广东省深圳社区获得性肺炎患儿肺炎链球菌的血清群/型的分布及其耐药性

目的通过了解广东省深圳地区社区获得性肺炎患儿肺炎链球菌的血清群/型的分布,几种疫苗的覆盖情况及其对8种抗菌药物的耐药性,评估几种疫苗在本地区预防肺炎链球菌的价值,以及为临床合理应用抗生素提供参考。方法选择2006年2月—2007年2月广东省深圳地区社区获得性肺炎患儿分离的肺炎链球菌,进行血清分型,E试验法检测该菌对8种抗菌药物的耐药情况。结果 1011例患儿中分离出肺炎链球菌90株,分离率为8.9%。血清型分布以19F最常见(62.2%,56/90),其次为23F(15.6%,14/90)、6B(10.0%,9/90)、4(6.7%,6/90),7价疫苗覆盖率为94.4%。而9、10和11价疫苗所包含的血清型均未分离到。13价疫苗的覆盖率(97.8%)较7价疫苗无明显升高(χ2=1.34,P>0.05)。7价疫苗所含血清型的肺炎链球菌株中,青霉素耐药率为14.1%,所有分离的肺炎链球菌青霉素的耐药率为13.3%,对万古霉素100%敏感,氧氟沙星耐药率为0,阿莫西林的耐药率为2.2%。未出现耐亚胺培南菌株,但11.1%的菌株处于中介。对红霉素的耐药率高达98.9%,头孢呋辛的耐药率也达到64.4%,头孢曲松的耐药率为4.4%。结论广东省深圳地区社区获得性肺炎患儿肺炎链球菌的血清群/型的分布,以19F、23F、6B、4常见,7价疫苗覆盖率为94.4%。对万古霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、亚胺培南敏感性高,青霉素、红霉素和头孢呋辛敏感率低。

鸭源血清4型Ⅰ亚群禽腺病毒Hexon蛋白的原核表达与初步应用

为了获得鸭源血清4型禽腺病毒(FAdV-4)重组Hexon蛋白,并掌握重组蛋白的免疫学活性和应用前景,试验采用PCR方法、原核表达技术、Western-blot检测和间接ELISA方法对鸭源FAdV-4 Hexon蛋白的主要抗原区域进行截短表达、鉴定与初步应用研究。结果表明:PCR方法扩增得到大小为1 011 bp的FAdV-4 Hexon主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白;重组蛋白变性纯化后进行Western-blot检测,其可与FAdV-4阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫学活性;以纯化蛋白为包被抗原,初步建立检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法,用该方法进行检测,FAdV-4灭活疫苗免疫鸭场的免疫合格率为96.46%,FAdV-4感染鸭场的阳性感染率为99.46%,无FAdV-4免疫史和感染史鸭场的阳性感染率为0。说明试验获得了具有良好生物学活性的FAdV-4 Hexon重组蛋白。

Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为储备禽腺病毒病疫情防控技术,应用DNAStar软件分析GenBank中Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)全基因序列,选取Hexon基因的保守区域设计合成1对PCR引物和1条TaqMan探针,建立FAdV-4FQ-PCR检测方法,得到相应的标准曲线,并应用该方法对临床病例和人工感染动物进行FAdV-4核酸检测。结果表明,建立的FAdV-4FQ-PCR方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性和临床应用性。

禽Ⅰ群腺病毒血清1型株灭活疫苗的研制

优化病毒的增殖条件,获得108.14 TCID50/mL,病毒粒子数为108.74 copies/mL的FAV-1抗原液,制备禽I群腺病毒血清1型(FAV-1)油乳剂灭活苗。比较甲醛及β-丙内酯的灭活效果,并进行疫苗成分最佳配比的优化,最后确认HLB 7.0,乳化剂含量10%,油水比为4∶1的比例稳定性最好、免疫效果最佳。疫苗免疫抗体水平的监测结果表明接种后第4周抗体水平达到最高峰,并在接种后第8周时仍具有较高抗体水平。攻毒试验结果显示,该疫苗对免疫组的保护率为100%,能完全抵抗病毒攻击。田间试验表明该疫苗达到预期免疫抗体水平,在接种后4个月保持高效价,到6个月时保持中等水平。本研究所研制疫苗免疫效果好,保存期长,安全性高。

血清1型Ⅰ群禽腺病毒Fiber-2蛋白的表达及其中和作用研究

为研究血清1型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-1)的Fiber-2蛋白对FAdV-1在细胞水平上的中和作用,研究根据FAdV-1亚型Fiber-2基因序列设计引物,进行Fiber-2全基因序列PCR扩增并构建重组质粒,转入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫SPF鸡制备抗血清,通过鸡LMH细胞研究Fiber-2蛋白抗血清对FAdV-1感染的中和作用。结果显示,FAdV-1 Fiber-2基因扩增产物大小为1 233 bp,构建了pCold-FAdV-1-Fiber-2重组质粒,表达的FAdV-1 Fiber-2蛋白分子量大小为105 ku;FAdV-1 Fiber-2蛋白的抗血清孵育LMH细胞后,与阳性对照组相同第4天细胞出现病变,而阴性对照组细胞均无病变。结果表明,FAdV-1 Fiber-2蛋白抗血清在体外试验中不能中和本血清型病毒的感染,FAdV-1 Fiber-2蛋白作为亚单位疫苗的研究存在风险。

禽腺病毒Ⅰ群血清4型山西株的分离鉴定及致病性分析

为了研究山西地区疑似心包积液综合征流行情况,试验对患病鸡进行腺病毒分离鉴定并分析其致病性,采用PCR鉴定、同源性和系统进化树分析、同源建模分析、毒力试验和动物回归试验等方法对疑似禽腺病毒Ⅰ群血清4型病料进行研究。结果表明:该禽腺病毒Ⅰ群血清4型毒株hexon基因扩增出长度为2 889 bp的片段,初步确定分离毒株为禽腺病毒Ⅰ群血清4型毒株,命名为SX/G/2019毒株;相对于其他禽腺病毒Ⅰ群血清4型毒株,hexon蛋白中有16个氨基酸发生突变,同源建模分析与模板2iny.1.A的hexon蛋白序列可信度和相似度分别为79.44%和0.55;该禽腺病毒Ⅰ群血清4型毒株的鸡胚半数致死量(ELD50)为1×10^-4/0.2 mL、鸡胚半数感染量(EID50)为1×10^-5/0.2 mL、病毒致死鸡胚的平均时间(MDT)为157 h;1日龄雏鸡脑内接种分离毒株1×104 EID50后死亡率为100%;42日龄雏鸡静脉接种分离毒株1×10^5 EID50、1×10^4 EID50、1×10^3 EID50后死亡率分别为100%、75%、55%;脑内接种致病指数(ICPI)为1.75,静脉接种致病指数(IVPI)为2.34,剖检可见典型的心包积液综合征病变特性。说明山西本地禽腺病毒Ⅰ群血清4型SX/G/2019毒株与近年来分离的国内毒株比较,其对鸡群致病性较强,能产生典型的心包积液综合征症状。

血清4型Ⅰ群禽腺病毒四个主要结构蛋白的生物信息学分析

为了了解血清4型Ⅰ群禽腺病毒(serotype 4 of groupⅠFowl adenovirus)分离株RZ140718(RZ株)的hexon、penton、fiber-1和fiber-2四个主要结构蛋白的遗传进化、二级结构及抗原表位等生物学信息,试验在对四个蛋白基因扩增测序基础上,应用Megalign、MEGA 5.1软件进行氨基酸序列分析并构建系统发育进化树,应用ProtParam、SignalP和SOPMA软件分析理化性质和二级结构,应用BepiPred、ABCpred、IEDB和DNAStar软件综合预测B细胞抗原表位,应用NetMHCpan4.0和NetMHCⅡpan3.2软件预测T细胞抗原表位。结果表明:从RZ株中PCR扩增出hexon、penton、fiber-1和fiber-2这四个蛋白的基因;RZ株的hexon和penton蛋白与GenBank中12个血清型参考株的同源性较高,fiber-1和fiber-2蛋白与4型和10型参考株的同源性较高;RZ株的四个蛋白与GenBank中其他4型中国分离株均位于同一分支上;四个蛋白均为酸性亲水蛋白,无信号肽,均以无规卷曲为主;从四个蛋白中分别得到22,11,11,10个潜在的线性B细胞抗原表位,4,2,4,2个潜在的CTL细胞抗原表位,2,1,1,0个潜在的Th细胞抗原表位。说明hexon蛋白具有较多的潜在优势抗原表位,可用于后续表位疫苗的开发研究。

鸡Ⅰ群禽腺病毒血清4型油乳剂灭活疫苗的研制

为研制鸡Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)油乳剂灭活疫苗,试验采用鸡肝癌细胞(LMH)扩增FAdV-4,测定FAdV-4最佳灭活条件和疫苗最佳油水比,研制了FAdV-4油乳剂灭活苗。按《中华人民共和国兽药典》进行疫苗质量、安全性和临床效力检验。结果显示:LMH细胞接种FAdV-4 72h后其毒力最高,TCID50=10-7.78/0.1mL;终浓度0.15%的甲醛溶液37℃24h可灭活FAdV-4;油水比为2∶1的疫苗性状最稳定,质量和安全性检验均合格;疫苗最小免疫剂量为0.4 mL/只;抗体水平在免疫后第2周开始上升,第4周达到最高,而后缓慢下降。对疫苗免疫鸡14 d后注射0.2 mL FAdV-4病毒液(含10-5.78TCID50/0.1 mL),经14 d观察可见鸡全部存活,剖检后无病理变化且攻毒后第3、5、7、10、14天PCR检测均为阴性,临床保护率为100%。研究提示:LMH细胞可有效提高FAdV-4毒价,通过优化FAdV-4灭活条件和疫苗油水比,所研制的疫苗安全性高,保存期长,能有效预防FAdV-4感染,为鸡心包积液综合征防控提供参考。

102株侵袭性肺炎链球菌血清型分布特征及耐药谱分析

目的了解侵袭性肺炎链球菌菌株血清群/型分布特征和菌株耐药性情况。方法选用本科室保存的102株侵袭性肺炎链球菌菌株(来自内蒙古、宁夏、四川及辽宁)。合成23种肺炎链球菌血清群/型特异性引物,采用多重PCR方法扩增进行初筛,扩增阳性的用荚膜肿胀方法进行复核验证。并选用24种抗生素进行药物敏感性实验。结果102株侵袭性肺炎链球菌共分为21个血清群,主要流行血清群/型(株数由高到低)依次为19、6、14、23、35/42、34、3、22A、15、1、18、4、5、7B、8、10A、11A、13、17A、20、33F。含10株以上的是19群、6群、14群。24种抗生素中,莫西沙星、吉米沙星、头孢曲松、多西环素未发现耐药菌株。其余20种抗生素均有耐药菌株出现。耐药率大于90%的抗生素从高到低依次为:阿奇霉素、地红霉素、克拉霉素、红霉素;耐药率小于10%的依次为:万古霉素、青霉素(注射)、利奈唑胺、美罗培南、利福平、左氧氟沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟。结论我国侵袭性肺炎链球菌分离株以19群、6群、14群最多见;23价肺炎疫苗覆盖血清群但不包含的血清型(6A、6C、6D、15C、23B、22A、18A、7B、17A)和非疫苗相关的13群、34群、35/42群也占有一定比例。治疗由肺炎链球菌引起的感染首选吉米沙星、莫西沙星、头孢曲松、多西环素等抗生素。

湖南省2000～2005年钩端螺旋体病病原学及血清学监测结果分析

目的掌握湖南省钩端螺旋体(钩体)病流行的主要血清群(型)及其分布,为钩体病防治提供科学依据。方法按全国钩体病监测实施方案,对带菌动物及病人进行病原学监测,对临床疑似钩体病人进行血清学监测。结果动物及病人所分离的70株钩体菌株分属8个血清群9个血清型,其中42株为黄疸出血群(60.00%),17株为赛罗群(24.29%);43株分离自黑线姬鼠(61.43%),17株分离自东方田鼠(24.29%)。临床疑似钩体病人血清学监测,阳性率较高的主要有黄疸出血群(12.01%)、秋季群(7.65%)、流感伤寒群(3.62%)、澳洲群(3.02%)。结论黑线姬鼠、东方田鼠是我省钩体病的主要传染源,分别携带黄疸出血群、赛罗群萨克斯可宾型及沅江型;我省钩体病流行的菌群主要是黄疸出血群,秋季群、流感伤寒群、澳洲群也占有一定的比例。

基于Fiber1基因分型的安卡拉病毒感染病例实验室检测

为确诊贵州省某养鸡场发生疑似安卡拉病毒感染的病例,实验基于安卡拉病毒Fiber1基因设计合成引物,对病料样本进行病原核酸检测和核酸测序与序列分析。结果:(1)从病例的肝脏样本中扩增出大小约1 296 bp的Fiber1基因目的片段,与预期结果相符。(2)序列测定与分析显示,扩增的Fiber1基因序列与国内分离株序列同源性高,亲缘关系近。(3)系统进化分析显示,感染病例中的安卡拉病毒流行株(命名为:GZ-LPS)与K31、MX-SHP9、ON1和河北、江苏等地的FAdV-4分离株处于同一进化分支,而与其他血清型禽腺病毒株处于不同进化分支。结论:此次疫情经实验室诊断,确定为禽腺病毒Ⅰ群C种血清4型的安卡拉病毒感染所致。

鸡源抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒单链抗体文库构建及筛选

为构建鸡源抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-4)单链抗体(scFv)文库并筛选出具有高亲和力的单链抗体。本研究从FAdV-4免疫鸡的外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法分别扩增出鸡抗体的VH和VL基因,通过Linker接头将VH和VL基因连接成scFv,将scFv基因连接至噬菌粒载体pComb3XSS中,构建单链抗体文库,通过噬菌体展示技术筛选抗FAdV-4单链抗体,并采用Phage ELISA方法检测抗体的亲和力。结果成功构建鸡源抗FAdV-4单链抗体文库,库容量为9.5×10^10 PFU/mL,通过4轮"吸附-洗脱-富集"筛选,最终鉴定出1株与FAdV-4具有较高的亲和活性的单链抗体。该研究结果为进一步研究FAdV-4抗体奠定了基础。

上海市一起蛋鸡心包积水-肝炎综合征的紧急流行病学调查

2016年7月1日,上海市某蛋鸡场62日龄蛋鸡出现发病和死亡现象,多次用抗生素治疗无效。为详细了解鸡场发病情况,分析导致疫病发生的风险因素,以便及时提出行之有效的防控建议,通过询问、现场调查和实验室诊断等方式开展了紧急流行病学调查;采用描述性流行病学方法,对疫情特点、发病风险因素进行了分析。实验室诊断结果显示,Ⅰ群血清4型腺病毒核酸阳性。调查发现:发病的前一周,该地气温波动剧烈,造成鸡只应激;鸡场生物安全体系不健全,无针对车辆和人员的消毒措施。结合临床症状、病理剖检和实验室诊断结果,确诊该鸡场暴发了心包积水-肝炎综合征,是由Ⅰ群血清4型腺病毒引起的。通过注射特异性卵黄抗体及对症治疗,对可能引起此次暴发的风险因素进行控制,疫情得到了有效控制。

FAdV-4感染对白羽肉鸡外周血细胞、血液生化指标和炎症因子的影响

采用Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)人工感染白羽肉鸡,于感染3、6、12、24 h时检测并分析FAdV-4对肉鸡外周血细胞、血液生化指标和炎症因子的影响.结果表明,3~24 h时,被FAdV-4感染的时间越长,肉鸡外周血细胞病毒载量越高.对于外周血细胞,肉鸡红细胞数与病毒载量呈负相关,感染6 h时较未攻毒组显著减少(P<0.05);白细胞数与病毒载量呈正相关,感染6 h时较未攻毒组显著增加(P<0.05);感染12、24 h时,血小板数较未攻毒组显著增加(P<0.05).对于血液生化指标,感染3~24 h时,肉鸡血液中的血糖浓度较未攻毒组显著升高(P<0.05),甘油三酯浓度较未攻毒组显著下降(P<0.05);感染6、24 h时,总蛋白含量较未攻毒组显著下降(P<0.05).对于炎症因子,感染3~24 h时,肉鸡外周血中组胺和缓激肽的含量较未攻毒组显著增加(P<0.05);感染6 h时,白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和P物质的含量与未攻毒组的差异不显著(P>0.05),感染3、12、24 h时较未攻毒组显著增加(P<0.05);人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)只在感染24 h时较未攻毒组显著增加(P<0.05).可见,感染FAdV-4后,白羽肉鸡的红细胞数、血脂浓度和总蛋白含量下降,白细胞数和血糖浓度升高,极大地促进外周血炎症因子的释放,产生了严重的炎症反应.

FADV-4环介导等温扩增-HNB可视化检测方法的建立和应用

为了建立简便、快速的FADV-4环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法,试验以FADV-4高度保守的基因序列hexon基因为靶基因设计了6条引物,对反应体系的Mg^2+浓度、Bst DNA聚合酶用量、反应温度、反应持续时间进行优化,考察了优化体系的灵敏度及特异性。同时用建立的FADV-4 LAMP及LAMP-HNB可视化的检测方法对临床模拟样品进行检测。结果表明:当Mg^2+浓度为6 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为320 U/mL、反应温度为65℃、反应时间为60 min、HNB使用浓度为120μmol/L时反应最优。LAMP最低DNA检测浓度为1.46 pg/μL,灵敏度是PCR的100倍,临床模拟样品LAMP、LAMP-HNB检测结果与普通PCR检测结果完全符合。说明所建立的FADV-4 LAMP-HNB可视化检测方法适用于临床的快速诊断。

深圳市鼠群钩端螺旋体感染状况调查

目的了解深圳市钩端螺旋体宿主动物的主要种类、密度、以及感染率和感染类型的分布情况,为钩端螺旋体病防治提供有利的科学依据。方法参照国标WS290-2008《端螺旋体病诊断标准》和广东卫生防疫90年增刊《病原微生物诊断标准》,采集动物脏器和血清进行病原学分离培养和抗体检测。结果从深圳市罗湖、福田、南山、宝安等4个区捕获的448只鼠肾中分离出一株钩端螺旋体,鉴定为爪哇群。4区的鼠血清平均抗体阳性率依次为24%、62.5%、15%、20.81%,分属10个群,其中以波摩那群最高,占44.06%、爪哇群次之。结论深圳市鼠类动物钩端螺旋体隐性感染水平较高,需继续加强监测。