大鼠血清淀粉样物质P(SAP)基因的克隆及重组腺病毒制备

目的:制备能够表达大鼠血清淀粉样物质P(Serum amyloid P component,SAP)的重组腺病毒。方法:采用RT-PCR扩增的方法获取大鼠SAP,并将该基因采用定向克隆的方法克隆进入穿梭质粒pAdTrace-TO4中,进一步采用同源重组的方法将该质粒和腺病毒骨架质粒Adeasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,然后用脂质体介导的方法导入包装细胞HEK293中,产生表达目的基因的重组腺病毒,扩增病毒后用倍比稀释法测定其滴度。结果:通过PCR技术从重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒中扩增出700bp左右插入片段,测序结果和基因库中的基因序列一致。扩增后的重组腺病毒滴度为2.8×108pfu/ml。结论:成功构建了携带SAP基因的重组腺病毒载体Adeasy-1-SAP,为探讨SAP对肺纤维化的作用及其机制打下基础。

主动脉夹层患者主动脉壁中血清淀粉样P物质的表达变化及其潜在临床意义

目的探讨血清淀粉样P物质(SAP)在主动脉夹层患者主动脉壁组织中的表达变化及其潜在的临床意义。方法收集2020年1月至2021年12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院心脏大血管外科明确诊断为Stanford A型主动脉夹层(TAAD)患者主动脉壁标本60例(夹层组),以及心脏移植供体的主动脉壁标本30例(对照组)。用苏木素-伊红(HE)染色和弹性纤维(EVG)染色的方法分析两组主动脉壁组织结构的差异。进一步通过蛋白质免疫印迹(WB),免疫荧光(IF)和免疫组化(IHC)检测SAP在主动脉壁组织中的表达水平及亚细胞定位。结果HE和EVG染色结果显示,与对照组相比,夹层组主动脉平滑肌细胞排列紊乱、弹性纤维断裂且减少。蛋白质免疫印迹、免疫荧光及免疫组化实验显示,与对照组对比,SAP蛋白表达水平在夹层组主动脉壁组织中显著降低(P<0.05),且免疫荧光染色显示SAP蛋白主要定位于细胞质和细胞外基质中。结论与对照组相比,主动脉夹层患者的主动脉壁组织中SAP蛋白水平降低,提示SAP蛋白可能与主动脉夹层的发生发展相关。

广西巴马小型猪血清淀粉样P物质基因真核载体构建及细胞转染

血清淀粉样P物质(Serum Amyloid Pcomponent,SAP)是一种在进化上高度保守的血清糖蛋白,它可与各种类型的原纤维结合,在免疫应答和炎症反应等多种免疫疾病中发挥作用。以广西巴马小型猪肝组织总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增出相应cDNA片段,连接到克隆载体pMD18-T上进行检测,测序结果为675 bp,与GenBank所提供相关序列同源性为100%,并成功构建pEGFP-N1-SAP重组真核表达载体,利用脂质体(Lipofectamine 2000)介导法将重组质粒导入到NIH-3T3细胞中培养,经转染24 h后,置于倒置荧光显微镜下观察,发现含有重组质粒的NIH-3T3细胞中表达出绿色荧光,为进一步研究SAP基因的功能特点及在试验动物相关疾病模型的应用提供条件。

血清淀粉样P物质在EV71感染小鼠肺和脑表达及其意义初探

目的探讨2周龄BALB/c小鼠在EV71感染后,不同分期肺和脑组织中血清淀粉样P物质(SAP)表达水平。方法 2周龄BALB/c小鼠按笼号分组,实验组35只,对照组29只。实验组予1×10~7TCID50·m L^(-1)的EV71病毒液0.1 mL腹腔注射,对照组腹腔注射等容量PBS液。观察小鼠的活动状态、皮疹、反应性、毛色、肢体活动及瘫痪情况等,依据实验组感染症状分为5期:精神反应期(建模后第2天)、部分瘫痪期(第3天)、全身瘫痪期(第3天)、死亡(第3~4天)和恢复期(第10天仍存活)。分别于5个分期称重实验组和对照组小鼠后处死,采集肺和脑组织以ELISA法测定SAP水平,分析不同分期SAP水平变化趋势。结果 1实验组建模后第2天均出现精神萎靡、活动减少,第3天部分小鼠出现肢体运动不协调、部分肢体瘫痪,甚至全身瘫痪至死亡,提示EV71感染小鼠模型建立成功。2建模后实验组精神反应期和对照组的体重差值差异无统计学意义,在部分瘫痪期、全身瘫痪期、死亡期和恢复期,两组体重差值的差异均有统计学意义。3实验组肺和脑组织中SAP水平在5个分期表达量均与对照组差异有统计学意义(P<0.05),实验组脑组织SAP水平是对照组的2~9倍,肺组织SAP水平是对照组的1.5~8倍。实验组部分瘫痪期、全身瘫痪期和死亡期脑组织SAP水平均显著高于精神反应期(P<0.05),肺组织SAP水平与精神反应期差异无统计学意义;脑和肺组织恢复期SAP水平均较精神反应期显著下降,但高于对照组水平。结论 SAP在EV71感染后小鼠的脑和肺组织中高表达,可能作为EV71感染后病情严重程度及预后判断的指标。

孕妇血清淀粉样P物质作为神经管缺陷产前标志物的研究

目的验证血清淀粉样P物质(SAP)在正常孕妇和有神经管缺陷患儿的孕妇血清中的表达情况,探讨其作为神经管缺陷产前诊断标志物的可能。方法于清晨空腹抽取病例组(12例胎儿患神经管缺陷的孕妇)和对照组(12例胎儿正常的孕妇)外周静脉血5 mL后静置离心,抽取上层血清,用Western blotting方法检测SAP表达水平,并计算受试者操作特征(ROC)曲线,评估SAP诊断神经管缺陷的价值。结果在妊娠12~19周、21~28周时,病例组孕妇血清中SAP表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线下面积(AUC)=0.770 8(95%CI:0.573 9~0.967 8,P<0.05)。当敏感度为83.33%时,其特异度为66.67%。结论胎儿神经管缺陷的孕妇血清中SAP表达显著降低,提示SAP有作为神经管缺陷的产前诊断标志物的潜在可能。

血清淀粉样P物质对细胞炎症反应以及氧化应激的影响及机制

目的观察不同浓度的血清淀粉样P物质(SAP)对炎症免疫及氧化应激的影响,并探讨其可能的机制。方法将RAW264.7细胞分成对照组、SAP(1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L)组,不同浓度刺激24 h后,流式细胞术测细胞间黏附分子1(ICAM-1)、Fcγ受体表达量,RT-PCR或ELISA检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)及ICAM-1的表达。Western blot检测炎症相关脾酪氨酸蛋白激酶(Syk)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p ERK1/2)的表达。结果 SAP与RAW264.7细胞共同孵育24 h后,SAP作用无论在基因表达水平还是在蛋白表达水平,均可促进炎症因子IL-1β、TNF-α、ICAM-1和活性氮NO的分泌(P<0.05),且随浓度的增加而增加;机制研究发现SAP对细胞Fcγ受体、p ERK1/2的表达无明显影响,但SAP可剂量依赖增加Fcγ受体下游通路蛋白Syk的表达量(P<0.001)。结论 SAP与Fcγ受体结合后,可增加Syk的表达,增加炎症免疫和氧化应激反应。

孕妇胎儿神经管缺陷易感性与MTHFR基因C667T位点突变、TYMS基因rs3819102位点突变及血清SAP水平的关系

目的研究孕妇胎儿神经管缺陷易感性与5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C667T位点突变、胸苷酸合成酶(TYMS)基因rs3819102位点突变及血清淀粉样P物质(SAP)水平的关系。方法前瞻性选择2017年12月至2019年12月在四川省雅安市人民医院产检的159例胎儿神经管缺陷的孕妇为观察组,159例胎儿健康的孕妇为对照组,采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测并比较两组血清SAP水平,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RLFP)法对MTHFR基因C667T位点、TYMS基因rs3819102位点多态性进行检测分析,比较两组各位点的基因型和等位基因分布频率,采用Spearman相关性分析MTHFR基因C667T位点突变、TYMS基因rs3819102位点突变及血清SAP水平与孕妇胎儿神经管缺陷的相关性,采用Logistic回归分析孕妇胎儿神经管缺陷的危险因素。结果观察组血清SAP水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组MTHFR基因C667T位点的CC、CT、TT基因型频率及T、C等位基因频率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);观察组TYMS基因rs3819102位点的AA、GG、AG基因型频率及A、G等位基因频率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);血清SAP水平与孕妇胎儿神经管缺陷呈负相关关系(r=-0.647,P<0.05);MTHFR基因C667T位点TT基因型频率及T等位基因频率与孕妇胎儿神经管缺陷呈正相关关系(r=0.205,P<0.05);TYMS基因rs3819102位点的GG基因型频率及G等位基因频率与孕妇胎儿神经管缺陷呈正相关关系(r=0.204,P<0.05);血清SAP低水平、MTHFR基因C667T位点T等位基因突变、TYMS基因rs3819102位点G等位基因突变是孕妇胎儿神经管缺陷的危险因素。结论血清SAP低水平、MTHFR基因C667T位点T等位基因突变、TYMS基因rs3819102位点G等位基因突变可能增加孕妇胎儿神经管缺陷易感性。

SAP水平对脑白质高信号患者认知功能的影响

目的探讨血清淀粉样P物质(SAP)水平对脑白质高信号(WMH)患者认知功能的影响。方法根据纳入及排除标准,通过CT或磁共振成像诊断为脑白质变性的患者297例为观察组。同时设立健康人群做对照组60例。通过Fazekas评分将脑白质变性患者分为轻度(0~2分)、中度(3~4分)及重度(5~6分),再比较三组间同型半胱氨酸(Hcy)、SAP水平、基质金属蛋白酶(MMP)-9、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)等水平。再根据脑白质变性评分将血清SAP分为轻度(50~70μg/ml,59例)、中度(70~90μg/ml,163例)及重度(90~110μg/ml,75例),将三组间利用蒙特利尔评估量表(MoCA)评估认知功能,词语流畅性测验(VFT)评价患者语言流畅度,画钟测验(CDT)、P300及MMSE检测患者认知功能障碍,日常生活活动能力(ADL)测试评价患者ADL。结果与对照组比较,观察组血清SAP水平明显升高(P<0.001);根据Fazekas评分,随着脑白质变性严重程度的增加,SAP、Hcy、hs-CRP及MMP-9水平逐级增高,其中SAP中度组较轻度组更高(t=16.235,P<0.001),重度组比中度组更高(t=17.301,P<0.001);Hcy中度组较轻度组更高(t=7.351,P<0.001),重度组比中度组更高(t=8.296,P<0.001);MMP-9中度组较轻度组更高(t=22.375,P<0.001),重度组比中度组更高(t=27.569,P<0.001)。根据MoCA评估认知功能及VFT、CDT、P300、MMSE评分也随着SAP水平的增加而减少,组间差异具有统计学意义(P<0.001);ADL评分也随SAP水平的增加而减少,但SAP中度与轻度组间差异无统计学意义(t=14.241,P=0.493),重度与轻度差异有统计学意义(t=17.336,P<0.001)。结论SAP水平与脑白质变性程度存在一定关系,随着脑白质变性严重程度的增加血清SAP水平也增加;关于患者认知功能评分,随着SAP水平的增加,认知功能随之下降。

外周血uE3与ApPrx2和SAP在胎儿神经管畸形早期筛查中的价值及意义

目的探讨外周血游离雌三醇(uE3)、过氧化物氧化还原酶2(Ap Prx2)、淀粉样P物质(SAP)在胎儿神经管畸形(NTD)早期筛查中的价值及意义。方法选取2016年9月-2019年10月3988例于河北省承德市妇幼保健医院接受规律产检的孕妇作为研究对象进行前瞻性研究,根据是否发生NTD分为NTD组(n=31)、无NTD组(n=3957)。统计NTD分布情况,比较两组一般资料、外周血uE3、Ap Prx2、SAP水平,分析NTD的相关影响因素及外周血uE3、Ap Prx2、SAP筛查NTD的效能,并比较各指标高低危患者NTD发生率。结果3988例规律产检的孕妇中NTD检出率为0.78%。NTD组孕期发热、孕期服药情况与无NTD组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。NTD组孕11~14周、15~17周、18~20周外周血uE3、SAP低于无NTD组,Ap Prx2高于无NTD组(P<0.05)。孕期发热、孕期服药、孕11~14周、15~17周、18~20周uE3、SAP降低,Ap Prx2是NTD发生的独立危险因素(P<0.001)。18~20周时,uE3筛查NTD的AUC最大,为0.855,敏感度、特异度分别为80.65%、81.44%。18~20周外周血uE3、Ap Prx2、SAP高危患者NTD发生率均高于低危患者(P<0.05)。结论外周血uE3、Ap Prx2、SAP在胎儿NTD早期筛查中具有一定价值,能辅助临床评估胎儿NTD发生风险。