量PCR检测手足口病患者血浆循环DNA及其临床意义

目的利用实时荧光定量PCR技术检测手足口病患者血浆循环DNA水平。方法分别收集健康人和手足口病患者的血浆样本,用实时荧光定量PCR方法检测样本中的血浆循环DNA。结果手足口病患者的血浆循环DNA的CT值为(23.58±1.18),显著低于健康对照组的(35.66±1.32)(P<0.001)。结论实时荧光定量PCR技术检测血浆循环DNA可以作为诊断手足口病的一种方法。

荧光定量PCR检测病毒性心肌炎患者血浆循环DNA及其临床意义

目的:利用实时荧光定量PCR技术来检测病毒性心肌炎患者血浆循环DNA水平。方法:分别收集健康人和病毒性心肌炎患者的血浆样本,用实时荧光定量PCR方法检测样本中的血浆循环DNA。结果:病毒性心肌炎患者的血浆循环DNA的CT值为25.22±1.26,明显低于健康人30.66±1.52,有显著性差异(P<0.01)。结论:实时荧光定量PCR技术检测血浆循环DNA可以成为诊断病毒性心肌炎的一种方法。

荧光定量PCR测定原发性干燥综合征患者血浆循环DNA及其临床意义

目的：荧光定量PCR测定原发性干燥综合征（pSS）患者血浆循环游离DNA（cfDNA），分析其在疾病中的意义。方法选用人类基因组管家基因TaqMan？ GeneExpression Assays：ABI 4331182，ID：Hs02758991-g1，采用PCR水解探针模式（Taqman探针）测定pSS及正常对照组中血浆cfDNA的值，同时测定pSS患者血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM），并评定pSS的活动指数（SSDAI）和损害指数（SSDDI），分析cfDNA与疾病活动之间的关系。结果pSS组cf DNA浓度值为（380.64±259.10）μg/L，正常对照组cfDNA浓度值为（32.02±16.39）μg/L，两者比较差异有统计学意义（P〈0.05）；pSS组中：cfDNA浓度与SSDAI呈正相关（r=0.533， P〈0.01），与SSDDI无相关性（r=0.051，P〉0.05），SSDAI与SSDDI呈正相关（r=0.412，P〈0.01），pSS组以SSDAI值中位数4分为2组，31例pSS （SSDAI≥4）的cfDNA浓度值（509.70±215.57）μg/L，35例pSS（SSDAI〈4）的cfDNA浓度值（262.65±186.35）μg/L，两组比较差异有统计学意义（P〈0.01）。结论血浆cfDNA在pSS患者中升高，与干燥综合征疾病活动性相关，血浆cfDNA可作为PSS疾病活动的观察指标。

血浆循环DNA定量检测在食管鳞癌诊断中的意义

目的：通过对食管鳞癌患者血浆循环DNA定量检测，分析并讨论血浆循环DNA含量检测在食管鳞癌诊断中的价值。方法：用血液微量DNA抽提试剂盒提取血浆循环DNA，并以实时荧光定量PCR（SYBRGreenⅠ）分别检测49例食管鳞癌患者、60例健康对照者血浆循环DNA含量，并应用受试者工作特征（ROC）曲线评价血浆循环DNA水平在食管鳞癌的诊断中的价值。结果：食管鳞癌组患者血浆循环DNA水平（54．41±31．23）ng／mL显著高于健康对照组（19．03±7．24）ng／mL，二者差异有统计学意义（P〈0．001）；以29．43ng／mL为食管鳞癌诊断临界值，敏感性和特异度分别为77．5％和93．3％，ROC曲线下面积为0．918（95％CI 0．870～0．967）。TNMⅢ期患者血浆循环DNA水平（76．52±34．51）ng／mL显著高于Ⅰ～Ⅱ期患者（40．40±18．76）ng／mL（P〈0．05）：淋巴结转移患者血浆循环DNA水平（66．25±35．60）ng／mL显著高于未发生淋巴结转移的患者（41．02±18．31）ng／mL（P〈0．05）。食管鳞癌患者血浆循环DNA水平在年龄、性别、肿瘤部位及分化程度间差异无显著性（P〉0．05）。结论：血浆循环DNA定量检测在食管鳞癌的筛查和早期诊断中具有一定的临床意义，并可能与食管鳞癌的分期相关。

血浆循环肿瘤DNA基因突变检测国家参考品的应用评价

目的评价血浆循环肿瘤DNA(ctDNA)KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突变检测国家参考品。方法对87支国家参考品进行血浆游离DNA提取,文库构建,对文库进行高通量测序,测序后的序列比对到参考基因序列上,通过生物信息软件分析,识别携带基因突变的肿瘤DNA序列,获得相关基因突变信息。结果试剂盒检测范围内的国家阳性参考品均检测出相应突变位点,国家阴性参考品和试剂盒检测范围外的阳性参考品均为野生型,可检测50 ng DNA中突变频率为0.3%~1%的检测限参考品。结论该技术方法的试剂盒检测结果符合国家参考品的要求。本国家参考品为ctDNA检测的标准化提供保障。

肉碱缺乏症性心肌病患儿血浆循环游离线粒体DNA定量分析及其临床意义

目的检测肉碱缺乏症性心肌病患儿血浆循环游离线粒体DNA(ccf-mtDNA)水平并探讨其临床意义。方法前瞻性病例对照研究。收集2017年7月至2022年6月吉林大学第一医院小儿心血管科病房收治的7例以心肌病为主要临床表现的原发性肉碱缺乏症(PCD)患儿(PCD组)、同期就诊的16例扩张型心肌病(DCM)患儿(DCM组)及50例健康体检儿童(健康对照组)血液样本,采用实时荧光定量PCR方法检测各组血浆ccf-mtDNA水平并比较其差异,分析PCD组中血浆ccf-mtDNA水平与血游离肉碱水平、心功能的相关性,并监测PCD组应用左旋肉碱治疗后ccf-mtDNA的水平变化。3组间比较采用Kruskal-Wallis检验,PCD组与健康对照组比较采用Mann-Whitney检验,PCD组内治疗前后比较采用配对Wilcoxon秩和检验,变量间相关分析采用Logistic回归分析。结果PCD组、DCM组患儿血浆ccf-mtDNA水平分别为3.69×10^(6)(1.09×10^(6)~7.26×10^(6))拷贝/L、0.99×10^(6)(0.25×10^(6)~4.10×10^(6))拷贝/L,明显高于健康对照组[0.09×10^(6)(0.01×10^(6)~0.35×10^(6))拷贝/L](H=33.34、24.69,均P<0.001),且PCD组较DCM组更高(H=6.31,P<0.05)。PCD组应用左旋肉碱治疗前:血浆ccf-mtDNA水平与血游离肉碱水平、左心室射血分数呈负相关(r=-0.85、-0.82,均P<0.05),与改良Ross评分、N-末端B型利钠肽原水平呈正相关(r=0.81、0.83,均P<0.05)。PCD组应用左旋肉碱治疗后:血浆ccf-mtDNA水平逐渐下降,血游离肉碱水平、心脏功能逐渐恢复。血浆ccf-mtDNA水平自治疗第3个月[0.96×10^(6)(0.50×10^(6)~2.27×10^(6))拷贝/L]开始,较治疗前明显下降(Z=2.24,P<0.05),在第6、9及12个月分别为0.27×10^(6)(0.18×10^(6)~0.76×10^(6))拷贝/L、0.29×10^(6)(0.19×10^(6)~0.78×10^(6))拷贝/L及0.16×10^(6)(0.10×10^(6)~1.06×10^(6))拷贝/L,与健康对照组[0.09×10^(6)(0.01×10^(6)~0.35×10^(6))拷贝/L]比较差异均无统计学意义(Z=1.23、1.09、2.12,均P>0.05)。结论血浆ccf-mtDNA可能是肉碱缺乏症性心肌病的致病因素之一,其水平对此疾病的心脏病情评估具有一定的临床价值。

临床常见干扰因素对ctDNA EGFR T790M突变检测的影响

目的探讨临床常见干扰因素对血浆循环肿瘤DNA(ctDNA)表皮生长因子受体(EGFR)T790M突变检测的影响。方法收集7例确认T790M为野生型的正常献血者血浆,添加不同浓度T790M突变质粒及单一干扰物(三酰甘油、胆红素或血红蛋白)模拟干扰血浆,提取DNA后,采用超级突变扩增阻滞系统(SuperARMS)进行T790M突变检测,每份样本重复检测3次,记录DNA浓度、DNA纯度、Super-ARMS检测内控Ct值及T790M突变ΔCt值,应用SPSS 22.0软件对检测结果进行统计学分析。结果临界阳性突变样本DNA浓度极易受胆红素(≥85.5μmol/L)及三酰甘油(≥9.25 mmol/L)干扰(P<0.05),但其纯度不易受干扰;强阳性突变样本DNA浓度可受低浓度胆红素(85.5μmol/L)及高浓度血红蛋白(2.0 g/L)干扰(P<0.05),且纯度受三酰甘油(≥9.25 mmol/L)和血红蛋白(0.5~1.5 g/L)干扰(P<0.05)。脂血对Super-ARMS检测T790M突变的影响最显著,临界阳性、强阳性突变样本内控Ct值及T790M突变ΔCt值均可受三酰甘油(≥9.25 mmol/L)干扰(P<0.05);此外,强阳性突变样本内控Ct值受较高浓度胆红素(≥256.5μmol/L)干扰,T790M突变ΔCt值可受中等浓度血红蛋白(≥1.0 g/L)干扰(P<0.05)。结论不同浓度的血红蛋白、三酰甘油和胆红素对SuperARMS检测ct DNA EGFR T790M突变的各项参数可产生不同程度的影响,在临床实际检测中应尽量避免使用含干扰因素的血浆。

应用微滴式数字PCR定量检测结直肠癌患者血浆循环游离DNA

目的建立基于微滴式数字PCR(dd PCR)技术定量检测结直肠癌(CRC)患者血浆循环游离DNA(cfDNA)含量的方法,并初步探讨其临床应用。方法设计β-actin基因dd PCR特异性引物和探针,通过条件优化建立cfDNA定量检测方法;用不同浓度标准品验证所建方法的特异性、灵敏度、线性及重复性;并用该法检测39例CRC患者与40例健康人群血浆标本,比较CRC患者与对照组、术前与术后组血浆cfDNA浓度差异。结果所建方法无非特异性扩增,检测灵敏度为0.29 copies/μl,在模板浓度为10 pg/μl^10 ng/μl内线性良好(y=-2.34+33.17x,r^2=0.999),批内CV为9.85%,批间CV为11.04%;CRC患者血浆cfDNA结果 (7.20±5.15)copies/μl明显高于对照组(3.38±1.97)copies/μl(P<0.01);术后组血浆cfDNA浓度为(3.90±3.39)copies/μl,较术前组明显下降(P<0.01)。结论建立的dd PCR定量检测血浆cfDNA方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可为CRC患者的临床决策和病程监控提供一种无创手段。

血浆循环游离DNA(cf DNA)联合癌胚抗原(CEA)在评估晚期非小细胞肺癌治疗疗效的临床价值

目的:研究血浆循环游离DNA(cf DNA)联合癌胚抗原(CEA)在评估晚期非小细胞肺癌(NSCLC)治疗疗效中的临床价值。方法:选取我院2019年1月~2022年1月收治的96例晚期NSCLC患者作为研究对象,所有患者均接受含铂双药化疗方案或放疗,评估治疗6个月后的临床疗效,根据疗效分为有效组与无效组,检测所有患者cf DNA及CEA水平并进行比较,单因素、多因素分析患者疗效的影响因素,并通过受试者工作特征曲线图(ROC)分析cf DNA及CEA对晚期NSCLC患者治疗疗效的评估价值。结果:本研究中96例患者均顺利完成化疗治疗,疗程结束后,有54例(56.25%)治疗有效,42例(43.75%)治疗无效;无效组肿瘤TNM分期Ⅳ期、体力状况(PS)评分2~4分占比大于有效组(P<0.05);无效组患者cf DNA及CEA水平明显高于有效组(P<0.05);多因素Logistic回归分析显示,肿瘤分期Ⅳ期、PS评分2~4分、cf DNA及CEA高水平均为影响晚期NSCLC患者疗效的相关因素(P<0.05);ROC曲线分析显示,cf DNA、CEA对晚期NSCLC患者治疗后无效均有预测效能(P<0.05),其中两指标联合预测的曲线下面积(AUC)最大,为0.794,特异度、敏感度分别为85.19%、78.57%。结论:治疗无效晚期非小细胞肺癌患者cf DNA及CEA水平更高,肿瘤分期Ⅳ期、PS评分2~4分、cf DNA及CEA高水平均为晚期NSCLC患者疗效的影响因素,联合cf DNA及CEA检测有利于对晚期NSCLC患者治疗疗效进行评估。

血浆循环肿瘤DNA SEPT9基因甲基化对结直肠癌诊断及预后预测价值分析

目的研究分析血浆循环肿瘤DNA SEPT9基因甲基化(methylated SEPT9,mSEPT9)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)诊断及预后预测价值。方法选择作者医院2015-05/2018-05月收治的98例CRC患者作为研究对象(CRC组),再选择同时间段非CRC患者80例作为对照(非CRC组)。CRC组98例,其中早癌组56例、进展期癌组42例;非CRC组80例,其中腺瘤组35例,健康对照组45例。非CRC组均于体检或检查当日抽取外周静脉血10 ml,符合研究标准的CRC组患者则于术前抽取10 ml外周静脉血,检测血浆mSEPT9含量,对比各组阳性表达情况,并对其诊断价值进行分析;再使用单因素或多因素对血浆mSEPT9阳性率与CRC患者临床特征间关系进行分析;最后分析血浆mSEPT9不同表达对CRC患者3年生存率影响。结果早癌组、进展期癌组、腺瘤组、健康对照组血浆mSEPT9表达阳性率差异有统计学意义(P<0.05);进一步进行两两比较:早癌组、进展期癌组血浆mSEPT9表达阳性率明显高于健康对照组(P<0.05),腺瘤组、健康对照组血浆mSEPT9表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。血浆mSEPT9单指标对CRC患者诊断敏感性为75.51%(74/98)、特异性为86.67%(52/60)、准确率为79.75%(126/158),阳性预测值90.24%(74/82)、阴性预测值68.42%(52/76),其Kappa值为0.59(0.40<Kappa<0.74),说明血浆mSEPT9单指标诊断CRC与金标准符合程度一般。单因素和多因素分析结果均显示:CRC患者进展期癌、存在淋巴结转移或远处转移者血浆mSEPT9阳性率较高(P<0.05)。98例CRC患者3年总生存率为75.51%(74/98),其中为血浆mSEPT9阳性患者生存率为70.27%(52/74),血浆mSEPT9阴性患者生存率为91.67%(22/24),经Log-rank检验差异有统计学意义(P<0.05)。结论CRC患者血浆SEPT9阳性率相对较高,该指标与金标准诊断符合程度一般,而CRC患者中进展期癌和出现淋巴结转移或远处转移者SEPT9阳性率相对较高,且SEPT9阳性率高者预后较差。

血浆NGS-ctDNA对EGFR-TKIs治疗晚期NSCLC患者的预后意义

目的分析血浆循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)⁃酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)治疗晚期非小细胞肺癌(non⁃small cell lung cancer,NSCLC)患者的预后意义。方法选取2019年2月至2022年12月我院收治的EGFR⁃TKI治疗前进行基线ctDNA和早期动态血浆ctDNA测试的患者81例。使用基于二代测序(next⁃generation sequencing,NGS)的平台对患者进行血浆ctDNA突变检测,记录基线血浆ctDNA最大突变等位基因频率(mutated allele frequency,MAF),监测治疗第1周期81例和第2周期21例血浆ctDNA状态。主要结局为总生存期(overall survival,OS)和无进展生存期(progression⁃free survival,PFS)。次要结局为TKIs靶向治疗治疗2个周期后的疾病控制率(disase control rate,DCR)。结果81例患者的基线ctDNA评估中,EGFR⁃TKI敏感突变和其他频繁突变的驱动基因,其中38例存在双重或三重突变,最常见的EGFR+TP53突变19例(50.00%)。治疗后第1周期,ctDNA早期清除率为58.02%。21例第2周期进行重复测试的患者,早期ctDNA清除的患者可能具有持续性(76.47%vs.0%,P=0.005)。基线血浆ctDNA突变基因个数与EGFR⁃TKIs治疗后DCR有关,DCR组血浆ctDNA突变≥2个的例数35.94%低于疾病进展88.24%(P<0.05)。单因素和多因素COX回归分析显示,血浆ctDNA突变≥2个是影响NSCLC患者PFS(HR=2.900;95%CI:1.583~5.312;P=0.001)和OS(HR=2.063;95%CI:1.183~3.600;P=0.011)预后的危险因素。与血浆ctDNA突变<2个的患者相比,血浆ctDNA突变≥2个的患者累积PFS率和中位PFS明显变小(χ^(2)=13.730,P<0.001);累积OS率和中位OS明显变小(χ^(2)=7.791,P=0.005)。结论血浆NGS⁃ctDNA突变≥2个与晚期NSCLC患者EGFR⁃TKIs治疗无效和预后不良高风险有关。