血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒VP0蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)属于小RNA病毒科,主要引起雏鸭以肝脏肿胀、出血为主的急性、烈性传染病。DHAV-3有3个主要结构蛋白,其中VP0蛋白具有极佳的抗原性及宿主保护位点。为研制鸭肝炎病毒VP0蛋白的单克隆抗体,本研究将鸭肝炎病毒的VP0基因进行原核表达,用纯化后的重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、IFA筛选以及亚克隆后,获得了1株能够稳定分泌抗VP0蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A5,亚类鉴定为IgG1,IFA检测腹水效价为1∶12800。Western blot、IFA结果表明,制备的单克隆抗体效价高,反应原性强。本研究为后续建研制血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒的快检试剂盒,及建立病原及抗体检测方法奠定基础。

血清3型鸭甲型肝炎病毒TaqMan RT-qPCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中已发布的血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)基因序列,针对VP1基因序列的保守区域设计一对引物及一条特异性TaqMan探针建立了DHAV-3的TaqMan荧光定量检测方法(TaqManRT-qPCR)。通过对反应条件和反应体系的优化,建立的TaqManRT-qPCR方法在6.39×10^8~6.39×10^0拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,R2值为0.999。该方法能特异地检测出DHAV-3,与血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)及其他常见鸭病病原无交叉反应,且组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。用普通RT-PCR方法和建立的TaqManRT-qPCR方法,对63份临床疑似鸭肝炎的肝组织样品进行检测,结果RT-PCR方法检出DHAV-3的阳性率是34.92%(22/63),TaqManRT-qPCR方法检出的阳性率是41.27%(26/63);对49份DHAV-3感染康复鸭的肛拭子样品进行检测,RT-PCR和TaqManRT-qPCR方法检出阳性率分别为22.45%(11/49)和85.71%(42/49);用TaqManRT-qPCR方法和鸡胚半数致死量法(ELD50)对DHAV-3(SD70株)鸡胚病毒含量进行检测比较,两种方法检测结果呈正相关。结果表明所建立的TaqManRT-qPCR检测方法特异性好,灵敏度高,为DHA-3快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

血清3型鸭甲型肝炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

通过对GenBank公布的鸭甲型肝炎病毒全序列比对,在3型鸭甲肝炎病毒(DHVA-3)5’非编码区的保守区,设计了一对检测引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的阳性重组质粒经体外转录合成的RNA作为标准品绘制标准曲线,建立了一种快速检测DHAV-3的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法能特异性地检测出DHAV-3,而与血清1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒(H9)、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒无交叉反应。在1.8×103～1.8×108copies/μL的检测范围内标准曲线线性关系较好,R2为0.992。敏感性试验表明,最低检测限为36拷贝数RNA。用该方法和胚半数致死量法对尿囊液中病毒含量进行检测,表明二种方法检测结果呈正相关。本研究所建立的检测方法特异性好,灵敏度高,且操作方便,可为该病毒的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

一株血清3型鸭甲型肝炎病毒的鉴定及致病性分析

为明确从山东某鸭场分离的血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)的致病性和遗传特征,首先对分离鉴定的毒株进行VP1基因序列测定,与GenBank中发布的基因序列比对,并进行动物试验。分离的病毒株命名为DHAV-3-SDWF,2008~2020年分离的DHAV-3毒株主要Ⅰ和Ⅱ基因型,基因Ⅰ型又形成Ⅰa和Ⅰb两个分支,该病毒属于Ⅰa分支。DHAV-3-SDWF对雏鸭致病性强,攻毒鸭的肝脏、脾脏、肾脏等器官剖检变化和组织病变明显,这与该病毒在各组织器官中的转录水平是一致的。总之,DHAV-3的分离鉴定及致病性分析,为该病分子流行病学研究及疫苗研制提供了材料和理论支撑。

血清1型鸭甲型肝炎病毒实时定量PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种可检测血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)的实时定量PCR方法,根据Gen Bank中DHAV-1 5’非编码区的保守区,设计合成1对引物和1条Taq Man探针,以构建的重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,并对所建立方法进行了特异性、敏感性和可重复性试验以及临床病料检测初步应用。结果,该方法与血清3型鸭甲型肝炎病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒等无交叉反应性;最低可以检测到10 copies/μL;组内和组间变异系数均小于3%;临床病料的检测结果与测序检测结果一致。结果表明,所建立的实时定量检测方法具有特异、敏感、稳定等优点,可用于DHAV-1的快速检测与定量分析。

血清3型鸭甲型肝炎病毒阳性血清的制备

通过使用血清3型鸭甲型肝炎疫苗免疫SPF鸡,制备了一批血清3型鸭甲型肝炎诊断用阳性血清,并对其进行了无菌、支原体和特异性检验以及中和效价测定。结果表明,该血清无菌检验合格,无支原体污染,特异性良好,无禽类常见13种外源病毒抗体,血清中和效价为10-2.8。本研究为鸭甲型肝炎病毒血清学鉴定及相关研究提供了重要的物质基础。

鸡抗血清3型鸭甲型肝炎血清的制备与初步应用

通过使用血清3型鸭甲型肝炎疫苗毒免疫SPF鸡,制备血清3型鸭甲型肝炎诊断用标准阳性血清,对制备血清进行无菌、支原体和特异性检验以及效价测定,并用该抗血清进行鸭病毒性肝炎治疗试验。结果表明,该血清无菌检验合格,无支原体污染,特异性良好,无禽类常见13种外源病毒抗体,血清中和效价为10-2.8。发病雏鸭紧急治疗保护率为91.67%,而与血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)无交叉保护。