家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(larval serum protein,Bombyx mori,BmLSP)的调控序列,涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区.通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法,以荧光素酶(luc)为报告基因,构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒,在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析.结果表明,含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍,暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件.上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用.此外,外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应,低浓度处理增强启动子活性,高浓度处理起抑制作用;而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.

转人血清白蛋白基因猪的表达分析

整合有人血清白蛋白基因的转基因猪 ,经琼脂糖扩散、蛋白质电泳、Western杂交等分析 ,发现 3头转基因猪不同程度地表达了人血清白蛋白 ,其中最高表达水平为 2 0 3mg/mL。

利用噬菌体抗体库筛选U251细胞血清应答基因蛋白特异抗体

利用噬菌体表面展示抗体库对不同血清处理U2 5 1细胞吸附的抗体进行差异筛选 ,筛选获得血清饥饿细胞吸附的阳性噬菌体克隆 96个和血清饥饿后恢复血清培养细胞吸附的阳性噬菌体克隆 82个。细胞免疫组化检测发现应答反应差异较大的抗体 2个 ,即血清饥饿培养细胞特异反应的抗体 1个 (11号抗体 )和血清饥饿后恢复血清培养细胞特异反应的抗体 1个 (2号抗体 ) ,其中 2号抗体在恢复血清培养细胞中的应答反应强于血清饥饿培养细胞 ,是一个血清应答基因蛋白特异抗体 ,且在血清饥饿后恢复血清培养不同时间的U2 5 1细胞中具有一定的特异性反应。该研究为寻找与细胞周期调控有关的因子奠定了基础 ,同时对肿瘤的诊断和治疗研究也有重要意义。

人血清白蛋白基因的打靶研究

为获得整合有人血清白蛋白(HSA)基因的猪胎儿成纤维细胞克隆,从猪基因组文库中杂交筛选得到猪血清白蛋白(PSA)基因全序列35kb并克隆了人血清白蛋白cDNA序列,扩增猪血清白蛋白基因5′调控序列7.2kb片段及第一内含子至第四内含子2.8kb的片段;构建了含有neo及tk正负筛选标记基因的人血清白蛋白基因打靶载体,并验证了neo基因的有效性。将线性化的打靶载体通过电击转染的方法整合到猪胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418及GANC进行细胞克隆的抗药性筛选,PCR及Southern blot鉴定抗药性细胞克隆,最终获得3个发生同源重组的细胞克隆。这为下一步进行体细胞核移植制备生产人血清白蛋白转基因猪奠定了基础。

长PCR扩增人血清白蛋白基因反应条件及体系的确立

从人的血液中提取基因组的DNA作为模板 ,通过对长PCR反应条件体系的优化 ,获得基因组中大片段的人血清白蛋白基因 (HSA)。

人重组血清白蛋白基因T载体和pET28a表达载体的构建及鉴定

目的构建重组人血清白蛋白(rHSA)表达基因的克隆载体及表达载体,为下一步的蛋白表达和构建rHSA融合基因打下基础。方法从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR方法构建cDNA-mRNA杂交链,然后用人血清白蛋白表达基因的特异引物进行PCR,PCR产物回收后与T载体连接,经过转化、质粒酶切、测序等一系列手段对插入情况和序列是否正确进行鉴定。用另一组带有酶切位点的引物和pfu酶进行PCR,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切PCR回收片段及pET28a表达载体,二者经过连接、转化、质粒酶切、测序等手段重新鉴定序列是否正确。结果插入到T载体和pET28a载体中的序列为1 830 bp的带有24个氨基酸信号肽的基因片段,此序列和GenBank中公布的rHSA序列相一致,并显示在485、750、1 685等位点可能有等位基因多态性。结论从胎盘中提取mRNA后,利用RT-PCR构建的人血清白蛋白基因序列完全正确,为下一步的工作提供了基础。

哮喘关联基因血清类黏蛋白1样蛋白3的研究进展

哮喘是一种慢性支气管炎性疾病，其发病受到遗传和环境等多种因素的共同影响，全球约有1．5亿人患病。目前，这一疾病的发病机制尚不清楚，其中从遗传角度探索哮喘易感基因是近年来的研究热点。伴随着分子生物学技术的不断革新，哮喘易感基因的研究取得了很大进步，特别是人类基因组计划以及国际人类基因组单体型图计划的完成，全基因组关联分析（GWAS）在复杂遗传性疾病的研究中得到广泛应用，这为疾病易感基因的研究提供了更大希望。

血清sST2、TNF-α和肌钙蛋白在儿童病毒性心肌炎诊断及预后评估中的价值

目的 探讨血清可溶性生长刺激表达基因2蛋白(sST2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肌钙蛋白(c TnT)在儿童病毒性心肌炎(VMC)诊断及预后评估中的价值。方法 选择2020年5月至2022年6月我院收治的VMC患儿和开展健康体检的健康儿童各72例,分别设为观察组和对照组。对观察组开展为期1年的随访,根据预后情况将其分为预后良好组(n=50)和预后不良组(n=22)。分别检测观察组、对照组和预后良好组、预后不良组的血清sST2、TNF-α、c TnT水平并予以比较,绘制受试者工作曲线(ROC)分析血清sST2、TNF-α、cTnT联合检测在儿童VMC诊断及预后评估中的价值。结果 与对照组相比较,观察组血清sST2、TNF-α、cTnT水平均较高(P<0.05);与预后良好组相比较,预后不良组血清sST2、TNF-α、c TnT水平较高(P<0.05);由ROC曲线分析,经构建风险评估模型(即血清s ST2、TNF-α、cTnT水平联合检测模式下)诊断VMC以及评估VMC患儿预后的AUC值最高,分别为0.911、0.888且灵敏度、特异度分别为91.67%、90.27%和86.36%、88.00%。结论 血清sST2、TNF-α、cTnT水平联合检测的方式在诊断VMC和评估VMC患儿预后方面具有较高的诊断效能。

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。

农业部已受理9项转基因动物研究申请

中国工程院院士曾溢滔在一次论坛演讲中透露，我国科学家在转基因动物的研究上已取得突破性进展，成功研制出乳汁中具有能够治疗血友病凝血因子IX的转基因羊，以及含有人血清蛋白基因的转基因试管牛。若一切进展顺利．在未来5-10年内，转基因新药在我国就能进入临床试验阶段，开始引领新一代医药产业。

农业部已受理9项转基因动物研究申请

中国工程院院士曾溢滔透露，我国科学家在转基因动物的研究上已取得突破性进展，成功研制出乳汁中具有能够治疗血友病凝血因子Ⅸ的转基因羊，以及含有人血清蛋白基因的转基因试管牛。若一切进展顺利，在未来5年-10年内，转基因新药在我国就能进入临床试验阶段，开始引领新一代医药产业。

我国转基因动物乳腺反应器研究获突破

科技日报2007年1月25日讯我国著名医学遗传学专家曾溢滔院士．去年11月11日在上海市第九期院士讲坛上透露．我国科学家在转基因动物乳腺生物反应器的研究方面已取得突破性进展，不仅顺利获得转基因鼠、鱼、猪、鸡等具有快速生长能力或抗病能力的动物种系．而且还成功研制出乳汁中具有能够治疗血友病凝血因子Ⅸ的转基因羊．以及含有人血清蛋白基因的转基因试管牛。

冠心病慢性心力衰竭病人住院前后血清NT-proBNP、cTnI、sST2、GDF-15变化及其影响因素

目的评估冠心病慢性心力衰竭病人住院前后血清N末端B型脑钠肽前体(NT-proBNP)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、血清可溶性生长刺激表达基因蛋白2(sST2)、血清分化生长因子-15(GDF-15)的变化情况,并评价其影响因素,为慢性心力衰竭的治疗和干预提供一些见解。方法选取山西医科大学第一医院诊断为冠心病慢性心力衰竭病人85例,住院前后分别测定NT-proBNP、cTnI、sST2及GDF-15的含量,评估其住院前后的差异,并分析这些变化的影响因素。结果与入院时相比,出院时NT-proBNP、cTnI、sST2降低(P<0.05),GDF-15降低但差异无统计学意义(P=0.06)。回归分析表明,既往心肌梗死病史和丙氨酸氨基转移酶(ALT)增高者,NT-proBNP降低明显;体质指数(BMI)增加和高龄者,NT-proBNP降低不显著;ALT增高者,cTnI降低显著;应用硝酸酯类药物者,cTnI降低不显著;舒张功能降低、高龄、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)增高者,sST2降低显著(P<0.05);使用β受体阻滞剂和强心剂、心率快、高血压、吸烟的病人,GDF-15降低明显;使用钙拮抗剂的病人,GDF-15降低不明显。结论对慢性心力衰竭进行治疗和干预时,针对不同身体状况的病人,通过生物标志物的反馈,采取相对应的措施,对优化慢性心力衰竭,特别是冠心病慢性心力衰竭病人的治疗和干预有一定帮助。

ORMDL3基因与哮喘病因关系的最新研究进展

哮喘是一种常见的气道慢性炎症性疾病,有明显的家族聚集遗传倾向,目前公认是由遗传因素和环境因素相互作用而导致的疾病。至今约有100多个候选基因证实与哮喘的发病相关,全基因组关联研究证实ORMDL3基因与哮喘强烈相关。该文将对ORMDL3基因的最新研究进展做一综述,概述其与哮喘的相关性及其可能的作用机制,ORMDL3基因多态性rs7216389与各种族、各地区人群发病,不同年龄人群发病的相关性,以及ORMDL3基因甲基化致病与环境因素的关系,为临床早期预防、发现、治疗哮喘提供新的研究位点和研究方向。

5岁以下喘息患儿ADRβ2、ORMDL3基因SNP与API的相关性研究

目的探讨肾上腺素能受体β2(ADRβ2)、血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因单核苷酸多态性(SNP)与哮喘预测指数(API)阳性婴幼儿喘息的相关性。方法将124例5岁以下喘息患儿分为API阳性组(66例)与API阴性组(58例)。选取儿童哮喘易感基因SNP位点:ADRβ2 R16G、ORMDL3 rs12603332,采用TaqMan探针法对2组患儿进行基因分型,分别比较上述SNP位点在2组间的分布差异。结果ORMDL3 rs12603332基因型在API阳性组与API阴性组之间的分布差异无统计学意义(χ^(2)=2.524,P>0.05)。ADRβ2 R16G基因型在API阳性组以AA占比最高,AG次之,GG最少;在API阴性组以AG占比最高,GG次之,AA最少;API阳性组AA占比高于API阴性组(χ^(2)=25.358,P<0.05)。ADRβ2基因型AG和GG是API阳性的保护因素,与AA比较,AG、GG是API阳性的概率分别为18.8%和6.4%。结论ADRβ2 R16G基因型分布在API阳性与阴性的5岁以下喘息患儿中存在差异,携带基因型AA的喘息患儿或更具进展为哮喘的危险性。ADRβ2或可联合API作为预测儿童哮喘的临床指标。ORMDL3 rs12603332基因型或与API预测哮喘发生无一致性。

血清sST2和TN-C对慢性阻塞性肺疾病患者发生心血管事件的预测价值

目的探讨血清可溶性生长刺激基因表达蛋白2(sST2)和腱糖蛋白-C(TN-C)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者发生心血管事件的预测价值。方法选择2019年1月—2020年5月该院收治的COPD患者84例。所有患者均定期复诊,随访1年,根据患者是否发生心血管事件分为发生组(n=24)与未发生组(n=60)。比较两组血脂、血压、肺功能指标[第1秒用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)、FEV1%pred]、超敏C反应蛋白(hs-CRP)以及TN-C、sST2水平;绘制受试者工作曲线(ROC)分析TN-C、sST2对COPD患者发生心血管事件的预测价值。结果两组血压、血脂指标比较,差异无统计学意义(P>0.05);发生组FEV1/FVC(54.79±8.21)%、FEV1%pred(58.69±10.37)%低于未发生组(66.34±11.57)、(69.12±13.45)%,hs-CRP (26.21±4.38)mg/L、TN-C (51.63±4.67)μg/L、sST2(60.54±7.65)μg/L高于未发生组(17.34±3.97)mg/L、(37.12±3.89)μg/L、(44.25±4.07)μg/L,差异有统计学意义(t=4.455、3.411、8.981、14.569、12.671,P<0.001)。绘制ROC曲线结果显示,TN-C、sST2预测COPD发生心血管事件的AUC为0.745(0.679~0.877)、0.809(0.711~0.918),预测价值均较高。结论 COPD发生心血管事件患者TN-C、sST2水平均出现异常升高,对预测心血管事件发生有较高的应用价值。

三种DNA片段在小鼠体内共整合效率的研究

以小鼠为研究对象,把人的三种DNA片断-血清白蛋白基因(HSA)、DNA修复基因hFEN1和非编码大片断CIT987SK-384D8用显微注射法分批导入小鼠受精卵雄原核,移植到假孕母鼠体内,产生的65只F1代仔鼠中,经PCR和Southernblotting检测,12只仔鼠体内含有导入的DNA段,其中HSA和CIT987SK-384D8的共整合率是1.298%,与hFEN1的共整合率是0.552%,显微注射法的总整合率是3.84%,总有效率是1.92%.从而为转基因动物的研制提供了科学的探索的一种有效的途径.

过敏性哮喘患儿外周血ORMDL3 mRNA与T细胞亚群Th1/Th2失衡的关系

目的分析过敏性哮喘患儿外周血中血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因与辅助性T细胞亚群Th1/Th2失衡的关系。方法选取2018年3月—2019年10月海南省儋州市人民医院儿科治疗过敏性哮喘患儿83例(哮喘组)为研究对象,选取同期于医院健康体检儿童76例作为健康对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测外周血ORMDL3 mRNA水平,流式细胞术检测外周血Th1、Th2表达水平,检测肺功能指标、嗜酸粒细胞(EOS)、血清免疫球蛋白E(IgE)水平。Pearson法分析外周血ORMDL3与Th1/Th2表达水平相关性,ORMDL3、Th1/Th2与肺功能指标、EOS、血清IgE水平相关性。Logistic回归分析影响过敏性哮喘的危险因素。结果哮喘组外周血ORMDL3 mRNA、Th2、FeNO、EOS、血清IgE水平均显著高于健康对照组(t=10.011、12.712、7.249、6.464、21.940,P均=0.000),Th1、Th1/Th2、达峰时间比(TPTEF/TE)、达峰容积比(VPEF/VE)水平显著低于健康对照组(t=5.484、21.151、9.796、9.372,P均=0.000);外周血ORMDL3与Th1/Th2水平呈负相关(r=-0.587,P<0.05),与TPTEF/TE、VPEF/VE亦呈负相关(r=-0.563、-0.489,P均<0.01),与FeNO、EOS、血清IgE水平呈正相关(r=0.442、0.516、0.547,P均<0.01);Th1/Th2与TPTEF/TE、VPEF/VE呈正相关(r=0.496、0.537,P均<0.01),与FeNO、EOS、血清IgE水平呈负相关(r=-0.642、-0.536、-0.518,P均<0.01);ORMDL3、血清IgE是影响过敏性哮喘发生的危险因素,Th1/Th2是影响过敏性哮喘发生的保护因素。结论过敏性哮喘患儿外周血辅助性T细胞亚群Th1/Th2处于失衡状态,且T细胞亚群Th1/Th2状态与ORMDL3水平密切相关。外周血ORMDL3、Th1/Th2在过敏性哮喘发病中有重要作用,可作为评估过敏性哮喘病情的指标。

可溶性ST2对急性心肌梗死患者短期心功能及预后的评价价值

目的:探讨血清可溶性生长刺激表达基因2蛋白(growth stimulating expression gene 2,ST2)水平对急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者短期内心功能及预后的评价价值。方法:首发AMI患者119例,根据血清sST2水平分为三组,A组(39例):sST2≤35 ng/mL,B组(45例):35 ng/mL<sST2<100.16 ng/mL,C组(35例):sST2≥100.16 ng/mL。比较三组基线资料、心功能指标以及30天内主要心血管不良事件(major adverse cardiovascular events,MACE)发生率。结果:三组hs-CRP[C组(16.35±17.24 mg/L)>B组(10.26±11.87 mg/L)>A组(7.22±8.28 mg/L)]、NT-proBNP[C组(2529.54±3353.35 pg/mL)>B组(1293.96±1400.48 pg/mL)>A组(751.31±1028.92 pg/m)]水平依次升高,左室射血分数(LVEF)[C组(52.09±9.25)%<B组(56.13±8.97)%<A组(60.08±8.61)%]依次降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。sST2水平与NT-proBNP水平呈正相关(r=0.418,P<0.001)。发生的MACE主要为新发心力衰竭,MACE发生率C组(28.6%)>B组(11.1%)>A组(7.7%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:血清sST2水平对AMI患者短期心功能及预后评价具有重要参考价值。