血浆miRNAs在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)不同疾病状态中的表达特点

目的分析3种血浆miRNA在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)不同疾病状态中的表达特点。方法选取急性淋巴细胞白血病患儿40例,其中初诊患儿12例,完全缓解患儿16例,复发患儿12例,同时收集我院经健康体检的儿童25例作为正常对照组。抽取所有儿童的空腹静脉血,离心后取血浆,采取直接扩增目的 microRNA,并反转录为c DNA,qRT-PCR方法检测血浆miR150、miR155、miR233的表达。结果 ALL组中血浆miR150、miR155、miR233的表达均与正常组有统计学差异;血浆miR150和miR233在初诊组和复发组的表达显著低于缓解组和正常组(P<0.05),血浆miR155在初诊组和复发组的表达显著高于缓解组和正常组(P<0.05)。3种miRNA在初诊组与复发组之间、缓解组与正常组之间比较均无统计学差异(P>0.05);初诊组中3种血浆miRNA在不同年龄和性别之间表达均无统计学差异(P>0.05);3种血浆miRNA的AUC(曲线下面积)和95%CI(95%可信区间)均有较好的满意度,且3种血浆miRNA联合检测的精确度更高。结论血浆miR150、miR155、miR233的表达在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的诊断、治疗和复发监测中有较高的应用价值。

血浆miRNAs在急性病理期缺血性脑卒中的表达谱分析

目的探讨缺血性卒中在病理分期的急性期(24 h内)外周血浆中miRNA的表达及临床意义。方法选取急性脑梗死患者和健康对照者各5例。收集急性脑梗死患者发病24 h之内的血浆和健康对照者的清晨空腹血浆。采用TaqManMicroRNA Arrays进行miRNAs表达谱筛选。使用相关统计学软件及统计方法进行数据分析。结果与健康对照组相比,在缺血性脑卒中发病24 h内外周血浆中存在差异表达的miRNA。本研究共检测有统计意义的显著差异表达的miRNA66个,其中表达上调的39个,下调的27个。上下调倍数变化最显著的miR4498上调7.84倍(foldchange=7.84),miR6 7 6-5P下调为0.1 6 7(foldchange=0.167),P均<0.05。结论急性缺血性脑卒中发病24 h内外周血浆中即存在差异表达的miRNA,这些差异表达miRNA可能与缺血性卒中早期的缺血缺氧应激,血脑屏障破坏,早期再灌注损伤等有关,也有可能作为缺血性卒中早期干预新的治疗方向和靶点。

对肥胖小鼠血浆外泌体miRNA表达谱的分析及联合超声生物显微镜评价肥胖小鼠左室心肌收缩功能障碍的效果

目的:采用超声显微镜心肌应变技术检测肥胖小鼠左心室收缩功能的亚临床改变,应用芯片测序等方法观察肥胖小鼠与正常小鼠心脏miRNA表达的差异,探讨差异表达miRNA在肥胖心肌受损发生发展过程中的作用。方法:选择20只6周大的雄性C57BL/6小鼠(体重20~30 g),喂食高脂肪饮食。选择10只体重和Lee指数大于对照组平均值±1.5倍标准差的肥胖小鼠模型作为肥胖组,将其余10只与肥胖组年龄和性别相同的C57BL/6小鼠作为对照组。采用超声生物显微镜检测常规二维超声参数,应用斑点追踪技术分析小鼠的左室心肌应变。利用芯片检测肥胖小鼠和正常小鼠血浆中外泌体miRNA的表达谱,筛选出在肥胖小鼠中呈差异表达的miRNA。对差异表达的miRNA进行GO分析和KEGG信号通路分析。结果:(1)二维超声参数比较:对照组与肥胖组的左室收缩末期内径、左室射血分数相比,差异无统计学意义(P>0.05);肥胖组的左室间隔厚度、左室后壁厚度、左室舒张末期内径均大于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)超声生物显微镜二维斑点追踪技术测量结果显示,对照组和肥胖组的长轴应变、径向应变、圆周应变参数相比,差异具有统计学意义(P<0.05);肥胖组的长轴应变、径向应变参数均低于对照组,肥胖组的圆周应变参数高于对照组。(3)NLRP3抗体免疫荧光染色显示,肥胖组NLRP3的表达明显增多。(4)对两组血浆外泌体源miRNA的表达进行测序发现,两组样本间共检测到455个差异表达的miRNA,肥胖小鼠与正常小鼠相比有124个下调,331个上调。GO和KEGG分析检测出差异表达的miRNA与肥胖心肌收缩功能的生物学调节功能和通路相关。结论:肥胖小鼠在肥胖发生早期就已出现左心室收缩功能的受损,肥胖小鼠与对照组相比其外泌体源miRNA存在明显的差异,这些差异表达的外泌体miRNA在肥胖心肌收缩功能损伤的发生发展过程中发挥着重要的作用。

系统性硬化症患者血浆7种miRNA水平与脏器累及和临床指标的相关性

目的检测系统性硬化症患者血浆microRNA(miRNA)的相对表达量,分析其与患者临床指标的相关性。方法选取49例系统性硬化症患者和同期体检健康者20例,采集静脉血,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血浆中7种miRNA(miR-140-5p、miR-21、miR-142-3p、miR-29a、miR-92a、miR-151-5p、let-7g)的水平,并根据是否合并高血压、肺动脉高压、间质性肺病、胃肠道累及、雷诺现象、肾脏累及进行分层分析,统计miRNA表达水平与淋巴细胞计数、白细胞计数、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、总蛋白、补体C3、补体C4、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白M(IgM)的相关性。结果系统性硬化症患者血浆miR-21、miR-142-3p、miR-29a、miR-92a、miR-151-5p、let-7g的水平较健康人对照明显下降(t=2.81、4.78、3.07、6.07、4.90、6.64,P均<0.05)。合并肺动脉高压的患者miRNA-21和miRNA-142-3p水平较无肺动脉高压患者明显升高(t=2.27、2.03,P均<0.05),miRNA-140-5p与患者IgG正相关(r=0.32,P=0.02),miRNA-21与患者IgA(r=0.32,P=0.03)、IgG(r=0.33,P=0.02)正相关,miR-92a与患者淋巴细胞计数(r=-0.34,P=0.02)、白细胞计数(r=-0.31,P=0.03)、补体C3(r=-0.30,P=0.04)负相关,miR-151-5p与患者IgG正相关(r=0.32,P=0.03),let-7g与患者IgG(r=0.32,P=0.03)、IgE(r=0.30,P=0.04)正相关。结论系统性硬化症患者血浆miRNA存在明显异常,与患者脏器累及、淋巴细胞计数、白细胞计数、补体C3、IgA、IgG、IgE相关,可能为系统性硬化症生物学标志物之一。

血浆miRNA-486-5p作为口腔鳞癌复发标志物的临床研究

目的:筛选并验证血浆miRNA-486-5p作为口腔鳞癌复发标志物的潜力。方法:按照纳入、排除标准选择28名口腔鳞癌患者和21名健康对照者。实验组分别于术前1周内以及术后1年采集血浆两次,健康对照组采集血浆一次。将其中8例鳞癌样本和3例对照组样本构建cDNA文库后进行高通量测序,筛选目标miRNA,利用其余血浆样本对目标miRNA进行验证。结果:鳞癌患者血浆中表达量最高的miRNAs为miRNA-486-5p,占mi RNAs总表达量的39.6%,且存在差异性表达。术后无复发组及正常对照组血浆miRNA-486-5p均较术前组表达升高(P<0.01,P<0.05),而术后复发组与术前组无显著差异(P>0.05)。结论:血浆miRNA-486-5p的表达水平与口腔鳞癌的复发相关,有潜力作为监测肿瘤术后复发的候选标志物。

血浆miRNA在儿童急性淋巴细胞白血病中表达特点

目的研究血浆miRNAs(hsa-let-7d-5p、hsa-miR-27a-3 p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-652-3p)在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)不同疾病状态的表达特点。方法选取北京儿童医院2009年1月-2013年12月住院的ALL患儿血浆标本70例次,包括初诊-缓解配对30对,复发10例;对照组为2013年8月在北京儿童医院进行健康体检的志愿者30例。采用不提取RNA而直接RT-PCR方法检测患儿血浆中5种miRR NAs的表达情况,分析其表达与儿童ALL的诊断、治疗以及与TEL/AML1融合基因之间的关系。结果 5种miRNAs表达水平均呈现初诊组表达水平低于正常组,缓解后表达水平升高,而复发后表达水平再次明显降低的特点,各组间比较差异有显著性(P<0.05);5种miRNAs对儿童ALL的诊断效能提示:ROC曲线下面积(AUC)均≥0.844,其中以hsa-let-7d-5p表达最高,AUC=0.956;在初诊组和缓解组,5种miRNAs的表达情况在有无TEL/AML1融合基因患儿血浆间差异无显著性(P>0.05)。结论血浆中hsa-let-7d-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-652-3p在儿童ALL的发病过程中可能起到抑癌基因的作用,这为血浆miRNA用于儿童ALL的诊断、治疗及预后监测的分子标记物提供了一定的依据。

基于qPCR的循环miRNA定量检测的方法探讨

目的探讨和优化循环miRNA检测方法,为进一步研究循环miRNA作为生物标记物提供方法学基础。方法以miR-16和miR-21为检测目标,通过实时PCR的方法检测其表达量。比较传统Trizol法和miRNA提取试剂盒的miRNA提取效率;比较血清和血浆中miRNA含量;并对基于实时定量PCR(qPCR)的循环miRNA检测方法重复性和敏感性进行评价。结果 miRNA提取试剂盒的miRNA提取效率是传统Trizol法的16 435倍;血浆中miR-16和miR-21qPCR检测的Ct值为25.75±1.83、25.69±2.04,而血清miRNA检测Ct值为27.82±1.03、27.12±1.35,两者相比有显著差异;同一批血浆miR-16两次检测相关系数为0.8885,单个血浆样本10倍梯度稀释后Ct值拟合系数0.9865。结论 Trizol法提取循环miRNA效率低,血浆中miRNA含量较血清稍高,建议选取血浆为标本,通过miRNA提取试剂盒提取miRNA,然后行实时PCR检测其表达,该法具有较高的重复性和敏感性。

血浆外泌体miR-423-5p在前列腺癌骨转移患者中的差异表达分析

目的:研究血浆外泌体来源microRNA(miRNA),作为前列腺癌骨转移的潜在标志物。方法:选取3例初诊为前列腺癌骨转移患者和3例局限性前列腺癌患者,收集患者外周静脉血10 mL,使用超速离心法及透射电子显微镜对血浆外泌体提取和鉴定。应用高通量测序分析血浆外泌体miRNA的差异表达谱。通过基因数据库GEO和已发表文章对差异miRNA筛选,选取测序结果中差异表达miRNAs,对7例局限性前列腺癌患者和10例前列腺癌骨转移患者的血浆外泌体进行qRT-PCR验证,同时结合GEO数据库样本进行验证。结果:高通量测序结果显示,从患者外周血浆外泌体中平均检测到740种miRNAs,通过R软件计算差异miRNA,得出61种差异miRNA;与对照组相比,hsa-miR-885-5p、hsa-miR-1255a、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-1224-5p等在骨转移组中差异表达,通过靶基因功能及数据库表达选取miRNA进行PCR验证,发现hsa-miR-423-5p表达差异具有统计学意义(P=0.033)。通过数据库对60例局限性前列腺癌患者和40例骨转移患者统计发现,hsa-miR-423-5p在前列腺癌骨转移中显著下调(P=0.001<0.05)。结论:血浆外泌体来源miR-423-5p在前列腺癌骨转移中显著下调,有望成为前列腺癌骨转移患者中新的标志物。

新型血浆外参照设计及核酸检测分析的研究

目的设计新型血浆外参照(plasma external reference,PLACON),用于人类血浆mRNA、miRNA的检测分析。方法从低级别物种秀丽隐杆线虫基因组中选取一段保守序列,利用BLAST检索PLACON序列的特异性,设计成为新型血浆外参照。以恶性肿瘤患者血浆样品及癌细胞株上清液,利用实时荧光定量PCR法,在血浆或细胞上清液中分别以PLACON、β-actin、GAPDH、U6为参照,检测血浆mRNA、miRNA和细胞上清液mRNA并进行对比分析。结果 BLAST检索出PLACON序列具有较好的特异性,与人类基因组无交叉性。熔解曲线均显示RT-qPCR反应特异性较高,PLACON在血浆中mRNA水平扩增的循环阈值(cycle threshold,CT)均显著低于GAPDH、β-actin(P<0.01),在血浆中miRNA水平扩增的CT值显著低于U6(P<0.01)。PLACON在癌细胞上清中进行mRNA扩增实验的验证,得到相似的结果。结论 PLACON序列特异性好,在血浆中比内参照更有优势,稳定性更高,扩增效率更高,可用于血浆mRNA、miRNA的定量检测。

血浆miR-205在乙肝病毒相关肝脏疾病中的表达及其作为乙肝病毒所致肝细胞癌诊断标志物的价值

目的:探讨microRNA-205(miR-205)在乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)相关肝脏疾病患者血浆中的表达水平及其作为乙肝病毒所致肝细胞癌早期诊断标志物的潜在价值。方法:选取56例健康人群、63例慢性乙肝患者(CHB)、59例乙肝肝硬化患者(HBV-LC)及64例乙肝肝细胞癌患者(HBV-HCC),采用实时荧光定量PCR技术验证miR-205在4组人群血浆中的表达差异水平及其诊断效能。结果:miR-205在HBV-HCC患者血浆中的表达水平明显低于健康人群及HBV-LC组,P值均小于0.001,而与CHB组相比则无显著统计学差异(P=0.921)。受试者工作特征(ROC)曲线分析显示血浆miR-205对鉴别诊断HBV-HCC与健康人群、HBV-LC具有重要的意义,曲线下面积(AUC)分别为0.885(敏感性:96.9%,特异性:67.9%)和0.781(敏感性:96.9%,特异性:54.2%)。并且,血浆miR-205联合甲胎蛋白(AFP)在HBV-HCC与HBV-LC的鉴别中AUC及特异性可明显得到提高。进一步研究发现,血浆miR-205在从AFP<400ng/ml的HBV-HCC、HBV-LC患者中鉴别出HBV-HCC的AUC为0.815,敏感性为100%,明显优于AFP。结论:血浆miR-205虽然不能鉴别CHB与HBV-HCC,但其作为标志物应用于HBV-HCC的早期诊断,尤其是监控由乙肝肝硬化发展至肝细胞癌过程的潜在价值是不可忽视的。