血浆循环肿瘤DNA基因突变检测国家参考品的应用评价

目的评价血浆循环肿瘤DNA(ctDNA)KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突变检测国家参考品。方法对87支国家参考品进行血浆游离DNA提取,文库构建,对文库进行高通量测序,测序后的序列比对到参考基因序列上,通过生物信息软件分析,识别携带基因突变的肿瘤DNA序列,获得相关基因突变信息。结果试剂盒检测范围内的国家阳性参考品均检测出相应突变位点,国家阴性参考品和试剂盒检测范围外的阳性参考品均为野生型,可检测50 ng DNA中突变频率为0.3%~1%的检测限参考品。结论该技术方法的试剂盒检测结果符合国家参考品的要求。本国家参考品为ctDNA检测的标准化提供保障。

循环肿瘤细胞临床应用的新进展

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)是指释放到血液中的罕见肿瘤细胞,被认为是肿瘤血液转移的关键步骤之一。循环肿瘤细胞的检测对于肿瘤的诊断、治疗和预后判定都具有非常重要的意义,是目前肿瘤研究的热点之一。本文将从预测生物标志物、治疗反应、预后、血浆肿瘤DNA四个方面介绍循环肿瘤细胞临床应用的最新研究进展。

血浆NGS-ctDNA对EGFR-TKIs治疗晚期NSCLC患者的预后意义

目的分析血浆循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)⁃酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)治疗晚期非小细胞肺癌(non⁃small cell lung cancer,NSCLC)患者的预后意义。方法选取2019年2月至2022年12月我院收治的EGFR⁃TKI治疗前进行基线ctDNA和早期动态血浆ctDNA测试的患者81例。使用基于二代测序(next⁃generation sequencing,NGS)的平台对患者进行血浆ctDNA突变检测,记录基线血浆ctDNA最大突变等位基因频率(mutated allele frequency,MAF),监测治疗第1周期81例和第2周期21例血浆ctDNA状态。主要结局为总生存期(overall survival,OS)和无进展生存期(progression⁃free survival,PFS)。次要结局为TKIs靶向治疗治疗2个周期后的疾病控制率(disase control rate,DCR)。结果81例患者的基线ctDNA评估中,EGFR⁃TKI敏感突变和其他频繁突变的驱动基因,其中38例存在双重或三重突变,最常见的EGFR+TP53突变19例(50.00%)。治疗后第1周期,ctDNA早期清除率为58.02%。21例第2周期进行重复测试的患者,早期ctDNA清除的患者可能具有持续性(76.47%vs.0%,P=0.005)。基线血浆ctDNA突变基因个数与EGFR⁃TKIs治疗后DCR有关,DCR组血浆ctDNA突变≥2个的例数35.94%低于疾病进展88.24%(P<0.05)。单因素和多因素COX回归分析显示,血浆ctDNA突变≥2个是影响NSCLC患者PFS(HR=2.900;95%CI:1.583~5.312;P=0.001)和OS(HR=2.063;95%CI:1.183~3.600;P=0.011)预后的危险因素。与血浆ctDNA突变<2个的患者相比,血浆ctDNA突变≥2个的患者累积PFS率和中位PFS明显变小(χ^(2)=13.730,P<0.001);累积OS率和中位OS明显变小(χ^(2)=7.791,P=0.005)。结论血浆NGS⁃ctDNA突变≥2个与晚期NSCLC患者EGFR⁃TKIs治疗无效和预后不良高风险有关。

临床常见干扰因素对ctDNA EGFR T790M突变检测的影响

目的探讨临床常见干扰因素对血浆循环肿瘤DNA(ctDNA)表皮生长因子受体(EGFR)T790M突变检测的影响。方法收集7例确认T790M为野生型的正常献血者血浆,添加不同浓度T790M突变质粒及单一干扰物(三酰甘油、胆红素或血红蛋白)模拟干扰血浆,提取DNA后,采用超级突变扩增阻滞系统(SuperARMS)进行T790M突变检测,每份样本重复检测3次,记录DNA浓度、DNA纯度、Super-ARMS检测内控Ct值及T790M突变ΔCt值,应用SPSS 22.0软件对检测结果进行统计学分析。结果临界阳性突变样本DNA浓度极易受胆红素(≥85.5μmol/L)及三酰甘油(≥9.25 mmol/L)干扰(P<0.05),但其纯度不易受干扰;强阳性突变样本DNA浓度可受低浓度胆红素(85.5μmol/L)及高浓度血红蛋白(2.0 g/L)干扰(P<0.05),且纯度受三酰甘油(≥9.25 mmol/L)和血红蛋白(0.5~1.5 g/L)干扰(P<0.05)。脂血对Super-ARMS检测T790M突变的影响最显著,临界阳性、强阳性突变样本内控Ct值及T790M突变ΔCt值均可受三酰甘油(≥9.25 mmol/L)干扰(P<0.05);此外,强阳性突变样本内控Ct值受较高浓度胆红素(≥256.5μmol/L)干扰,T790M突变ΔCt值可受中等浓度血红蛋白(≥1.0 g/L)干扰(P<0.05)。结论不同浓度的血红蛋白、三酰甘油和胆红素对SuperARMS检测ct DNA EGFR T790M突变的各项参数可产生不同程度的影响,在临床实际检测中应尽量避免使用含干扰因素的血浆。

血浆循环肿瘤DNA SEPT9基因甲基化对结直肠癌诊断及预后预测价值分析

目的研究分析血浆循环肿瘤DNA SEPT9基因甲基化(methylated SEPT9,mSEPT9)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)诊断及预后预测价值。方法选择作者医院2015-05/2018-05月收治的98例CRC患者作为研究对象(CRC组),再选择同时间段非CRC患者80例作为对照(非CRC组)。CRC组98例,其中早癌组56例、进展期癌组42例;非CRC组80例,其中腺瘤组35例,健康对照组45例。非CRC组均于体检或检查当日抽取外周静脉血10 ml,符合研究标准的CRC组患者则于术前抽取10 ml外周静脉血,检测血浆mSEPT9含量,对比各组阳性表达情况,并对其诊断价值进行分析;再使用单因素或多因素对血浆mSEPT9阳性率与CRC患者临床特征间关系进行分析;最后分析血浆mSEPT9不同表达对CRC患者3年生存率影响。结果早癌组、进展期癌组、腺瘤组、健康对照组血浆mSEPT9表达阳性率差异有统计学意义(P<0.05);进一步进行两两比较:早癌组、进展期癌组血浆mSEPT9表达阳性率明显高于健康对照组(P<0.05),腺瘤组、健康对照组血浆mSEPT9表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。血浆mSEPT9单指标对CRC患者诊断敏感性为75.51%(74/98)、特异性为86.67%(52/60)、准确率为79.75%(126/158),阳性预测值90.24%(74/82)、阴性预测值68.42%(52/76),其Kappa值为0.59(0.40<Kappa<0.74),说明血浆mSEPT9单指标诊断CRC与金标准符合程度一般。单因素和多因素分析结果均显示:CRC患者进展期癌、存在淋巴结转移或远处转移者血浆mSEPT9阳性率较高(P<0.05)。98例CRC患者3年总生存率为75.51%(74/98),其中为血浆mSEPT9阳性患者生存率为70.27%(52/74),血浆mSEPT9阴性患者生存率为91.67%(22/24),经Log-rank检验差异有统计学意义(P<0.05)。结论CRC患者血浆SEPT9阳性率相对较高,该指标与金标准诊断符合程度一般,而CRC患者中进展期癌和出现淋巴结转移或远处转移者SEPT9阳性率相对较高,且SEPT9阳性率高者预后较差。