2型糖尿病患者血清重组人信号素3a与肾小球滤过率相关性的研究

目的探讨T2DM患者血清重组人信号素3a(Sema3a)与eGFR的相关性。方法选取2017年2月至2018年5月于蚌埠医学院第一附属医院内分泌科就诊的T2DM患者144例,根据eGFR分为≥90 ml/(min·1.73 m^(2))的单纯T2DM组(n=58)、60≤eGFR<90 ml/(min·1.73 m^(2))的轻度DKD组(MDKD,n=27)和<60 ml/(min·1.73 m^(2))的重度DKD组(SDKD,n=59),检测各组生化指标。结果SDKD、MDKD组Sema3a水平高于T2DM组[(83.32±21.42)vs(78.41±20.59)vs(67.57±12.54)ng/ml,P<0.05]。多元线性逐步回归分析显示,HbA1c、24 hUAlb、DBP是Sema3a的影响因素。Logistic回归分析显示,Sema3a、DBP、TG、HbA1c是eGFR的影响因素。结论T2DM患者Sema3a水平升高,是eGFR降低的危险因素,Sema3a可作为T2DM患者肾脏病变进展筛查指标。

基于3A组装的多拷贝基因策略优化重组水蛭素变体Ⅲ的生产

水蛭素变体Ⅲ(Hirudin varidantⅢ,Hv3)是一种从水蛭中提取的活性成分,在预防和治疗白内障方面具有潜在作用。为了制备足量Hv3用于进一步的临床前应用研究,该研究开发了一种在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中高效、稳定表达重组水蛭素变体Ⅲ(recombinant Hirudin varidantⅢ,Rhv3)的办法。首先,在C.glutamicum中构建含Ptac启动子和CspA信号肽的Rhv3分泌表达菌株,比较其在不同培养基中的表达情况。结果表明在BHI培养基中Rhv3活性最高,达到3.02×10^(3) ATU/L。为进一步提升Rhv3产量,通过核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)筛选,选用RBS1应用于Rhv3多拷贝菌株构建和表达。然后利用3A组装技术构建含不同信号肽和不同拷贝数的Rhv3分泌表达菌株进一步优化其产量。通过放大发酵培养,Rhv3产量达到1.89 g/L,活性达到10.91×10^(3) ATU/L。最后利用镍柱对Rhv3进行简单纯化,其纯度达到90%。该异源表达策略有效提高Rhv3表达量,为Rhv3的重组生产提供了一种质量可靠、低成本的表达体系。

中华大蟾蜍重组Gal-3C的原核表达、纯化及抗血清制备

半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)与肿瘤的发生发展密切相关,已有文献表明其羧基端galectin-3C(Gal-3C)具有一定的肿瘤抑制作用。为了获得Gal-3C的抗血清,实验以已有的重组质粒pGM-Gal-3为模板,利用PCR方法扩增中华大蟾蜍Gal-3C基因片段,并将其插入到表达载体pET28b上,构建中华大蟾蜍Gal-3C的原核表达载体pET28b-Gal-3C;将构建好的重组质粒pET28b-Gal-3C转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导蛋白质表达,并通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白Gal-3C的表达;以纯化的重组蛋白Gal-3C免疫小白鼠,制备鼠抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清,用Western-blot检测抗血清的特异性及其效价。结果显示成功构建了中华大蟾蜍pET28b-Gal-3C重组质粒,并诱导得到了目的蛋白的表达,而且将表达产物免疫小鼠后获得了特异性良好的抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清。以上结果为抗肿瘤药物的研究和发展奠定了基础。

草鱼重组瘦蛋白的制备及其对JAK2-STAT3信号通路的作用研究

瘦素(leptin)是主要由脂肪细胞分泌的蛋白质,具有调节机体食物摄入和能量代谢的功能。为了获得具有生物活性的瘦蛋白,本研究采用PCR技术从草鱼脑垂体中扩增出瘦素的cDNA开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,用于构建pGEX4T-1-CiLEP重组质粒(带GST标签),并将重组质粒在大肠杆菌BL21中进行原核表达。经SDS-PAGE和Western-blot检测证实,在47 kD处有与预期相对分子质量相符的融合重组瘦蛋白(即含GST标签的草鱼重组瘦蛋白)。体内注射试验结果表明,与注射GST标签蛋白相比,纯化后的融合重组瘦蛋白的注射对草鱼脑垂体和肠道的瘦素受体基因及JAK2-STAT3信号通路相关基因的表达有上调作用。以上结果为进一步研究草鱼重组瘦蛋白对JAK2-STAT3信号通路相关基因表达的影响和深入了解草鱼瘦素基因的功能及其调控机制奠定了基础。

附子理中汤对胃癌术后患者血清Pentraxin-3、CYFRA21-1、TTF-1、HE4水平的影响

目的:观察附子理中汤对胃癌术后患者血清重组穿透素-3(Pentraxin-3)、细胞角蛋白19血清片段21-1(CYFRA21-1)、甲状腺转录因子-1(TTF-1)、人附睾蛋白4(HE4)水平的影响。方法:将84例行胃癌根治术患者随机分为观察组及对照组,每组42例,对照组行常规化疗,观察组在对照组基础上给予附子理中汤口服治疗,观察两组患者近期疗效及化疗不良反应情况。比较两组患者治疗前后免疫功能及血清Pentraxin-3、CYFRA21-1、TTF-1、HE4水平的变化。结果:观察组近期总有效率(85.71%)显著高于对照组(59.52%)(P<0.05),不良反应率(23.81%)显著低于对照组(52.38%),CD4+Th17细胞比例及Pentraxin-3、CYFRA21-1、TTF-1、HE4水平显著低于对照组(P<0.05),Th17/Treg、CD4+CD25+Treg显著高于对照组(P<0.05)。结论:附子理中汤能有效降低胃癌术后患者血清Pentraxin-3、CYFRA21-1、TTF-1、HE4水平,提高患者免疫功能,减轻患者化疗不良反应,具有增效减毒的作用。

右归丸调节Leptin/JAK2/STAT3信号通路抑制肾阳虚COPD大鼠气道炎症

目的:观察右归丸对肾阳虚慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织瘦素(Leptin)/酪氨酸激酶2(JAK2)/信号转导与转录激活因子3(STAT3)信号通路的影响。方法:采用第1、14天时气管滴注脂多糖,并连续烟熏6周,期间隔3 d肌注氢化可的松,复制40只肾阳虚COPD模型SD大鼠,随机分为模型组、右归丸高剂量组(11.7 g·kg^(-1))、右归丸中剂量组(5.85 g·kg^(-1))、右归丸低剂量组(2.93 g·kg^(-1))和氨茶碱组(0.054 g·kg^(-1)),另设8只空白组SD大鼠。造模完成后,给予各组大鼠相应药物灌胃,连续给药28 d,末次给药后,取材。肺功能分析仪评估大鼠肺功能,酶联免疫法检测肺泡灌洗液白细胞介素-17A(IL-17A)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,苏木素-伊红染色观察肺组织病理变化,马松三色染色观察肺组织支气管周围蓝色胶原纤维沉积并计算肺部炎症积分,免疫荧光观察支气管Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白含量,蛋白免疫印迹法检测肺组织Leptin、IL-17A、JAK2和STAT3蛋白含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肺组织Leptin、IL-17A、JAK2、STAT3 mRNA含量。结果:与空白组比较,模型组肺功能显著降低(P<0.01),肺泡灌洗液中IL-6、IL-17A、TNF-α含量显著升高(P<0.01),肺组织炎症评分、气道上皮下胶原纤维沉积和ColⅠ、α-SMA蛋白显著升高(P<0.01),肺组织Leptin、IL-17A、JAK2和STAT3蛋白及mRNA水平均显著升高(P<0.01),JAK2、STAT3蛋白磷酸化程度显著增强(P<0.01)。与模型组比较,右归丸高、中剂量组大鼠肺功能明显升高,肺泡灌洗液中IL-6、IL-17A、TNF-α含量明显降低,炎症评分降低,胶原纤维沉积减轻,ColⅠ、α-SMA蛋白降低,Leptin、JAK2、STAT3、IL-17A蛋白降低,JAK2、STAT3磷酸化程度减弱,Leptin、JAK2、STAT3、IL-17A mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01);与氨茶碱组比较,右归丸高剂量组IL-17A、TNF-α水平明显降低,右归丸中、低剂量组IL-17A水平明显升高,右归丸低剂量组TNF-α水平明显升高,右归丸高、中剂量组肺组织支气管周围胶原纤维沉积明显降低,右归丸高、中剂量组组织支气管周围ColⅠ、α-SMA蛋白明显降低(P<0.05,P<0.01),右归丸高、中剂量组炎症评分降低,肺组织Leptin、JAK2、STAT3、IL-17A蛋白及mRNA均降低,但差异无统计学意义。结论:右归丸能抑制IL-17A改善COPD大鼠炎性反应及胶原沉积来阻止气道重塑,其机制可能与抑制Leptin/JAK2/STAT3信号通路相关。

Tec真核表达载体构建及其对细胞信号的影响

目的构建人Tec酪氨酸蛋白激酶真核表达载体;研究Tec参与肝细胞再生的可能信号途径。方法经PCR扩增、酶切、连接等基因重组技术将人Tec插入pCDNA3.1(hismycTec)真核表达载体中,并经酶切、PCR、测序鉴定;用脂质体法将构建的真核表达载体瞬时转染Hela细胞,用Western方法检测Tec蛋白是否表达。用荧光素酶报告基因系统,检测Tec是否参与HGF刺激信号途径的活化。结果构建的Tec真核表达载体使Hela细胞高表达Tec蛋白;并发现Tec在HGF介导下,对Elk信号分子活化的报告质粒中荧光素酶的表达有明显增强作用。结论构建了Tec真核表达载体,并能使HGF介导的MAPK途径活化,提示Tec可能参与HGF介导肝细胞增殖的信号调控。

附子理中汤加减对脾肾阳虚型胃癌术后化疗患者血清肿瘤标志物的影响

目的:探究附子理中汤加减对胃癌(脾肾阳虚型)术后化疗患者血清肿瘤标志物和生命质量的影响。方法:采用计算机随机数字法将132例胃癌(脾肾阳虚型)患者分为观察组和对照组各66例。对照组患者在术后予以支持对症治疗和化疗治疗(奥沙利铂+卡培他滨),观察组患者在对照组基础上予以附子理中汤加减治疗。比较两组患者近期疗效差异,观察治疗前后生活质量[Karnofsky评分(KPS)]、T细胞(CD_4^+Th17、CD_4^+CD_(25)^+Treg、Th17/Treg)、血清肿瘤标记物[细胞角蛋白19血清片段21-1(CYFRA21-1)、人附睾蛋白4(HE4)、血清重组穿透素-3(Pentraxin-3)、甲状腺转录因子-1(TTF-1)]等指标变化情况,记录不良反应发生率。结果:观察组患者治疗总有效率高于对照组(P<0.05);治疗12周后,两组患者CD_4^+Th17水平、血清CYFRA21-1、HE4、Pentraxin-3、TTF-1水平均较治疗前降低,且观察组低于对照组(P<0.05),KPS评分、CD_4^+CD_(25)^+Treg、Th17/Treg水平较治疗前升高,且观察组高于对照组(P<0.05);两组患者总不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:脾肾阳虚型胃癌患者术后化疗时服用附子理中汤加减可明显改善患者临床症状和生活质量,阻止肿瘤进展,提高细胞免疫,且安全性高。

内热针联合肌肉能量技术治疗慢性非特异性下腰痛临床观察

目的:探讨内热针松解技术联合肌肉能量技术(MET)治疗慢性非特异性下腰痛(CNSLBP)的临床疗效。方法:选择2020年6月至2021年8月CNSLBP患者100例,随机分为观察组、对照组各50例(观察组脱落3例,对照组脱落5例),对照组采用MET治疗,日1次,每周治疗5次;观察组MET治疗同对照组,并在干预第1天和第8天行MET治疗之前先进行内热针治疗,两组共干预2周。观察干预前、干预第8天及第15天、干预结束后3个月、6个月的视觉模拟评分法(VAS)评分、日本骨科协会(JOA)评估治疗评分、Oswestry功能障碍指数(ODI)。并在干预前和干预结束行实验室检查,测量血清P物质(SP)、趋化因子配体10蛋白(CXCL10)、信号素3A(Sema3A)水平;同时进行MRI检查、计算多裂肌的脂肪浸润率(FSF)。结果:观察组在干预第15天、干预结束后3个月和6个月的VAS评分低于对照组;在干预结束后3个月和6个月的JOA评分高于对照组;在干预第8天、第15天以及干预结束后3个月和6个月的ODI指数低于对照组(P<0.05)。干预结束后,观察组多裂肌FSF以及CXCL10、Sema3A水平优于对照组(P<0.05),SP与对照组比较差别无意义(P<0.05)。结论:内热针松解技术联合MET治疗CNSLBP,能有效缓解患者的疼痛和功能障碍,改善多裂肌脂肪浸润情况以及相关实验室指标,疗效显著。

血清SEMA-3B及suPAR和FABP5对中晚期肝癌患者预后评估的应用价值

目的 探讨血清信号素-3B(semaphoring-3B,SEMA-3B)、可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体(soluble urokinase-type plasminogen activator receptor,suPAR)、脂肪酸结合蛋白5(fatty acid-binding protein 5,FABP5)对中晚期肝癌患者预后的评估价值。方法 选取2016年1月至2017年12月在崇左市人民医院肿瘤科接受治疗的中晚期肝癌患者112例(肝癌组)、肝硬化患者80例(肝硬化组)。另选取崇左市人民医院体检健康者80例(对照组)。采用酶联免疫吸附法检测各组血清SEMA-3B、suPAR、FABP5水平。分析血清SEMA-3B、suPAR、FABP5与中晚期肝癌患者临床病理特征的关系。出院后随访3年,根据患者预后状况,分为预后良好组(n=72)和预后不良组(n=40)。采用多因素logistic回归分析影响肝癌患者临床预后的危险因素;采用ROC曲线,分析血清SEMA-3B、suPAR、FABP5对肝癌患者不良预后的评估价值。结果 肝癌组血清SEMA-3B水平[(216.74±39.05)μg/L]低于肝硬化组[(281.25±31.66)μg/L]、对照组[(325.11±46.82)μg/L],肝癌组血清suPAR水平[(5.83±1.71)μg/L]高于肝硬化组[(3.09±1.16)μg/L]、对照组[(1.26±0.59)μg/L],肝癌组血清FABP5水平[(11.29±2.35)μg/L]高于肝硬化组[(6.45±1.92)μg/L]、对照组[(3.17±1.40)μg/L],差异均有统计学意义(P均<0.01)。预后不良组与预后良好组比较,SEMA-3B[(172.30±25.94)μg/L vs(241.43±42.58)μg/L,t=6.950,P<0.01]、suPAR[(7.59±2.16)μg/L vs(4.85±1.29)μg/L,t=4.614,P<0.01]及FABP5[(16.47±3.08)μg/L vs(8.41±1.95)μg/L,t=5.328,P<0.01]差异有统计学意义。多因素logistic回归分析结果显示,肿瘤多发(95%CI:1.316~5.079)、血管侵犯(95%CI:1.015~3.692)、TNM分期Ⅲ期(95%CI:1.428~4.079)及术前血清SEMA-3B降低(95%CI:0.278~0.931)、血清suPAR升高(95%CI:1.115~3.825)、血清FABP5升高(95%CI:1.392~5.716)是影响肝癌患者预后不良的独立危险因素。ROC曲线显示,血清SEMA-3B、suPAR、FABP5及三者联合检测预测肝癌患者不良预后的曲线下面积分别为0.842、0.810、0.775和0.906。结论 肝癌患者血清SEMA-3B水平降低,血清suPAR、FABP5水平升高,其表达水平与肝癌患者预后不良密切相关,可以作为中晚期肝癌患者预后评估的参考指标。

Sema 3A与KIM-1在糖尿病肾病患者病情变化中的意义及与预后关系

目的分析血清信号素3A(semaphorin 3A,Sema 3A)、肾损伤分子1(kidney injury molecule 1,KIM-1)在糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)患者病情变化中的意义及与预后的关系。方法选取作者医院2018-08/2020-08月纳入的126例2型糖尿病肾病患者,按照Mogenson分期标准将DN患者分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期,于临床规范化治疗后采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测DN患者血清Sema 3A、KIM-1变化,并收集患者相关临床资料。随访1年,根据肾小球滤过率及临床表现将DN患者分为预后良好组、预后不良组。采用单因素分析法分析性别、年龄、血清Sema 3A、KIM-1等可能影响DN患者预后的危险因素。Logistic回归分析明确影响DN患者预后的危险因素。Pearson相关性分析评估血清Sema 3A、KIM-1与DN患者预后的关系。结果通过检测不同病理分期DN患者的血清Sema 3A、KIM-1发现,随着疾病进展,血清Sema 3A、KIM-1表达均有不同程度上调。126例DN患者中预后不良组共54例,预后良好组共72例。预后不良组血清Sema 3A、KIM-1水平分别均高于预后良好组,组间比较有统计学差异(203.24±36.27 vs. 156.39±28.44 ng/ml, 12.54±1.25 vs. 7.63±0.91 ng/ml,P均<0.05)。单因素分析结果显示,两组性别、年龄、体质量指数(body mass index, BMI)、病程、既往病史、入院时血压、部分生化指标水平[血清钙、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、血尿酸(blood uric acid, BUA)、血肌酐(serum creatinine, Scr)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin A;c, HbA;c)、血浆前白蛋白(prealbumin, PA)、血磷、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)]组间差异无统计学意义(P>0.05)。与预后良好组比较,预后不良组DNⅣ及Ⅴ期占比高,尿微量白蛋白(microalbumin, mALB)水平高,血清Sema 3A、KIM-1表达上调,组间比较有统计学差异(P均<0.05)。Logistic回归分析结果显示,DNⅣ及Ⅴ期占比高、mALB水平升高、Sema 3A与KIM-1表达上调是影响DN患者预后不良的危险因素。Pearson相关性分析结果显示,血清Sema 3A、KIM-1表达与DN患者预后不良均呈正相关(r=0.671,0.682;P均<0.05)。结论血清Sema 3A、KIM-1表达随着DN疾病进展呈上升趋势,检测血清Sema 3A、KIM-1指标对评估DN患者预后有重要意义。