调节性T细胞联合血清外泌体ZFPL1在非小细胞肺癌诊断中的临床意义

目的探讨调节性T细胞(Treg)联合血清外泌体ZFPL1在非小细胞肺癌诊断中的价值。方法收集2022年1月至2022年10月收治的非小细胞肺癌患者67例为观察组,选择同期健康体检者61例为对照组。采用流式细胞仪测定Treg细胞标志物CD3^(+)CD8^(+)和CD4^(+)Foxp3^(+)水平;采用实时荧光PCR(qPCR)测定血清外泌体ZFPL1水平,分析Treg及血清外泌体ZFPL1表达水平与临床病理特征的关系;绘制受试者特征工作曲线(ROC)评价Treg联合血清外泌体ZFPL1诊断非小细胞肺癌的效能。结果观察组Treg细胞标志物CD3^(+)CD8^(+)水平为0.48±0.11,低于对照组的0.59±0.16(P<0.05);观察组血清外泌体ZFPL1水平和Treg细胞标志物CD4^(+)Foxp3^(+)水平分别为3.62(1.44,7.62)和0.76±0.06,高于对照组的0.91(0.17,3.43)和0.67±0.19,差异均有统计学意义(P<0.05)。CD4^(+)Foxp3^(+)及血清外泌体ZFPL1水平与分期和病理类型有关(P<0.05)。Treg细胞标志物CD3^(+)CD8^(+)、CD4^(+)Foxp3^(+)及血清外泌体ZFPL1联合检测诊断非小细胞肺癌患者的效能高于单一指标(P<0.05)。结论Treg细胞标志物CD4^(+)Foxp3^(+)和血清外泌体ZFPL1在非小细胞肺癌中呈高表达,CD3^(+)CD8^(+)水平呈低表达,能准确地实现术前分期,不同指标联合测定能提高诊断效能。

血清外泌体miRNA-21、miRNA-214联合检测在骨质疏松症诊断中的价值

目的探讨骨质疏松症(OP)患者血清外泌体中微小RNA(miRNA)-21和miRNA-214的相对表达水平及其对OP的诊断价值。方法选取重庆市人民医院2022年1月至2023年12月收治的77例OP患者作为OP组,另选取同期该院81例健康体检者为健康对照组。分离并鉴定血清外泌体,提取外泌体miRNA。采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测两组血清外泌体中miRNA-21和miRNA-214的相对表达水平。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清外泌体中miRNA-21和miRNA-214对OP的诊断价值。结果分离的血清外泌体中CD63标志蛋白呈高表达。OP组血清外泌体miRNA-21和miRNA-214相对表达水平分别为5.302(2.407,9.765)和1.875(1.605,2.450),明显高于对照组的1.338(0.801,2.088)和1.163(0.860,1.391),差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,血清外泌体miRNA-21、miRNA-214相对表达水平升高是导致OP的危险因素(P<0.05)。ROC曲线结果显示,血清外泌体miRNA-21、miRNA-214诊断OP的AUC分别为0.853、0.811,灵敏度分别为80.5%、89.6%,特异度分别为79.0%、82.7%,二者联合诊断OP的AUC为0.919,灵敏度为90.9%,特异度为84.0%。结论血清外泌体miRNA-21和miRNA-214单独检测对诊断OP具有一定的价值,二者联合检测可提高诊断的准确性,有临床应用价值。

血清外泌体miR-125a-5p和miR-99b-5p在心力衰竭诊断中的价值

目的采用微阵列和荧光定量PCR(qRT-PCR)技术评估在心力衰竭中具有诊断效能的miRNA。方法用微阵列探索心力衰竭患者血清中的miRNA表达谱,并用qRT-PCR方法检测候选miRNA的表达水平。然后,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析候选miRNA的诊断价值。结果与健康对照者相比,miR-125a-5p和miR-99b-5p在心力衰竭患者的血清外泌体中明显下调,其ROC曲线下面积(AUC)分别为0.73和0.72。此外,miR-125a-5p和miR-99b-5p的联合检测比单个miRNA具有更高的诊断价值,其AUC达到0.80。结论miR-125a-5p和miR-99b-5p的表达水平在心力衰竭患者的血清外泌体中显著下调,可作为心力衰竭诊断的新型循环生物标志物。miR-125a-5p和miR-99b-5p联合后的诊断效能高于其单独使用。

circRNA SIPA1L1修饰牙髓干细胞来源外泌体促血管生成能力的机制

目的 探究环状RNA(circRNA)信号诱导增殖相关蛋白1样蛋白1(SIPA1L1)修饰的人牙髓干细胞(hDPSC)来源外泌体(Exo)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成能力的影响及机制。方法 从牙髓组织分离培养hDPSC,将circSIPA1L1过表达质粒载体转染至hDPSC后,分离Exo并进行鉴定。将HUVEC分为对照组、hDPSC Exo组、circSIPA1L1-hDPSC Exo组,培养48 h后,Matrigel基质胶血管形成实验检测血管形成能力,qRT-PCR和Western blot测定血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)、胎盘生长因子(PGF)的表达水平。结果 从未转染的hDPSC与转染circSIPA1L1的hDPSC中成功分离出Exo,且相较于h DPSC来源的Exo,转染circSIPA1L1的hDPSC来源的Exo中circSIPA1L1相对表达量显著上调(P <0.05)。与hDPSC Exo组比较,circSIPA1L1-hDPSC Exo组HUVEC的管样结构形成数目显著增加(P <0.05),VEGF、VEGFR2、PGF mRNA与蛋白相对表达量也显著上调(P<0.05)。结论 circRNA SIPA1L1修饰hDPSC来源的Exo能够促进血管生成,其机制可能与上调VEGF、VEGFR2、PGF的表达水平有关。

Sirt1对高糖诱导的足细胞外泌体释放的影响

目的探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶1(Sirt1)对高糖诱导的足细胞外泌体释放的影响。方法将永生化小鼠足细胞MPC5分为正常糖组(5.5 mmol/L葡萄糖,A组)、高渗组(5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇,B组)、高糖组(30.0 mmol/L葡萄糖,C组)、高糖+Sirt1过表达慢病毒转染组(Sirt1过表达慢病毒转染+30.0 mmol/L葡萄糖,D组)、高糖+阴性慢病毒转染组(阴性慢病毒转染+30.0 mmol/L葡萄糖,E组)、高糖+外泌体分泌抑制剂组(GW4869+30.0 mmol/L葡萄糖,F组)6组。采用免疫印迹法检测各组细胞Sirt1、足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin、Podocin)及CD63、CD81、Alix的表达水平,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测D、E组细胞Sirt 1 mRNA表达水平,使用透射电子显微镜观察足细胞外泌体形态,采用纳米粒子跟踪分析技术检测外泌体的粒径和浓度。结果RT-qPCR结果显示,D组足细胞Sirt1 mRNA相对表达量显著高于E组(t=14.580,P<0.01)。纳米粒子跟踪分析及免疫印迹结果显示,A~C组间足细胞Sirt1、Nephrin和Podocin蛋白相对表达量比较差异均具有显著性(F=49.84~106.40,P<0.01);与A组相比,C组足细胞外泌体分泌显著增加(t=14.550,P<0.01),Nephrin、Podocin、Sirt1相对表达量显著减少(t=7.446~15.110,P<0.01);与E组相比,D组足细胞外泌体分泌显著减少(t=74.610,P<0.01),Nephrin、Podocin、Sirt1相对表达量显著增加(t=4.657~32.860,P<0.05);与C组相比,F组足细胞外泌体分泌显著减少(t=16.300,P<0.05),Nephrin、Podocin相对表达量显著增加(t=3.790、8.151,P<0.01),Sirt1表达水平无统计学差异(P>0.05)。结论高糖诱导的足细胞Sirt1减少可促进外泌体分泌及足细胞损伤。

血清外泌体中miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件的相关性

目的探究血清外泌体中微小RNA-301a(microRNA-301a,miR-301a)与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件的关系。方法选取河北北方学院附属第一医院2019年6月至2020年6月接受腹膜透析治疗的211例糖尿病肾病患者作为研究对象。用实时荧光定量聚合酶链反应法检测血清外泌体中miR-301a水平;以miR-301a中位数为界将患者分为高miR-301a组和低miR-301a组,比较两组患者的临床资料;用Spearman分析miR-301a与超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)相关性;用线性回归分析miR-301a的相关影响因素。随访患者2年,用Kaplan-Meier和Log-Rank比较2组的累积心脑血管事件发生率,用COX回归和限制性立方样条分析miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件的水平-效应关系。结果随访期间37例(17.54%)发生心脑血管事件。低miR-301a组的hs-CRP水平和透析时长均低于高miR-301a组(P<0.05)。miR-301a与hs-CRP呈正相关关系(r_(s)=0.237,P=0.001)。线性回归分析结果显示,hs-CRP与miR-301a独立相关(P<0.05)。低miR-301a组的累积心脑血管事件发生率为3.70%(4/108),低于高miR-301a组[32.04%(33/103),P<0.001]。COX回归分析结果显示,高血清白蛋白水平是糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件的独立保护因素,高hs-CRP水平和miR-301a>1.46是糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件的独立危险因素。限制性立方样条拟合COX回归分析结果显示,miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件呈非线性关系(P<0.05)。结论hs-CRP与糖尿病肾病腹膜透析患者miR-301a独立相关。miR-301a水平高提示糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件风险高。

血清外泌体中mi R-642a-3p下调HK1对胰岛素分泌和儿童1型糖尿病进展的影响

目的:探讨血清外泌体中miR-642a-3p靶向HK1对1型糖尿病(T1DM)患儿胰岛β细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌的影响。方法:GEO数据库筛选T1DM患儿血清中的差异表达miRNAs,Targetscan预测miRNAs的靶基因,双荧光素酶报告实验验证靶向关系。收集68例T1DM患儿外周血标本,分离并鉴定血清外泌体。高糖培养基处理胰岛β细胞。将转染后的外泌体与胰岛β细胞共培养并分组。采用qRT-PCR分别检测miR-642a-3p在外周血、血清外泌体中的表达水平。流式细胞术、CCK-8试验检测胰岛β细胞的凋亡和增殖情况。ELISA检测胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和胰岛素分泌浓度。结果:相对于健康志愿者,T1DM患儿血清及血清外泌体中miR-642a-3p表达明显升高(均P<0.05)。HK1被证实为miR-642a-3p的靶点。相对于NC组,抑制血清外泌体中miR-642a-3p的表达后胰岛β细胞凋亡率降低,增殖活性增加,胰岛素分泌增多,GLP-1浓度上调(均P<0.05)。过表达miR-642a-3p能够提高胰岛β细胞凋亡率,减弱其增殖活性,使胰岛素分泌减少,抑制GLP-1表达(均P<0.05),从而进一步促进T1DM,但该作用被HK1部分挽救(均P<0.05)。结论:血清外泌体源性miR-642a-3p能够通过调控HK1抑制胰岛β细胞增殖,并促进其凋亡,从而促进儿童T1DM进展。血清外泌体源性miR-642a-3p有望在儿童T1DM的靶向治疗中发挥作用。

M1表型的小胶质细胞外泌体对血脑屏障功能的影响

目的:研究M1表型的小胶质细胞外泌体(M1 microglia-derived exosome,M1-exo)对体外血脑屏障(blood-brain bar⁃rier,BBB)功能及血管内皮细胞间紧密连接蛋白表达的影响。方法:用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠小胶质细胞来源的细胞系BV2细胞,流式技术检测其向M1型极化情况,分离提取外泌体。用小鼠脑微血管内皮细胞系b.End3细胞与原代培养的小鼠星形胶质细胞构建体外BBB模型,随机分为3组:b.End3细胞正常培养组(b.End3组)、b.End3细胞+25µg/mL正常BV2细胞来源外泌体(BV2-derived exosome,BV2-exo)组(b.End3+BV2-exo组)、b.End3细胞+25µg/mL M1表型的小胶质细胞来源外泌体组(b.End3+M1-exo组)。按实验分组将不同来源外泌体与BBB模型共培养,检测各组的跨膜电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)、荧光黄通过率,免疫印迹法(Western blot,WB)检测紧密连接复合物蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1及JAM蛋白的表达。结果:①小胶质细胞向M1型极化成功,其细胞标志物CD16/32阳性率较对照组明显升高(P=0.023);②与M1-exo共培养后,体外BBB模型的TEER明显下降(P=0.000),对荧光黄的透过率明显增加(P=0.000);③与b.End3组和b.End3+BV2-exo组相比,b.End3+M1-exo组的Claudin-1、Occludin及ZO-1蛋白的表达水平明显下降。结论:M1-exo可以破坏BBB的完整性,影响其功能。

外泌体负载的KV11通过VDAC1和自噬机制对角膜新生血管的抑制作用

目的探讨外泌体(EXO)负载的抗新生血管短肽KV11在角膜新生血管(CNV)中的作用及其机制。方法利用EXO锚定肽CP05将KV11结合到血管内皮来源的EXO膜表面,形成EXO-KV11。通过Apogee纳米流式分析EXO负载KV11的效率和最佳浓度比。选取8周龄SPF级健康雄性SD大鼠100只,其中10只大鼠不做任何处理,为正常对照组;其余大鼠在建立碱烧伤诱导CNV大鼠模型后,采用随机数字表法随机将大鼠分为EXO-KV11组、KV11组和生理盐水组,每组各30只。从碱烧伤后第1天开始每隔1天,各组分别结膜下注射100μl EXO-KV11(25μg)、KV11(25μg)或生理盐水。观察第1、4、7、14天时CNV的生成情况;采用荧光素心室灌注、角膜血管造影法计算CNV面积;采用苏木精-伊红染色法观察各组CNV管腔数量;采用免疫组织化学法检测角膜组织中CD31的表达分布;采用Western blot法检测电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)和内质网应激、自噬及凋亡相关蛋白的表达水平。结果Apogee流式分析确定KV11与EXO最佳浓度比为4∶1,EXO负载KV11效率高达87.5%。碱烧伤后7 d和14 d,各组CNV面积总体比较差异均有统计学意义(F=4.613、15.590,均P<0.05),其中碱烧伤后7 d,EXO-KV11组CNV面积小于KV11组和生理盐水组;碱烧伤后14 d,EXO-KV11组和KV11组CNV面积均小于生理盐水组,EXO-KV11组CNV面积小于KV11组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。角膜荧光铺片定量分析结果显示,生理盐水组、KV11组和EXO-KV11组CNV相对荧光面积分别为(8.3±1.7)%、(5.2±1.6)%和(3.4±0.7)%,总体比较差异有统计学意义(F=11.735,P<0.01),其中KV11组和生理盐水组CNV相对荧光面积均大于EXO-KV11组,生理盐水组CNV相对荧光面积大于KV11组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。碱烧伤后14 d,生理盐水组基质内可见大量新生血管管腔;KV11组基质内新生血管管腔数量较生理盐水组少;EXO-KV11组角膜结构趋于正常,少见新生血管管腔。生理盐水组角膜基质内可见大量CD31染色阳性细胞,细胞围成大小不一的管腔结构;KV11组角膜基质内CD31染色阳性细胞围成的管腔数量较生理盐水组少,EXO-KV11组管腔数量较KV11组少。EXO-KV11组、KV11组、生理盐水组和正常对照组VDAC1、蛋白质激酶R样内质网激酶(PERK)、自噬接头蛋白(SQSTM1/p62)、活化半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase 3)相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=35.960、8.947、17.791、101.168,均P<0.01),其中EXO-KV11组VDAC1、PERK、p62、cleaved caspase 3相对表达量高于KV11组和生理盐水组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。各组自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)Ⅱ/LC3BⅠ蛋白相对表达量总体比较,差异无统计学意义(F=0.445,P=0.727)。结论与KV11相比,EXO-KV11可通过增加VDAC1表达、刺激PERK产生、抑制自噬流的发生等机制更有效地抑制CNV。

内质网应激头颈部鳞状细胞癌细胞通过外泌体miR⁃26a⁃5p调控PTEN/AKT通路促进巨噬细胞PD⁃L1表达

目的探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的头颈部鳞状细胞癌(head and neck squa⁃mous cell carcinoma,HNSCC)细胞分泌的外泌体miRNA表达变化对巨噬细胞的影响机制。方法本研究已通过单位伦理委员会审查批准。通过蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)和实时荧光定量PCR实验(RT⁃qPCR)检测HNSCC肿瘤组织及癌旁组织ERS相关蛋白,包括蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R⁃like endoplas⁃mic reticulum kinase,PERK)和葡萄糖调节蛋白78(glucose⁃regulated protein 78,GRP78)的表达水平;以500 U/mL干扰素⁃γ(interferon⁃γ,IFN⁃γ)处理人喉鳞癌细胞系HN4细胞48 h,诱发HN4细胞产生内质网应激反应,收集HN4细胞分泌的外泌体,通过生物信息学分析鉴定外泌体的miRNA种类,预测miRNA的靶基因,将巨噬细胞转染miRNA、与收集的外泌体共培养、并敲低巨噬细胞PTEN表达,以WB和RT⁃qPCR检测外泌体miRNA调控的下游信号通路蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)及程序性死亡受体⁃1配体(programmed death receptor ligand 1,PD⁃L1)表达变化。结果HNSCC肿瘤组织相比癌旁组织ERS相关蛋白表达水平升高(P<0.05);RNA测序及实验验证表明ERS的HN4细胞分泌的外泌体miR⁃26a⁃5p表达上调(P<0.05);PTEN是miR⁃26a⁃5p的靶基因,miR⁃26a⁃5p升高巨噬细胞PD⁃L1表达水平,并下调PTEN表达(P<0.05);巨噬细胞与ERS外泌体共培养,miR⁃26a⁃5p和PD⁃L1表达上升,PTEN表达下降,p⁃AKT表达升高(P<0.05);敲低巨噬细胞PTEN表达,PD⁃L1表达上升(P<0.01)。结论ERS的HNSCC细胞通过外泌体miR⁃26a⁃5p调控PTEN/AKT通路及PD⁃L1的表达。

过表达miR-124-1基因的骨髓间充质干细胞外泌体调控小胶质细胞M2型极化对脑卒中的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)外泌体(exosomes,Exo)过表达miR-124-1基因(Exo/124-1)调控小胶质细胞(microglia,MG)的M2型极化对脑卒中的影响。方法分离培养大鼠BMMSCs,收集其Exo(BMMSCs-Exo),采用流式细胞术、Western blot与透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)分别对其进行检测鉴定。30只大鼠简单随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO/R组)、Exo移植组(Exo组)、空病毒(Empty lentivirus,Elv)转染Exo移植组(Exo-Elv组)及Exo/124-1移植组(Exo/124-1组),每组6只。Sham组仅行假手术,其余各组均复制大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)模型。模型复制1 d与14 d后,各移植组动物于右侧脑室植入相应移植物,Sham组、模型组注入相同剂量生理盐水作对照。术后2 h及1、3、7、14、21、28 d,分别对各组动物行改良神经系统严重程度评分(modified neurological severity scores,mNSS)。三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色检测其梗死体积。在基因与蛋白水平分别检测各组28 d脑组织MG的M1型分子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]、M2型分子(CD206)的表达情况。结果成功获取并鉴定了BMMSCs及其Exo。Exo/124-1显著表达miR-124-1。所有动物(假手术组除外)术后出现神经功能缺损。术后7~28 d,Exo/124-1组的mNSS明显低于MCAO/R组(P<0.05)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01);术后28 d,Exo/124-1组的脑梗死体积、TNF-α的表达明显小于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01),CD206的表达显著高于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01)。结论BMMSCs-Exo携带miR-124-1基因可能调控MG的M2型极化,抑制M1型介导的炎症反应,促进脑卒中大鼠神经功能的恢复。

老年脓毒症相关性脑病患者血清外泌体LncNEAT1、LncSOX2OT表达及对临床预后评价

目的分析老年脓毒症相关性脑病(SAE)患者血清外泌体长链非编码RNA核富含丰富的转录本1(LncNEAT1)、长链非编码RNA SRY盒转录因子2重叠转录本(LncSOX2OT)的表达及对临床预后意义。方法选择2020年2月—2022年2月就诊于成都中医药大学附属第五人民医院重症医学科的老年SAE患者96例为SAE组,根据28 d内生存状态再分为生存亚组(n=50)和死亡亚组(n=46),以同期诊治的无SAE的脓毒症患者60例为非SAE组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清外泌体中LncNEAT1、LncSOX2OT的表达水平。多因素Logistic回归分析老年SAE患者预后的影响因素。受试者工作特征曲线(ROC)分析血清外泌体LncNEAT1、LncSOX2OT对老年SAE患者预后的诊断价值。结果SAE组血清外泌体LncNEAT1、LncSOX2OT的相对表达高于非SAE组(t/P=16.726/<0.001、21.803/<0.001)。死亡亚组SAE患者C反应蛋白、降钙素原、神经元特异性烯醇化酶、APACHEⅡ评分、SOFA评分、LncNEAT1、LncSOX2OT均高于生存亚组(t/P=14.197/<0.001,4.535/<0.001,19.253/<0.001,8.442/<0.001,5.670/<0.001,9.861/<0.001,6.931/<0.001)。SAE患者血清外泌体LncNEAT1、LncSOX2OT与APACHEⅡ评分、SOFA评分呈正相关(r/P=0.812/<0.001,0.761/<0.001,0.833/<0.001,0.598/<0.001)。降钙素原高、C反应蛋白高、神经元特异性烯醇化酶高、APACHEⅡ评分高、SOFA评分高、LncNEAT1高及LncSOX2OT高是影响SAE患者28 d生存预后的独立危险因素[OR(95%CI)=1.459(1.195~1.782)、1.464(1.164~1.841)、1.334(1.086~1.639)、1.644(1.223~2.210)、1.779(1.295~2.444)、1.347(1.050~1.728)、1.578(1.122~2.219)]。血清外泌体LncNEAT1、LncSOX2OT二者联合预测SAE患者28 d生存预后诊断的AUC为0.914,高于单项指标的0.846、0.834(Z/P=3.864/<0.001、3.915/<0.001)。结论老年SAE患者血清外泌体LncNEAT1、LncSOX2OT表达升高,是影响老年SAE患者预后的独立危险因素,并对老年SAE患者生存预后具有较高的评估价值。

血清外泌体miR-20b-5p miR-107水平检测在非小细胞肺腺癌诊断及预后评估中的应用

目的探究血清外泌体miR-20b-5p、miR-107水平检测在非小细胞肺腺癌诊断及预后评估中的应用价值。方法选取2015年12月至2018年12月河南科技大学第一附属医院胸外科收治的124例非小细胞肺腺癌患者为观察组,另选取120例同期于本院接受体检的健康体检者为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链法(qRT-PCR)检测血清外泌体miR-20b-5p、miR-107表达水平,受试者工作特征曲线(ROC)评估miR-20b-5p、miR-107水平检测对非小细胞肺腺癌的早期诊断价值,Kaplan-Meier生存分析研究miR-20b-5p、miR-107水平与患者预后的关系。结果观察组的血清外泌体miR-20b-5p、miR-107水平高于对照组(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清外泌体miR-20b-5p、miR-107检测诊断非小细胞肺腺癌的AUC值分别为0.766、0.821,最佳截断值分别为1.81、1.27。观察组患者中,117例完成随访,7例失访。随访3年后,64例患者死亡,53例患者存活。根据患者的生存状态绘制ROC曲线,确定miR-20b-5p、miR-107预测患者预后的最佳截断值分别为1.95、1.60;miR-20b-5p高表达与低表达、miR-107高表达与低表达患者的TNM分期和淋巴结转移比较,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-20b-5p、miR-107高表达患者的中位生存时间均低于低表达患者(P<0.05)。结论外泌体miR-20b-5p、miR-107在非小细胞肺腺癌患者血清中呈高表达状态,其表达水平与患者的预后相关,在疾病诊断与预测患者累计生存率方面具有一定的参考意义。

宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向TJP1调控血管内皮细胞层通透性促癌细胞转移的分子机制研究

目的探讨宫颈癌细胞分泌的外泌体miR-191-5p对血管内皮细胞层的通透性影响,为肿瘤血管相关的基因靶点研究提供理论依据。方法提取并鉴定宫颈癌细胞(SiHa/HeLa)培养上清来源的外泌体。将宫颈癌细胞源外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养,检测外泌体的摄取。跨内皮电阻(TEER)测定HUVEC单层细胞形成时间。内皮细胞层通透性测定HUVEC细胞层通透性。qRT-PCR检测宫颈癌细胞、外泌体及与外泌体共培养48 h的HUVEC中miR-191-5p表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-191-5p与TJP1的靶向关系。qRT-PCR、Western blot检测miR-191-5p、TJP1表达。内皮细胞层穿透实验检测miR-191-5p对HUVEC细胞层通透性的影响以及能否促进宫颈癌转移。恢复实验、qRT-PCR、Western blot检测TJP1的表达。结果提取的微小囊泡确是宫颈癌源外泌体。宫颈癌源外泌体可被HUVEC细胞摄取。TEER随时间增加而增大,在培养3 d时细胞形成单层,TEER达到最大值;外泌体共培养的HUVEC细胞层通透性增大,差异有统计学意义(P<0.0001)。miR-191-5p在宫颈癌源外泌体中富集,并被转运至HUVEC细胞中,miR-191-5p与TJP1存在靶向关系。与PBS组比较,miR-191-5p mimics组的miR-191-5p相对表达水平升高,TJP1的相对表达水平下降,而miR-191-5p inhibitor组的miR-191-5p相对表达水平下降,TJP1的相对表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01);与PBS组比较,miR-191-5p mimics组通透性增加,而miR-191-5p inhibitor组通透性减弱,差异有统计学意义(P<0.0001)。在SiHa细胞中,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组穿透的平均细胞数增加,miR-191-5p inhibitor组穿透的平均细胞数下降,差异有统计学意义(P<0.05)。在HeLa细胞中,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组穿透的平均细胞数增加,miR-191-5p inhibitor组穿透的平均细胞数下降,差异有统计学意义(P<0.05)。恢复实验结果显示,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组TJP1的相对表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-191-5p mimics组比较,pCMV-T+mimics组中TJP1的表达量增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向调控TJP1导致血管内皮细胞层通透性增加,进而促进宫颈癌细胞转移。

骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

病毒性心肌炎血清外泌体来源的miR-320通过靶向Pik3r1抑制AKT/mTOR通路促进小鼠心肌细胞凋亡

目的探讨病毒性心肌炎血清外泌体miR-320对心肌细胞凋亡的影响及机制。方法使用柯萨奇病毒B3(CVB3)腹腔注射,建立病毒性心肌炎小鼠模型;采用血清外泌体抽提试剂盒提取血清外泌体,与心肌细胞共培养,激光共聚焦显微镜观察心肌细胞摄取外泌体情况;使用miR-320抑制剂或模拟物转染心肌细胞,实时荧光定量PCR检测miR-320表达水平;采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,Western blot法检测B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)和Bcl2相关X蛋白(BAX)表达水平;生物信息学预测miR-320靶基因并进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析;荧光素酶报告基因检测miR-320与其靶基因磷脂酰肌醇3激酶调节亚基1(Pik3r1)的作用关系;Western blot法检测miR-320对蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)通路蛋白的影响。结果病毒性心肌炎血清外泌体促进心肌细胞凋亡并上调BAX水平,同时降低Bcl2水平;病毒性心肌炎小鼠心肌组织中miR-320显著上调,且miR-320成熟体和miR-320前体pri-miR-320表达在心肌细胞均明显上调;病毒性心肌炎血清外泌体处理的心肌细胞中miR-320水平显著上调,而转染miR-320抑制剂逆转了外泌体引起的miR-320上调及凋亡率升高;Pik3r1是miR-320的靶基因,其过表达逆转miR-320上调导致的心肌细胞凋亡;miR-320过表达抑制AKT/mTOR通路激活。结论病毒性心肌炎血清外泌体miR-320通过靶向Pik3r1抑制AKT/mTOR通路促进小鼠心肌细胞凋亡。

血清外泌体LncRNA PCAT1在早期非小细胞肺癌诊断中的潜在价值研究

目的 探讨血清外泌体长链非编码RNA(LncRNA)在非小细胞肺癌(NSCLC)早期诊断中的价值。方法回顾性选取湖州市第一人民医院2017年1月至2020年3月检测的206份NSCLC和200份健康对照人群的血清样本,随机分为训练集(50例NSCLC和50例健康对照)和验证集(156例NSCLC和150例健康对照)。从NSCLC和健康对照的血清样本中分离外泌体,进行外泌体RNA深度测序以检测差异表达的外泌体LncRNA,然后利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析在训练集和验证集队列中表达失调最显著的外泌体LncRNA PCAT1(exoPCAT1),采用受试者工作特征(ROC)曲线分析检测外泌体生物标志物的诊断能力。结果 共发现781个外泌体LncRNA在NSCLC和健康对照组血清样本之间差异表达(变化倍数> 1.5,P<0.05)。在训练集中,利用qRT-PCR证实exoPCAT1在NSCLC血清样本中较健康对照组过表达[2.24 (1.45,3.44) vs 0.92(0.57,1.30),Z=5.667,P<0.05]。在验证集中,NSCLC组exoPCAT1相对表达量亦高于健康对照组[2.09(1.32,3.18)vs0.84(0.56,1.41),Z=10.112,P<0.05]。exoPCAT1诊断NSCLC的曲线下面积(AUC)为0.838(95%CI0.795~0.880)。对于早期(Ⅰ~Ⅱ期)或者血清癌胚抗原正常(<5 ng/ml)的NSCLC患者,exoPCAT1也有较高的诊断价值,AUC分别为0.789(95%CI0.737~0.841)和0.728(95%CI0.661~0.795)。另外,血清exoPCAT1表达与疾病进展有关高表达(> 2.09)者TNMⅢ~Ⅳ期、T1~T2分期及淋巴结转移阳性的比例更高(均P <0.05)。结论 血清外泌体LncRNA PCAT1可作为一种新的液体活检”生物标志物并可用于早期NSCLC的诊断。

血清外泌体中lncRNA SOX21-AS1的表达在宫颈癌诊断中的临床价值

目的检测血清外泌体中SOX21-AS1的表达水平,评价其在宫颈癌中的诊断价值。方法选取130例宫颈癌患者作为观察组,包括宫颈鳞癌患者98例(高分化鳞癌30例,中分化鳞癌41例,低分化鳞癌27例)、宫颈腺癌26例、腺鳞癌6例。选取同期健康体检女性50例作为对照组。采用低温差速离心法提取外泌体,qRT-PCR法检测所有患者血清及血清外泌体SOX21-AS1的水平。结果宫颈癌患者血清中SOX21-AS1、外泌体中SOX21-AS1水平,均较健康对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌患者血清中与血清外泌体的SOX21-AS1水平,差异无统计学意义(P>0.05)。血清外泌体中SOX21-AS1水平的ROC预测AUC(0.9543),高于血清中SOX21-AS1水平的ROC预测AUC(0.9267),差异有统计学意义(P<0.05)。结论血清外泌体中的SOX21-AS1水平可以作为宫颈癌临床诊断的生物标志物。

上皮性卵巢癌患者血清外泌体miR-200c与组织NRP1表达、辅助化疗反应及预后的关系

目的:探讨上皮性卵巢癌(EOC)患者血清外泌体微小RNA(miR)-200c与组织神经纤毛蛋白1(NRP1)表达、化疗反应及预后的关系。方法:纳入2018年2月至2022年10月期间在本院接受初级减瘤手术和辅助化疗的135例EOC患者,另外纳入30例良性肿瘤患者作为对照。术前3 d采集患者血清样本,提取并纯化血清外泌体,通过实时荧光定量PCR法检测血清外泌体miR-200c表达水平。术中收集135例EOC癌组织、48例癌旁正常组织和30例良性肿瘤组织样本,通过免疫组织化学法评估组织NRP1蛋白表达。118例患者术后完成至少6个疗程的标准化疗方案,化疗完成后>6个月无复发视为化疗敏感。化疗耐药定义为原发性化疗难治性患者或化疗完成后≤6个月复发。结果:EOC组织中NRP1蛋白阳性表达率高于癌旁正常卵巢组织和良性肿瘤组织(P<0.001)。与良性肿瘤患者相比,EOC患者血清外泌体miR-200c表达水平显著降低(P<0.001)。血清外泌体miR-200c水平可良好地区分EOC患者和良性肿瘤患者,ROC曲线下面积(AUC)为0.955(95%CI 0.921~0.989)。EOC患者血清外泌体miR-200c水平与组织NRP1表达呈负相关(P<0.001)。血清外泌体miR-200c表达水平在化疗耐药组患者中更低(P<0.001),其预测EOC患者化疗反应的AUC为0.846(95%CI 0.769~0.924)。Cox回归和Kaplan-Meier预后分析显示,血清外泌体miR-200c低表达是导致EOC患者更短总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)的独立危险因素(P<0.05)。结论:血清外泌体miR-200c低表达与组织NRP1高表达、化疗耐药及预后不良有关,有希望作为术前预测EOC化疗反应和预后的生物标志物。

胃癌患者癌组织和血清外泌体中LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达及其临床意义

目的观察胃癌患者癌组织和血清外泌体中LncRNA结肠癌相关转录因子1(CCAT1)、微小核糖核酸-140-3p(miR-140-3p)表达情况并分析其临床意义。方法选取93例行胃癌根治术的胃癌患者为胃癌组,47例胃部良性病变患者为良性病变组,47例健康体检者为健康对照组。采集所有研究对象静脉血,提取血清外泌体,于胃癌患者行胃癌根治术过程中留取患者肿瘤组织样本及癌旁组织样本,采用RT-qPCR法检测血清外泌体及胃癌、癌旁组织中的LncRNA CCAT1、miR-140-3p。对胃癌患者随访5年,记录患者生存时间并计算5年生存率。采用Pearson相关分析法分析患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1与miR-140-3p的相关性;比较不同病理特征胃癌患者癌组织及血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达,以胃癌患者癌组织LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达的平均值为界限,将患者分为高、低LncRNA CCAT1、miR-140-3p者,采用K-M生存曲线比较高、低LncRNA CCAT1、miR-140-3p患者5年总生存率;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p对胃癌的诊断价值。结果患者胃癌组织LncRNA CCAT1表达高于癌旁组织,miR-140-3p表达低于癌旁组织(P均<0.05)。血清外泌体LncRNA CCAT1表达健康对照组<良性病变组<胃癌组,miR-140-3p表达健康对照组>良性病变组>胃癌组(P均<0.05)。Pearson相关分析显示,胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1表达与miR-140-3p表达均呈负相关(r分别为-0.726、-0.639,P均<0.05)。不同肿瘤分化程度、浸润深度、临床分期及淋巴结转移情况的胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达比较差异具有统计学意义(P均<0.05)。癌组织及血清外泌体LncRNA CCAT1高表达的胃癌患者5年总生存率低于LncRNA CCAT1低表达患者,miR-140-3p高表达的胃癌患者5年总生存率高于miR-140-3p低表达患者(P均<0.01)。ROC分析结果显示,血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p预测胃癌的曲线下面积(AUC)分别为0.712、0.766,两者联合诊断胃癌的AUC为0.845。结论胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1表达上调、miR-140-3p表达下调,其表达与患者肿瘤分化程度、浸润深度、临床分期及淋巴结转移情况及预后有关,血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p联合对胃癌具有较高的诊断价值。