血清3-磷酸甘油醛脱氢酶抗体水平在视神经脊髓炎谱系疾病中的变化及其临床意义

目的研究视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)患者血清中3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体的水平变化及其临床意义。方法收集符合纳入标准的NMOSD患者和正常对照组的血清,检测血清中GAPDH抗体水平,并分析其与NMOSD分期、分型、血清水通道蛋白4(AQP4)抗体状态和临床特点的关系。结果血清GAPDH抗体水平在NMOSD组显著高于正常对照组(P<0.05);急性期明显高于缓解期和正常对照组(均P<0.05),缓解期与正常对照组差异无统计学意义(均P>0.05)。AQP4-IgG(+)组与AQP4-IgG(-)组差异无统计学意义(P>0.05),AQP4-IgG(+)组与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),AQP4-IgG(-)组明显高于正常对照组(P<0.05)。结论NMOSD患者急性期血清GAPDH抗体水平明显升高,GAPDH抗体参与了NMOSD患者脱髓鞘的重要环节并与NMOSD的活动性密切相关;GAPDH抗体在AQP4-IgG(-)组中明显升高,说明GAPDH抗体可能在AQP4-IgG(-)的NMOSD患者中作为一种轴突自身免疫性抗原而发挥作用。

多发性硬化患者CSF3-磷酸甘油醛脱氢酶反应性抗体水平的改变及其临床意义

目的探讨多发性硬化(MS)患者CSF 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)反应性抗体水平的改变及其临床意义。方法采用ELISA法检测23例MS及17例其他炎症性神经系统疾病(OIND)、13例其他非炎症性中枢神经系统疾病(ONIND)患者的CSF GAPDH反应性抗体水平。分析MS患者CSF GAPDH反应性抗体水平与其性别、年龄和扩展残疾状况量表(EDSS)评分的关系。结果 MS组CSF GAPDH反应性抗体水平显著高于OIND组和ONIND组(P<0.01,P<0.05);男性与女性MS患者CSF GAPDH反应性抗体水平的差异无统计学意义。Spearman相关分析显示,MS患者的CSF GAPDH反应性抗体水平与其年龄、EDSS评分均无关(rs=-0.197,rs=0.327;均P>0.05)。结论 MS患者的CSF GAPDH反应性抗体水平显著升高,并且与患者的性别、年龄及病情无明显关系。

环形泰勒虫3-磷酸甘油醛脱氢酶的原核表达、多克隆抗体制备及亚细胞定位

为了研究环形泰勒虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的功能,本试验利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增环形泰勒虫GAPDH(TaGAPDH)基因,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合蛋白诱导表达,融合蛋白纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,分别用间接ELISA和Western blotting检测抗体的效价和特异性;利用激光共聚焦荧光显微镜观察TaGAPDH蛋白在环形泰勒虫裂殖体中的亚细胞定位。结果显示,克隆得到了TaGAPDH全长基因,大小为1 020bp;SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白大小约44ku,且以包涵体形式存在。制备的多克隆抗体效价高达1∶12 800,具有很高的特异性;亚细胞定位显示TaGAPDH蛋白主要分布于环形泰勒虫裂殖体细胞质内。以上结果表明本试验成功克隆表达了TaGAPDH基因,并制备了针对TaGAPDH蛋白的兔多克隆抗体,为筛选环形泰勒虫病疫苗、药物靶点及研究环形泰勒虫能量代谢奠定了基础。

蓖麻3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因克隆及表达分析

为探讨蓖麻(Ricinus communis L.) 3-磷酸甘油醛脱氢酶(G1yceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因(RcGAPDH)作为内参基因进行相关研究的可行性,从转录和翻译水平研究其组织表达谱。本研究以蓖麻雌性花为材料,扩增RcGAPDH (GenBank登录号:XM_002523449)的开放阅读框序列,并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)。酶切、测序结果表明,重组载体pET32a(+)-RcGAPDH构建成功。将pET32a(+)-RcGAPDH转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blotting验证,结果表明,IPTG可诱导一个分子量约62 kD的特异蛋白,且主要以包涵体的形式存在,优化表达条件为:0.5 mmol/L IPTG、28℃、200 r/min和诱导表达6 h。用表达蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔制备抗RcGAPDH的多克隆抗血清,用制备的多克隆抗血清进行Western blotting的结果表明,该多克隆抗血清具针对RcGAPDH的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶204 800。通过实时荧光定量RT-PCR (RT-qPCR)检测蓖麻RcGAPDH mRNA在时空一致的条件下的正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达;同时,制备多种组织匀浆蛋白,使用多克隆抗血清进行Western blotting分析,结果表明,蓖麻各组织中RcGAPDH转录水平的表达存在显著差异,RcGAPDH在雌花和雄花中的含量显著高于其他组织中的,但翻译水平的表达差异不显著,可做为在翻译水平研究蓖麻植株中其他基因表达的内参标准。

福氏志贺菌5a型M90T株GAPDH蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备高效的福氏志贺菌5a M90T3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的多克隆抗体,并对其特异性进行评价。方法提取M90T的全基因组,采用PCR法扩增M90T中的基因gapA克隆到原核表达载体pET-24中,重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,条件优化后纯化GAPDH-His融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体。Western blot法、ELISA鉴定获得的抗血清。结果成功构建了原核表达载体pET24a-gapA,通过一系列诱导条件的优化,确定可溶性条件为30℃、1 mmol/L IPTG诱导2 h。用纯化的融合蛋白GAPDH-His作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,Western blot法、ELISA证明多克隆抗体制备成功。结论成功制备了福氏志贺菌5a M90T特异性的小鼠多克隆抗体。