血清2型猪链球菌全菌体蛋白的免疫蛋白质组学研究

目的寻找血清2型猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)全菌体蛋白中具有抗原活性的蛋白,为S.suis特异诊断抗原和新的疫苗侯选抗原的筛选提供线索。方法采用免疫蛋白质组学技术,分析和研究血清2型S.suisSC84菌株全菌体蛋白中能与猪链球菌病人恢复期血清发生免疫杂交的蛋白点。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对这些蛋白进行鉴定。结果S.suisSC84全菌体蛋白与3份猪链球菌病人恢复期血清进行免疫杂交反应,发现8个与IgG抗体发生阳性反应的蛋白点。经MALDI-TOF-MS鉴定,这8个蛋白分别为溶菌酶释放蛋白(MRP)、琥珀酸脱氢酶/延胡索酸还原酶黄素蛋白亚单位(SDHFp/FRDFp)、触发因子(TF)、延长因子G(EF-G)、细菌糖磷酸转移酶系统甘露糖特异ⅡAB亚单位(PTS/MAN-IIAB)、丙酮酸激酶(PK)、6-磷酸果糖激酶(6-PFK)、色氨酸-tRNA合成酶(TrpRS)。MRP定位于胞壁;TF、PTS/MAN-IIAB、PK及TrpRS定位于胞质;SDHFp/FRDFp、EF-G及6-PFK定位于胞外。并且确定了它们在S.suis05ZYH33菌株基因组的编码基因。结论在S.suisSC84全菌体蛋白中发现8个抗原活性蛋白,其中SDHFp/FRDFp、TF、EF-G、PTS、PK、6-PFK及TrpRS是在S.suis新发现的抗原性蛋白,它们作为特异诊断抗原和疫苗侯选抗原的前景有待进一步研究。

血清2型猪链球菌河南分离株毒力基因的鉴定及其cps2j全基因序列分析

为了解血清2型猪链球菌(S.suis 2)河南分离株的毒力基因型及cps2j全基因突变情况,本研究扩增S.suis 2毒力基因gdh、cps2j、mrp、ef、sly、orf2和fbps,并对S.suis 2的cps2j进行全基因序列测定和同源性分析。结果表明,gdh、cps2j、mrp、ef、sly、orf2和fbps基因在8个S.suis 2分离株中的检出率分别为100%(8/8)、100%(8/8)、62.5%(5/8)、75%(6/8)、87.5%(7/8)、100%(8/8)和100%(8/8);其中cps2j全基因核苷酸及推导的氨基酸序列与来源不同的S.suis 2分离株同源性分别达98%和97%以上,以该基因构建的系统发育树表明8株S.suis 2河南分离株与国内外不同参考株同源性高,亲缘关系密切。

血清型2型猪链球菌烯醇化酶参与猪链球菌抗吞噬作用

目的制备高纯度的猪链球菌烯醇化酶(SsEno)重组蛋白并通过抗体封闭实验评价SsEno对猪链球菌抗吞噬能力的影响,鉴定其与人纤维蛋白原(hFg)结合的活性。方法构建hisSsEno重组表达质粒,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况,镍柱亲和纯化目的蛋白并用Western blot法进行验证。用hisSsEno免疫兔制备其高滴度的抗血清并通过人全血杀伤模型评价Eno对猪链球菌抗吞噬能力的影响。采用ELISA和Far-Western blot法鉴定hisSsEno与hFg结合活性。结果成功构建了His标签蛋白原核表达质粒并获得了高纯度的hisSsEno重组表达蛋白。SsEno免疫的抗血清能显著降低强致病的猪链球菌05ZYH33在人全血中的存活能力。hisSsEno能特异地与hFg结合。结论获得了hisSsEno重组表达蛋白,通过抗体阻封和全血杀伤模型发现SsEno是猪链球菌潜在的抗吞噬因子,且hisSsEno能特异性结合hFg。

江西省人感染猪链球菌病原学和基因组特征分析

目的了解江西省2005-2020年猪链球菌菌株病原学和基因组特征,分析15年间分离株之间的关联,为人感染猪链球菌病防控提供参考依据。方法通过聚合酶链反应法扩增猪链球菌基因组上的16S rRNA、cps2j、mr、sly、ef、gapdh毒力基因,通过测定最小抑菌浓度确定菌株的耐药性,通过全基因组测序和序列比对分析菌株之间的遗传多态性。结果10株人源和8株猪源猪链球菌均为血清2型菌株,毒力基因谱不同,至少携带3种毒力基因。对阿奇霉素和四环素耐药率高达89.89%和77.78%,携带氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类及叶酸通道拮抗剂4类耐药基因。分为3个ST型,其中ST7型12株、ST1型5株、ST373型1株。全基因组序列分析显示2005年疫情菌株与四川省暴发疫情菌株同源,2006-2020年分离菌株基因组多态性大。结论江西省人感染猪链球菌病均为散发,菌株基因组多态性大,2005年疫情菌株与四川省暴发菌株相关,随后年份为多点平行传播。

山西某规模化育肥场猪链球菌血清2型诊断

山西省某规模化育肥场50日龄仔猪连续以败血症死亡,疑似链球菌感染。为了解猪链球菌血清2型的感染情况,筛选出敏感药物,将疑似链球菌感染的病猪(n=10)抗凝全血进行细菌分离、革兰氏染色、毒力基因PCR鉴定及药敏试验,为该病的临床诊疗提供新思路和用药参考。结果显示,6例全血分离出疑似革兰氏阳性链球菌的菌株,5例疑似菌经PCR扩增后初步诊断为猪链球菌血清2型。5例猪链球菌血清2型分离株对恩诺沙星、大观霉素、头孢曲松钠中度敏感,对庆大霉素、丁胺卡那霉素、替米考星、链霉素、阿莫西林均耐药。

江苏省首例人感染ST1型猪链球菌的快速检测及分子特征分析

目的对2014年江苏省一起疑似人感染猪链球菌病的病原菌进行实验室快速检测并分析其分子特征。方法采用实时荧光PCR方法对病人标本中提取的DNA进行猪链球菌血清2型特异基因检测,运用PCR方法进行猪链球菌毒力基因鉴定及多位点序列分析。结果病人标本中检测到猪链球菌种特异基因(16srRNA)和血清2型荚膜多糖编码基因(cps-2J),5种毒力基因(mrp,sly,ef,gapdh,fbps)全部阳性,多位点序列分析结果为ST1型。结论该病例的病原菌为携带5种毒力基因的ST1型猪链球菌血清2型菌株,该型别在江苏省尚属首次报道。

猪链球菌血清2型环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立快速、灵敏的猪链球菌血清2型(SS2)LAMP检测方法,根据GenBank登录的SS2特异的荚膜多糖(cps2 H)基因序列作为检测靶标,在其序列的保守区域设计LAMP引物,利用参考菌株S735基因组DNA为模板进行扩增,优化了LAMP的反应条件和反应体系,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果,利用建立的LAMP方法对SS2进行扩增,扩增产物显色呈现阳性反应,电泳出现阶梯状条带,最低检测量为0.186fg/μL模板DNA,比常规PCR高1 000倍;且与其他常见的细菌无交叉反应。结果表明,建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速和重复性强等优点,适用于猪链球菌病的实验室快速检测。

浙江省散发猪链球菌病临床分离株存在89K候选致病岛

目的对浙江省临床分离猪链球菌血清2型（SS2）菌株进行89K候选致病岛检测。方法用多种特异性引物进行PCR扩增检测，同时对89K的3个扩增片段进行测序，并结合有关资料进行生物信息学和流行病学分析。结果8株SS2菌株，均检出89K（1＆2）、89K（3＆4）、89K（5＆6）候选致病岛特异片段和种特异性16S rDNA、cps2J、mrp毒力基因，和1998年江苏省暴发疫情的菌株结果一致。ZJ0501号SS2分离株89K候选致病岛的3个PCR扩增片段序列和1998年江苏省暴发疫情的菌株有99％以上的相似性，其中编码DNA重组蛋白的序列片段和病乳链球菌及无乳链球菌有较高的同源性。结论近年来在浙江省临床分离SS2菌株中，存在89K候选致病岛片段。