母体血浆游离DNA分子浓度和片段完整性分析

目的应用荧光定量PCR技术研究母体血浆游离DNA分子的浓度和片段的完整性的分子生物学特性。方法提取本院2011年8月42例门诊16～20周妊娠女性和40例进行体检的非妊娠女性的血浆游离DNA,靶基因为lep-tin基因和SRY基因,用荧光定量PCR技术分别对其不同片段进行特异性扩增。leptin基因的扩增片段长度为80、202 bp,SRY基因为83、206 bp,观察其片段完整性和DNA浓度的变化。结果妊娠组和对照组leptin基因80 bp片段长度的DNA浓度平均值分别为681、439拷贝/ml(P<0.01);在片段长度为202 bp的DNA浓度平均值分别为157、91拷贝/ml,中位数为134、85拷贝/ml,表明均有显著性差异(P<0.01)。妊娠组胎儿SRY基因83 bp和206 bp的DNA浓度的平均值为94(38～369)拷贝/ml、80(71～88)拷贝/ml,与妊娠组leptin基因比较,有显著性差异。结论妊娠女性血浆DNA分子浓度明显高于非妊娠正常女性和胎儿游离DNA分子浓度。

非小细胞肺癌患者血浆游离DNA含量和完整性检测的临床意义

目的评估血浆游离DNA含量和完整性(DNA integrity)在非小细胞肺癌(NSCLC)诊疗中的应用价值。方法收集102例NSCLC患者、30例肺良性疾病患者及30例体检健康者的外周血标本,并对其中44例NSCLC手术患者进行随访。提取血浆游离DNA,用SYBR Green染料实时荧光定量PCR检测血浆游离DNA中长度分别为100 bp及241 bp的人端粒酶逆转录酶(h TERT)目的基因的含量,计算血浆游离DNA完整性,并分析其与临床病理参数的关系。结果 100 bp、241 bp血浆游离DNA含量及DNA完整性在NSCLC、肺良性疾病组及健康对照组中差异有统计学意义(H分别为21.947、52.825、27.110,P均<0.01),NSCLC患者手术前后100 bp、241 bp血浆游离DNA含量和术前游离DNA完整性差异有统计学意义(H分别为3.259,5.149,2.609,P均<0.01)。血浆游离DNA完整性与NSCLC患者的年龄、性别、吸烟状况、临床分期、病理类型、肿瘤细胞分化程度、有无转移及肿瘤大小均无明显相关性。结论血浆游离DNA含量和完整性检测在NSCLC诊疗中有一定的临床价值,可成为NSCLC早期诊断及预后监测的指标。

血浆循环游离DNA水平及其完整性用于肺结节良恶性的诊断研究

目的 探讨血浆循环游离DNA(cfDNA)水平及其完整性对肺结节良恶性的诊断价值。方法 选取110例肺结节患者作为研究对象,根据病理诊断结果分为良性肺结节组60例与恶性肺结节组50例,另选取同期健康体检者30例设为对照组。采用酶联免疫吸附试验检测血浆癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血浆cfDNA水平和cfDNA完整性;绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析并比较血浆cfDNA水平、cfDNA完整性、CEA、Cyfra21-1单独和联合应用对恶性肺结节的诊断效能。结果 恶性肺结节组血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平依次为1 154.83(452.85,1 642.31)、7.93(3.21,10.31)、5.75(2.85,8.12) ng/mL,分别高于良性肺结节组的385.43(176.45,704.55)、2.67(1.36,5.45)、2.74(1.43,3.96) ng/mL,差异有统计学意义(P<0.001);恶性肺结节组患者cfDNA完整性为0.68(0.47,0.91),高于良性肺结节组的0.37(0.26,0.59),差异有统计学意义(P<0.001)。血浆cfDNA水平和cfDNA完整性与恶性肺结节患者性别、年龄、是否吸烟、肿瘤直径、病理类型、TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移均无相关性(P>0.05)。ROC曲线显示,血浆cfDNA水平、cfDNA完整性诊断恶性肺结节的曲线下面积、敏感度、特异度均大于或高于CEA、Cyfra21-1;血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性联合诊断恶性肺结节的敏感度、特异度均高于四者单独检测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 血浆cfDNA水平和cfDNA完整性对恶性肺结节具有一定的诊断价值,可作为肺结节良恶性辅助诊断的分子生物学指标。

晚期胃肠道肿瘤患者血浆游离DNA片段的检测、定量

目的探讨肿瘤患者循环血液中DNA改变，及对提高肿瘤患者治愈率和生存率的临床实际意义。方法随机采集了2004年10月-12月大连医科大学附属二院经病理确诊的初治晚期胃、大肠癌患者的血标本18份，门诊健康体检者血标本16份，通过酚／氯仿提取法定量检测两组的血浆DNA片段，进行对照比较，分析健康人与晚期胃肠道肿瘤患者血浆游离DNA片段水平的差异、晚期胃肠道肿瘤患者血浆游离DNA片段水平与预后相关指标的相关性。结果晚期胃肠道肿瘤组血浆游离DNA片段水平高于正常健康对照组，其血浆游离DNA片段的均值分别为（346．3±81．62）μg/ml与（27．6±6．91）μg／ml．差异有显著性；胃癌、大肠癌患者两组间的血浆游离DNA片段差异无显著性，均值分别为：（350．8±110．92）μg／ml与（357．1±126．26）μg/ml；在预后相关指标的各因素中，晚期胃肠道肿瘤患者的血浆游离DNA片段水平与免疫状态、是否存在远处转移有明显相关性，其中与免疫状态呈负相关，与远处转移呈正相关。结论晚期胃肠道肿瘤患者血中的游离DNA片段水平较健康人高，可能与患者自身状态、病理分型、疾病状态有关；游离DNA片段可以作为检测晚期胃肠道肿瘤的特异性指标，还可以替代免疫状态及是否存在远处转移等指标评价远期预后，并有取材方便、检测时间短、可以定量分析的优点，对临床有一定的指导意义和应用价值。

基于血浆游离DNA片段组学特征的肝细胞癌预后分析

目的 探讨血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)片段组学特征在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)预后分析中的应用价值。方法 选取2016年6月至2016年9月空军军医大学第一附属医院肝胆外科收治的50例HCC患者为研究对象。采集HCC患者术前静脉血进行cfDNA提取、文库构建与测序,分析HCC患者cfDNA片段组学特征,包括片段大小分布和末端碱基基序。采用患者临床资料结合cfDNA片段组学数据进行Cox回归分析,筛选影响HCC患者预后的独立危险因素并构建列线图模型以预测HCC患者的总生存率。结果 cfDNA片段大小主要集中在150~200 bp,峰值位于167 bp处;且在100~200 bp之间出现间隔约10 bp的连续峰值波。比较总片段范围内的末端碱基基序显示,除A-end与G-end、T-end与C-end的平均占比差异无统计学意义(均P>0.05)外,其余比较差异均有统计学意义(均P<0.001),每个末端碱基基序在短片段和长片段中的平均占比比较,差异亦有统计学意义(均P<0.001)。肿瘤的分化程度、BCLC分期、片段大小得分是影响HCC患者预后的独立危险因素(均P<0.05)。基于上述3个因素构建列线图模型,其预测HCC患者1年和3年总生存率的受试者工作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线下面积分别为0.836和0.840。结论 cfDNA片段组学特征联合临床指标在HCC预后评估中具有较大的潜力。

血浆游离DNA含量及完整性对胰腺癌的诊断价值研究

目的研究血浆游离DNA含量与完整性指数对胰腺癌的诊断价值。方法收集正常人群及胰腺癌患者血液标本,提取基因组DNA,建立游离DNA定量标准曲线;提取血浆游离DNA,用SYBR Green荧光定量PCR法对其进行含量及完整性指数检测,分析2组之间的差异,用ROC曲线判断分析其对胰腺癌的诊断能力。结果胰腺癌组游离DNA浓度及完整性指数均高于对照组,2组血浆游离DNA含量及完整性差异有统计学差异(Z=-2.92,Z=-6.07,P<0.05)。游离DNA浓度及完整性指数对胰腺癌诊断ROC曲线下面积分别为0.669(95%CI:0.563~0.776)、0.806(95%CI:0.723~0.888)。结论血浆游离DNA浓度及完整性指数均对胰腺癌具有一定的诊断价值,完整性指数的诊断能力虽优于游离DNA浓度,但诊断效果并不理想,尚需深入研究更为有效的胰腺癌的诊断方法。

血浆游离DNA全基因组甲基化测序的实用稳定性评估

随着液体活检技术的发展,血浆游离DNA成为当前的研究热点之一。血浆游离DNA的全基因组甲基化测序被认为在癌症检测等医学应用拥有巨大潜力,但目前尚缺乏针对该实验流程的实用稳定性评估。文中利用两名志愿者在不同时间采样的血浆游离DNA,在不同实验平台分别进行DNA甲基化的重亚硫酸盐转化前建库(Pre-BS)、转化后建库(Post-BS)和常规DNA建库,获取多因素影响下的测序数据样本。在此基础上,建立了一套血浆游离DNA测序数据分析的质量控制参考流程,综合评估了血液采集提取、游离DNA建库测序过程的实用稳定性,为血浆游离DNA全基因组甲基化测序应用于临床液体活检提供实用性的基础参考。