血清型A肉毒杆菌神经毒素重链对Neuro-2a细胞的促神经突起再生作用

目的:观察血清型A肉毒杆菌神经毒素重链(botulinum neurotoxin serotype A heavy chain,Bo NT/A HC)对Neuro-2a细胞的促神经突起再生作用并探讨与其相关的细胞内信号机制。方法:采用体外细胞培养技术,在培养液中加入不同浓度的Bo NT/A HC(0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L)进行干预,于24 h、48 h和72 h时收集细胞进行免疫荧光染色,再计算细胞突起长度及有突起细胞的百分比;在此基础上,选择最有效的Bo NT/A HC浓度作为处理剂量加入细胞培养液,于Bo NT/A HC作用后不同时点收集全细胞蛋白,采用Western blot检测p-ERK1/2及p-Akt的蛋白水平。结果:当Bo NT/A HC浓度为0.1 nmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L时,细胞突起的长度及有突起细胞的百分比与对照组相比皆明显增加,差异显著(P<0.05),其中1 nmol/L效果最显著。在细胞培养液内加入1 nmol/L Bo NT/A HC后,p-ERK1/2的蛋白水平呈增加趋势,其中Bo NT/A HC作用60 min后,p-ERK1/2的增加与对照组相比差异显著(P<0.05);与p-ERK1/2变化趋势类似,细胞培养液内加入1 nmol/L的Bo NT/A HC后,p-Akt的蛋白水平也呈增加趋势,其中Bo NT/A HC作用15 min和60 min时,p-Akt增加显著(P<0.05)。结论:一定剂量的Bo NT/A HC可以促进神经细胞突起再生和生长;Bo NT/A HC对Neuro-2a细胞的促神经突起再生作用机制可能通过激活与神经再生相关的信号蛋白ERK1/2和Akt的磷酸化而实现。

A型肉毒杆菌神经毒素重链干预大鼠脊髓损伤后蛋白表达的初步研究

目的:初步观察大鼠脊髓损伤模型基础上局部注射小剂量A型肉毒杆菌神经毒素重链(BoNT/A HC)后对局部蛋白表达谱的影响,为探讨BoNT/A HC干预在体神经损伤后相关蛋白表达及其干预神经再生机制提供实验基础。方法:复制大鼠单侧腰段脊髓损伤模型;采用SDS-PAGE及双向电泳观察不同剂量BoNT/A HC(2μg、4μg、6μg和8μg)对脊髓损伤后局部(包括损伤部位及其近头端部分脊髓组织)蛋白表达谱的干预作用。结果:大鼠单侧腰段脊髓损伤2 d时局部脊髓组织结构明显破坏崩解,损伤波及左侧脊髓灰质及白质;脊髓损伤局部SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色显示,于损伤同时局部一次性注射不同剂量BoNT/A HC后,某些蛋白表达与单纯损伤组相比明显不同,而与正常组基本一致;双向电泳结果进一步显示,损伤局部注射6μg BoNT/A HC后2 d和20 d时,在不同等电点及不同蛋白分子量水平上,有10余种蛋白表达与单纯损伤组明显不同,呈向正常转化的趋势。结论:大鼠脊髓损伤局部注射BoNT/A HC一定时间可影响损伤局部蛋白表达谱的变化,这种变化呈现由损伤造成的蛋白表达变化被转向正常的趋势。

A型肉毒毒素重链对大鼠脊髓损伤局部颈上神经节蛋白10的表达及神经突起再生的影响

目的:探讨人工重组A型肉毒毒素重链(BoNT/A重链)对大鼠脊髓损伤局部颈上神经节蛋白10(SCG10)表达、神经突起再生以及损伤侧后肢感觉及运动功能的影响,为阐明BoNT/A重链促神经突起生长的作用提供实验依据。方法:大鼠单侧腰段脊髓横断损伤模型基础上局部及鞘内给予BoNT/A重链;于用药后不同时间提取局部蛋白进行双向电泳,并根据双向电泳提示的蛋白点群变化的分子量和等电点,选取SCG10为目标蛋白行Western Blot检测及神经突起测定;通过抓力和热痛敏实验测试损伤侧后肢的运动和感觉功能情况。结果:(1)BoNT/A重链可干预脊髓损伤后局部蛋白谱的变化,MW位于18—25kDa、等电点在5—7范围的蛋白点可以作为蛋白点群变化的代表之一;(2)作为分子量位于18—25kDa/等电点在5—7的蛋白成分之一的SCG10在单纯损伤时较正常对照组其表达有所增高,给予BoNT/A重链后, SCG10的表达显著增强(P<0.05);(3)免疫荧光结果显示:单纯损伤时SCG10的阳性表达主要分布于损伤周边细胞的胞体,应用BoNT/A重链后,SCG10阳性分布于胞浆和细胞突起且以损伤近头端的周边区域较为显著;(4)突起测定结果显示:BoNT/A重链可促进脊髓损伤周边神经细胞突起增长,包括突起数目增多及含有突起的神经细胞百分比增多(P<0.05);(5)给予BoNT/A重链后,损伤侧后肢肌力明显优于单纯损伤组(P<0.05),但感觉功能未见明显改善。结论:脊髓损伤局部给予BoNT/A重链可促进生长相关蛋白SCG10的表达并促进损伤周边神经细胞突起生长,改善肌肉抓力。BoNT/A重链有助于脊髓损伤后的再生修复。

A型肉毒毒素重链在大肠杆菌中的厌氧表达

目的:用大肠杆菌表达可溶性A型肉毒毒素(BoNT/A)重链。方法:按大肠杆菌偏好密码子设计合成重链N端(HN)编码序列,重叠延伸PCR连接HN和重链C端(HC)构成重链基因;将重链基因构建至pTIG-TrxA载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),厌氧培养与好氧培养分别诱导表达重链;SDS-PAGE比较表达条带,ELISA比较不同表达条件的重链表达水平。结果:测序结果表明正确设计合成了HN编码序列;SDS-PAGE结果显示重链厌氧表达条带的相对分子质量与预期一致,好氧表达条带的相对分子质量比预期小;定性ELISA结果显示静置培养表达的重链活性远远高于摇床培养。结论:BoNT/A重链在大肠杆菌中厌氧条件下表达活性明显高于好氧表达,为厌氧生物蛋白在大肠杆菌中的表达提供了新思路。

儿科危重急症急救讲座 第三讲 食物中毒(下)

肉毒杆菌食物中毒 肉毒杆菌为革兰阳性厌氧肉毒梭状芽孢杆菌，存在于土壤、鱼及家畜的肠内和其粪便中，在缺氧的环境下可大量繁殖，产生外毒素（为嗜神经毒素）。肉毒杆菌依其血清型不同而分为A、B、D、E、F、G等8型，引起人类中毒的主要血清型是A、B、E三型。

B型肉毒神经毒素重链C-端片段的修饰及表达

目的修饰、克隆B型肉毒神经毒素重链C-端(BoNT/b HC)片段,并在大肠杆菌中进行表达。方法以B型肉毒梭状杆菌8806株基因组DNA为模板,PCR扩增B型肉毒神经毒素重链的转膜区和结合区,并以高频密码子替换BoNT/bHC基因N-端的5个低频密码子。将目的片段克隆入表达载体pET-42b,转化E.coli BL21(DE3)PlysS,IPTG诱导表达后,进行Western blot鉴定及可溶性分析。结果重组表达质粒经PCR及酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为80000,表达量占菌体总蛋白的32.6%,主要以包涵体形式存在;重组蛋白可被相应的抗BoNT/b全毒素的多克隆抗体所识别。结论已成功修饰并表达了B型肉毒神经毒素重链C-端片段,为进一步研制重组疫苗及高特异性的诊断试剂奠定了基础。

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端(heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A,Bo NT/AHc)特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化Bo NT/AHc抗原、免疫BALB/c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与Bo NT/AHc突变体结合,初步鉴定其在Bo NT/AHc的结合表位。结果得到纯度较高的Bo NT/AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均>3.0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与Bo NT/AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于Ig G1(Κ),3H3属于Ig M(Κ),而5H8属于Ig G2b(Κ);叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与Bo NT/AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与Bo NT/AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。