磁珠法提取鸡血液基因组DNA效果研究

为确定一种稳定高效的鸡血液DNA提取方法,满足基因组检测对DNA的要求,研究应用磁珠法、酚-氯仿法和试剂盒法。分别对抗凝血和凝血状态的鸡血液样品进行基因组DNA提取,通过超分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳评价所获得的DNA质量,并对三种提取方法所需成本进行估算和比较。结果显示:三种方法均能从两种不同状态血液样本中提取出基因组DNA,酚-氯仿法最为经济,但耗时长且需要使用危险化学品,磁珠法与试剂盒法具有耗时短和环保的优点,且磁珠法较试剂盒法更经济。研究表明磁珠法使用的试剂量少、操作简单、耗时短、日提取样本数目远大于其他两种方法,是三种方法中最为快捷的方法,可以满足实际生产中大批量鸡血液基因组DNA提取的要求。

利用微卫星血液DNA标记分析延边圈养黑熊遗传多态性

为了掌握圈养黑熊的相关遗传信息，试验采用微卫星血液DNA标记法研究圈养黑熊的遗传多态性，试验选择延边地区3个熊场175头圈养黑熊，对其进行遗传多态性检测，计算其等位基因频率、多态信息含量（PIC）等。结果表明：圈养黑熊的6个微卫星座位总共检测到39个等位基因，每个位点的等位基因数量为4．000～8．000个，每个微卫星的平均位点为6．500个，基因频率分布在0—1之间；6个微卫星基因座的平均PIC为0．5717，且PIC值在0．4534—0．7422之间，廷边3个黑熊养殖群体的平均PIC均高于0．5，表明6个微卫星标记均具有高度多态性，因此可以分析圈养黑熊的遗传多态性。

六种试剂盒提取血液基因组DNA效果比较

为筛选一种高效、快捷的血液基因组DNA提取试剂盒,采集24份新鲜西藏绵羊血液样本,选用6种市售商业化试剂盒(LifeFeng柱式试剂盒DK601和非柱式试剂盒DK602,康为世纪非柱式试剂盒CW0544和柱式试剂盒CW0546,上海生工非柱式试剂盒SK8224和柱式试剂盒SK8254),比较所提DNA的浓度、纯度、得率以及对嗜吞噬细胞无形体16S rRNA进行巢式PCR扩增,综合评价不同试剂盒DNA提取效果。结果表明,应用LifeFeng柱式试剂盒DK601提取的DNA浓度和纯度均最高,得率较高,分别达到75.63 ng/μL、1.894(OD260/OD280)、18.91 ng/μL;且嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因的PCR扩增条带清晰度最优。因此,LifeFeng DK601可作为提取绵羊血液基因组DNA及嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)病原鉴定的首选试剂盒。

大黄鱼血液基因组DNA的提取及其效果

应用Sangon血液基因组DNA小量抽提试剂盒,提取大黄鱼血液组织的基因组DNA,并以所提取的DNA为模板进行RAPD扩增效果分析。结果显示,血液基因组DNA稳定性好、质量高,分子量大小在20kb左右;RAPD扩增条带清晰,能满足RAPD等一般分子实验对于模板DNA的质量要求。为大黄鱼的隔代连续研究和濒危鱼类分子实验所要求的活体基因组DNA的获得提供了一个可行的样本组织采集方法。

血液总DNA提取方法的优化

目的:比较不同蛋白酶K浓度对血液总DNA浓度和纯度提取的影响作用。方法:随机抽取22份新疆建设兵团第三师51团全民体检血液样本,以TIANGEN生化科技(北京)有限公司血液提取试剂盒(离心柱型)为基础,分析11种不同蛋白酶K浓度(18.0,18.4,18.6,18.8,18.9,19.0,19.1,19.2,19.4,19.6,20.0mg/m L)对250μL血液总DNA浓度和纯度提取的影响。结果:(1)在蛋白酶K浓度在18.0~20.0mg/m L范围时,随着蛋白酶K浓度的增加,所提取的DNA浓度在19.0mg/m L时达到最大,当继续增加蛋白酶K浓度时,DNA浓度呈明显下降趋势;(2)随着蛋白酶K浓度的增加,OD_(260)/OD_(280)在18.6mg/m L时达到最大,且继续增加蛋白酶K浓度,OD260/OD280呈缓慢下降趋势;(3)蛋白酶K浓度在18.8~19.0mg/m L时,所提取的DNA浓度和纯度最佳。结论:建议TIANGEN生化科技(北京)有限公司在提取250μL人血液样本时选择蛋白酶K浓度应为18.8~19.0mg/m L,既能提高血液核酸DNA的提取质量,又可降低提取人血液DNA的成本。

DNA免疫吸附剂血液灌流在系统性红斑狼疮治疗中的应用

目的探讨DNA免疫吸附剂血液灌注疗法对系统性红斑狼疮(SLE)的临床治疗效果。方法 32例SLE患者均在常规甲泼尼龙联合环磷酰胺冲击治疗的基础上应用DNA免疫吸附血液灌注治疗。观察患者治疗前后血清免疫学指标和不良反应。结果治疗后,患者抗ds-DNA明显低于治疗前(P<0.05),ANA滴度和IgG明显低于治疗前(P<0.01),治疗前后IgA和IgM无显著差异(P>0.05)。结论 DNA免疫吸附剂血液灌流有助于降低SLE患者机体内异常增多的抗ds-DNA抗体和ANA等,从而改善病情,提高疗效。

DNA免疫吸附血液灌流器治疗狼疮性肾炎的效果观察

目的探析DNA免疫吸附血液灌流器治疗狼疮性肾炎的效果。方法 48例狼疮性肾炎患者,根据随机分配原则分为对照组和观察组,各24例。对照组采用常规药物治疗,观察组采用DNA免疫吸附血液灌流器治疗,比较两组治疗效果。结果治疗后,两组患者的尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐优于治疗前,观察组患者尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐优于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。观察组不良反应发生率为12.50%,对照组为4.17%,两组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用DNA免疫吸附血液灌流器治疗狼疮性肾炎可获得理想的治疗效果,且患者不良反应发生率低,值得进一步推广和应用。

乙型肝炎病毒前S1抗原与病毒DNA检测及相关性研究

目的了解乙型肝炎病毒(HBV)前S1(Pre-S1)抗原在乙肝患者血清中的表达及评判其与HBV复制的关系。方法采用ELISA法检测858例各型乙肝患者血清标志物,以荧光定量PCR法检测HBVDNA,并比较分析Pre-S1抗原、HBeAg与HBV复制的相互关系和临床意义。结果858例各型乙肝患者中,Pre-S1抗原阳性总检出率为30.1%(258/858),HBeAg阳性总检出率为20.7%(178/858),HBVDNA阳性总检出率为43.2%(371/858)。在258例Pre-S1抗原阳性患者中,HBV-DNA阳性检出率为94.1%(243/258),而在371例HBVDNA阳性乙肝患者中,Pre-S1抗原和HBeAg阳性率分别为65.5%(243/371)和45.6%(169/371),两者差异有显著性(P<0.01)。结论Pre-S1抗原能够比HBeAg更灵敏地反映HBV复制,临床上可作为乙肝患者体内HBV复制的重要标志,但其敏感性不如HBVDNA强。

线粒体DNA在急性髓系白血病中的检测意义

目的探讨线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数改变在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中的临床意义。方法采用实时荧光定量PCR检测60例AML患者骨髓及外周血的mtDNA;以20例健康人外周血为对照,评估mtDNA(ND1单拷贝基因)拷贝数和核基因组人球蛋白(human globulin,hGB)的相对值在AML中的检测意义。结果初发或复发/难治AML患者外周血和骨髓液中mtDNA相对拷贝数高于治疗后缓解组(P<0.01);而同一患者外周血与骨髓液中mtDNA相对含量无明显差异(初发或复发/难治组,P=0.112;治疗后缓解组,P=0.667)。治疗后缓解AML患者外周血mtDNA含量与健康人差异无统计学意义(P=0.13),而初发或复发/难治AML患者外周血mtDNA含量高于健康人(P<0.01)。结论初发或复发/难治的AML患者骨髓液及外周血mtDNA含量均高于治疗后缓解AML患者,且同一患者外周血与骨髓液mtDNA含量无差异。检测AML患者外周血mtDNA相对拷贝数在一定程度上可以反映疾病状态。

乙型肝炎病毒外膜大蛋白与HBV DNA的关系研究

目的:探讨乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)与HBV DNA的关系。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR法,检测320例乙型肝炎患者血清中的HBV-LP水平及HBV DNA载量。结果:HBV-LP水平与HBV DNA拷贝数变化相一致,两者呈正相关(r=0.949);不同模式的HBeAg血清中HBV-LP与HBV DNA阳性率,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:血清HBV-LP水平能反映乙型肝炎患者体内HBV复制程度,是判断HBV复制的血清学指标。

乙肝病毒DNA定量与乙肝血清标志物及谷丙转氨酶相互关系

目的:探讨乙肝病毒DNA(HBV DNA)定量与乙肝血清标志物(HBV-M)各模式组及谷丙转氨酶(ALT)的相互关系。方法:荧光定量PCR法检测HBV DNA,ELISA法检测HBV-M,自动生化分析仪检测ALT。结果:HBsAg(+)、HBeAg(+)组的HBV DNA阳性率高、定量值高,而HBsAg(+)、HBeAg(-)组HBV DNA阳性率较低、定量值也较低,二者差异有显著性;HBsAg(-)者亦可检出HBV DNA;HBV感染者ALT阳性的概率增大,但二者在数量上无相关性。结论:三者联合检测,可更全面地反映乙肝感染者状况。

替吉奥联合阿帕替尼辅助治疗TACE术后原发性肝癌的临床观察及cfDNA与疗效的相关性

目的:观察替吉奥(seggio)联合阿帕替尼辅助治疗经导管肝动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)术后原发性肝癌(primar ylivercancer,PLC)的临床疗效,探讨血液游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)水平与疗效的相关性。方法:纳入2014年2月至2015年5月于南京中医药大学附属南京医院TACE术后PLC患者60例,其中30例经替吉奥联合阿帕替尼治疗的患者为研究组,30例经替吉奥治疗的患者为对照组。记录患者治疗后的不良反应(adverse reaction,ADR)发生频次,评价不同组别近期疗效,同时比较不同组别、不同疗效的cfDNA水平差异。进一步按cfDNA表达水平把PLC患者分成高表达组与低表达组,对患者进行长期随访,比较他们不同时间段生存率的差异、中位总生存时间(median overall survival,MOS)和无进展生存期(progression-free survival,PFS)。Cox单因素和多因素分析影响TACE术后PLC患者生存率的因素。结果:两组患者的ADR发生频次构成比相似(P>0.05)。研究组的总有效率(overall responserate,ORR)为53.33%,显著高于对照组的26.67%(P<0.05)。长期随访结果显示:研究组的MOS较对照组长,且5年生存率高于对照组(P<0.05)。cfDNA高表达组患者5年生存率较cfDNA低表达组高(P<0.05),PFS较cfDNA低表达组长(P<0.05)。Cox多因素分析结果显示:巴塞罗那临床肝癌(Barcelona Clinic Liver Cancer,BCLC)分级与cfDNA水平是影响晚期PLC患者治疗后生存的独立危险因素。结论:替吉奥联合阿帕替尼辅助治疗TACE术后PLC患者的疗效优于替吉奥单药治疗,ADR可耐受,可提高患者的生存率,且检测cfDNA水平对监测PLC患者疗效评价具有一定价值。

小细胞肺癌患者血浆循环DNA定量检测和完整性分析

目的定量检测小细胞肺癌患者血浆循环DNA并进行完整性分析。方法收集60例肺癌患者(病例组)、40例健康者(对照组)样本,采用实时荧光定量PCR,以管家基因GAPDH为目的基因定量检测血浆DNA水平;以肌动蛋白基因β-actin为目的基因(长片段543bp,短片度230bp)分析完整性。应用SPSS19.0统计统计进行数据分析。结果病例组患者血浆DNA水平[(3.105×10~5±0.923×10~5)copies/μL]高于对照组[(1.522×10~5±3.241×10~4)copies/μL]。病例组患者血浆DNA完整度指数(0.208 2±0.132 8)明显高于对照组(0.077 96±0.038 6),差异均有统计学意义(P<0.01)。结论小细胞肺癌患者血浆循环DNA水平和完整度均高于健康者。

肿瘤患者HBV-DNA载量与乙型肝炎血清标志物实时荧光定量PCR检测结果分析

目的探讨肿瘤患者实时荧光定量PCR检测HBV-DNA载量与乙型肝炎（乙肝）血清标志物常见模式的关系。方法采集2014年5-12月四川省肿瘤医院收治的313例肿瘤患者血液标本,采用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA载量,时间分辨荧光免疫法检测乙肝血清标志物（HBs Ag、HBs Ab、HBe Ag、HBe Ab、HBc Ab）。结果 HBs Ag（阳性）标本共227例,HBV-DNA阳性率为67.40%（153/227）,HBe Ag（阳性）标本共22例,HBV-DNA阳性率为90.91%（20/22）。小三阳组阳性率64.62%（126/195）,20%的患者HBV-DNA载量大于105U/m L,具有较强的传染性。结论在检测乙肝血清标志物的同时进行HBV-DNA载量检测对慢性乙肝肿瘤患者和隐性感染的肿瘤患者在化疗过程中是否存在乙肝复燃具有重要的监测意义。

高通量测序检测重症急性胰腺炎病人外周血细菌DNA谱

目的:感染及其并发症是重症急性胰腺炎(SAP)病人死亡的重要原因。然而,目前对SAP病人外周血微生物菌群的研究却十分有限。本研究旨在探讨SAP病人血液中细菌DNA谱图组成特征。方法:应用基于16S rDNA的高通量测序技术,对33名SAP病人进行了观察研究,以确定血液的细菌DNA谱图。结果:测序结果表明,在SAP病人的外周血,检测到由多种细菌DNA构成的微生物群,主要由变形菌门(Proteobacteria)(56.6±18.2)%、拟杆菌门(Bacteriodetes)(20.5±12.4)%、硬壁菌门(Firmicutes)(15.0±9.5)%和放线菌门(Actinobacteria)(5.2±3.1)%组成。这些细菌大多数(>80%)为肠道共生菌或条件致病菌。结论:本研究初步确定了SAP病人外周血细菌DNA谱图特征,外周血菌群形成可能是肠道菌群易位的结果,研究结果为SAP病人肠源性感染的诊断和防治提供了参考。

不同类型试剂盒提取血液基因组DNA效果的比较

目的比较溶液沉淀法、离心柱法和磁珠法试剂盒提取血液基因组DNA的效果。方法采集高血压患者的血液样本90份,随机分为3组,分别采用溶液沉淀法、离心柱法和磁珠法试剂盒提取血液样本基因组DNA。通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测及PCR扩增法对血液样本基因组DNA的提取效果进行比较。结果溶液沉淀法提取的DNA浓度显著高于离心柱法和磁珠法(P<0.05),离心柱法与磁珠法提取的DNA浓度差异无统计学意义(P>0.05),3种方法提取血液样本基因组DNA的A_(260)/A_(280)值及A_(260)/A_(230)值的差异均无统计学意义(P>0.05);3种方法提取的血液样本基因组DNA的大小基本相同,离心柱法提取的DNA点样孔处较干净,电泳条带单一,无拖尾;3种方法提取血液样本基因组DNA的PCR产物均可见单一且明亮的目的条带。结论 3种类型提取试剂盒各有优缺点,使用时应根据实际情况进行选择。

应用微卫星标记分析山丹军马场甘肃马鹿遗传多样性

目的:开展种群遗传学方面研究,了解圈养甘肃马鹿种群的遗传多样性水平,为该种群的饲养、管理和繁育提供依据。方法:采集53份圈养甘肃马鹿血液样本,提取基因组DNA后应用26对SSR位点引物对其扩增,通过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测SSR引物扩增情况和多态性,进而应用生物信息学方法对山丹军马场甘肃马鹿遗传多样性进行评价。结果:26个SSR位点共检测到96个等位基因,各位点Na为2~6,平均Ne、Ho、He、PIC和I分别为2.4502、0.4299、0.5315、0.4760和0.9666,其中5个位点为低度多态位点(PIC<0.25),7个位点为中度多态位点(0.25<PIC<0.5),14个位点为高度多态位点(PIC>0.5);26个位点中只有5个位点符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05);除了5个位点属于非中性位点外,其余21个位点属于中性位点;此外,F-固定系数分析中位点的平均Fis和Fit均为正值。山丹军马场和肃南鹿场两个甘肃马鹿种群比较结果表明,两个种群均为中度遗传多样性,有13个位点在两个甘肃马鹿种群多态性较稳定,可用于其他圈养和野生甘肃马鹿遗传多样性的研究。结论:说明山丹军马场圈养甘肃马鹿种群的遗传多样比较丰富,但也存在一定程度的近交。

血浆置换对慢性乙型重型肝炎患者血清病毒负荷的影响

【目的】探讨血浆置换对慢性乙型重型肝炎患者血清病毒负荷的影响及其临床意义。【方法】101例慢性乙型重型肝炎患者,分为血浆置换(PE)治疗组和对照组,分别检测血浆置换治疗前后肝功能、乙肝标志物、HBV定量水平;比较死亡组与存活组血浆置换治疗后血清总胆红素和HBV定量水平。【结果】慢性乙型重型肝炎患者PE治疗前肝功能和HBVDNA定量水平明显升高,PE术后肝功能和HBVDNA定量水平有显著下降,同对照组相比差异有显著性(P<0.01);死亡者PE治疗后总胆红素及HBVDNA定量水平同存活者相比差异有显著性(P<0.01)。【结论】PE可明显改善肝功能,降低血清HBVDNA定量水平,对外周血HBV有较强的清除作用。PE术后总胆红素和HBVDNA定量水平可以成为预测重肝治疗效果的一个指标。

液体活检技术在乳腺癌诊治中的应用进展

新一代检测技术液体活检相较于传统的组织活检具有操作简便、可重复性好、非侵入性等优势。液体活检的主要检测对象包括肿瘤标志物、人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2,HER-2）蛋白胞外段（extracellular domain,ECD）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）、循环肿瘤DNA等。肿瘤标志物的检测基本已成为临床应用的常规,但特异性有待提高。