鸭源血清4型Ⅰ亚群禽腺病毒Hexon蛋白的原核表达与初步应用

为了获得鸭源血清4型禽腺病毒(FAdV-4)重组Hexon蛋白,并掌握重组蛋白的免疫学活性和应用前景,试验采用PCR方法、原核表达技术、Western-blot检测和间接ELISA方法对鸭源FAdV-4 Hexon蛋白的主要抗原区域进行截短表达、鉴定与初步应用研究。结果表明:PCR方法扩增得到大小为1 011 bp的FAdV-4 Hexon主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白;重组蛋白变性纯化后进行Western-blot检测,其可与FAdV-4阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫学活性;以纯化蛋白为包被抗原,初步建立检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法,用该方法进行检测,FAdV-4灭活疫苗免疫鸭场的免疫合格率为96.46%,FAdV-4感染鸭场的阳性感染率为99.46%,无FAdV-4免疫史和感染史鸭场的阳性感染率为0。说明试验获得了具有良好生物学活性的FAdV-4 Hexon重组蛋白。

Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体中和效价与攻毒保护相关性研究

为了研究Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体中和效价与攻毒保护的相关性,取3批实验室试制抗体,分别通过预防试验和紧急预防试验模型进行抗体中和效价与靶动物攻毒保护力相关性试验。预防试验:21日龄SPF鸡经颈背部皮下注射中和效价分别为1:64、1:128、1:256的蛋黄抗体,每只0.5 mL,168 h后接种Ⅰ群4型禽腺病毒检验用强毒,观察10日。紧急预防试验:先给21日龄SPF鸡接种Ⅰ群4型禽腺病毒检验用强毒,36 h后经颈背部皮下注射不同中和效价的抗体,每只0.5 mL,观察10日。结果表明:当中和效价为1:128时,攻毒保护率均达到80%以上;当中和效价为1:256时,攻毒保护率均达到90%以上。故本研究结果表明,抗体效价不低于1:128时可有效抵御Ⅰ群4型禽腺病毒的攻击。

Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为储备禽腺病毒病疫情防控技术,应用DNAStar软件分析GenBank中Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)全基因序列,选取Hexon基因的保守区域设计合成1对PCR引物和1条TaqMan探针,建立FAdV-4FQ-PCR检测方法,得到相应的标准曲线,并应用该方法对临床病例和人工感染动物进行FAdV-4核酸检测。结果表明,建立的FAdV-4FQ-PCR方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性和临床应用性。

鸡Ⅰ群禽腺病毒血清4型油乳剂灭活疫苗的研制

为研制鸡Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)油乳剂灭活疫苗,试验采用鸡肝癌细胞(LMH)扩增FAdV-4,测定FAdV-4最佳灭活条件和疫苗最佳油水比,研制了FAdV-4油乳剂灭活苗。按《中华人民共和国兽药典》进行疫苗质量、安全性和临床效力检验。结果显示:LMH细胞接种FAdV-4 72h后其毒力最高,TCID50=10-7.78/0.1mL;终浓度0.15%的甲醛溶液37℃24h可灭活FAdV-4;油水比为2∶1的疫苗性状最稳定,质量和安全性检验均合格;疫苗最小免疫剂量为0.4 mL/只;抗体水平在免疫后第2周开始上升,第4周达到最高,而后缓慢下降。对疫苗免疫鸡14 d后注射0.2 mL FAdV-4病毒液(含10-5.78TCID50/0.1 mL),经14 d观察可见鸡全部存活,剖检后无病理变化且攻毒后第3、5、7、10、14天PCR检测均为阴性,临床保护率为100%。研究提示:LMH细胞可有效提高FAdV-4毒价,通过优化FAdV-4灭活条件和疫苗油水比,所研制的疫苗安全性高,保存期长,能有效预防FAdV-4感染,为鸡心包积液综合征防控提供参考。

新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗对不同日龄雏鸡的免疫效力研究

为评估新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗的免疫效力,采用该疫苗分别免疫7、14、21日龄的SPF雏鸡和商品雏鸡,免疫后21 d采血测定新城疫病毒(NDV)HI、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)HI及禽腺病毒(FAdV)中和抗体,并用禽腺病毒(Ⅰ群,4型)强毒攻击。结果显示:免疫后各不同日龄免疫组SPF雏鸡的NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体效价分别为8.2 log2~8.5 log2、8.8 log2~9.6 log2和9.7 log2~10.3 log2,FAdV攻毒保护率均达到100%(10/10);21日龄SPF鸡免疫后3个月,试验鸡NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体分别达7.2 log2、7.8 log2和11.3 log2,FAdV攻毒保护率均为100%(10/10);不同日龄免疫组普通雏鸡NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体效价分别为6.7 log2~7.6 log2、7.9 log2~8.7 log2和9.8 log2~10.3 log2,FAdV攻毒保护率均达到100%(10/10)。表明该疫苗可对不同日龄SPF雏鸡和商品雏鸡产生良好的免疫力,对雏鸡免疫持续期达3个月。

血清4型Ⅰ群禽腺病毒四个主要结构蛋白的生物信息学分析

为了了解血清4型Ⅰ群禽腺病毒(serotype 4 of groupⅠFowl adenovirus)分离株RZ140718(RZ株)的hexon、penton、fiber-1和fiber-2四个主要结构蛋白的遗传进化、二级结构及抗原表位等生物学信息,试验在对四个蛋白基因扩增测序基础上,应用Megalign、MEGA 5.1软件进行氨基酸序列分析并构建系统发育进化树,应用ProtParam、SignalP和SOPMA软件分析理化性质和二级结构,应用BepiPred、ABCpred、IEDB和DNAStar软件综合预测B细胞抗原表位,应用NetMHCpan4.0和NetMHCⅡpan3.2软件预测T细胞抗原表位。结果表明:从RZ株中PCR扩增出hexon、penton、fiber-1和fiber-2这四个蛋白的基因;RZ株的hexon和penton蛋白与GenBank中12个血清型参考株的同源性较高,fiber-1和fiber-2蛋白与4型和10型参考株的同源性较高;RZ株的四个蛋白与GenBank中其他4型中国分离株均位于同一分支上;四个蛋白均为酸性亲水蛋白,无信号肽,均以无规卷曲为主;从四个蛋白中分别得到22,11,11,10个潜在的线性B细胞抗原表位,4,2,4,2个潜在的CTL细胞抗原表位,2,1,1,0个潜在的Th细胞抗原表位。说明hexon蛋白具有较多的潜在优势抗原表位,可用于后续表位疫苗的开发研究。

禽腺病毒Ⅰ群血清4型山西株的分离鉴定及致病性分析

为了研究山西地区疑似心包积液综合征流行情况,试验对患病鸡进行腺病毒分离鉴定并分析其致病性,采用PCR鉴定、同源性和系统进化树分析、同源建模分析、毒力试验和动物回归试验等方法对疑似禽腺病毒Ⅰ群血清4型病料进行研究。结果表明:该禽腺病毒Ⅰ群血清4型毒株hexon基因扩增出长度为2 889 bp的片段,初步确定分离毒株为禽腺病毒Ⅰ群血清4型毒株,命名为SX/G/2019毒株;相对于其他禽腺病毒Ⅰ群血清4型毒株,hexon蛋白中有16个氨基酸发生突变,同源建模分析与模板2iny.1.A的hexon蛋白序列可信度和相似度分别为79.44%和0.55;该禽腺病毒Ⅰ群血清4型毒株的鸡胚半数致死量(ELD50)为1×10^-4/0.2 mL、鸡胚半数感染量(EID50)为1×10^-5/0.2 mL、病毒致死鸡胚的平均时间(MDT)为157 h;1日龄雏鸡脑内接种分离毒株1×104 EID50后死亡率为100%;42日龄雏鸡静脉接种分离毒株1×10^5 EID50、1×10^4 EID50、1×10^3 EID50后死亡率分别为100%、75%、55%;脑内接种致病指数(ICPI)为1.75,静脉接种致病指数(IVPI)为2.34,剖检可见典型的心包积液综合征病变特性。说明山西本地禽腺病毒Ⅰ群血清4型SX/G/2019毒株与近年来分离的国内毒株比较,其对鸡群致病性较强,能产生典型的心包积液综合征症状。

Ⅰ群4型禽腺病毒DC株在LMH细胞的增殖工艺研究

为探索Ⅰ群4型禽腺病毒DC株在LMH细胞的生长特性和增殖规律,通过研究病毒接种量、收毒时间、接毒时间、温度和维持液血清浓度等病毒增殖条件,筛选、优化了病毒增殖工艺。结果表明病毒最佳的增殖条件为:在37℃条件下培养,最佳接种量为1%,接种时间为细胞传代后生长72 h,维持液血清浓度为2%,维持液中不添加0.25%胰蛋白酶,收获时间为病毒接种后72 h。LMH细胞是Ⅰ群4型禽腺病毒DC株较适合的病毒培养系统,为研制Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗提供了有利工具。

5株Ⅰ群4型禽腺病毒的分离与鉴定

对5份不同来源的临床上疑似禽腺病毒感染鸡组织处理后接种6～7日胚龄SPF鸡胚,经过LMH细胞传代,通过血凝性检测和PCR方法对细胞培养物进行鉴定。血凝性检测表明分离物不能凝集鸡红细胞,对Hexon和52K基因的序列分析显示,分离到5株病毒为Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4)。动物回归试验结果表明,5个病毒株均能致40日龄SPF鸡死亡,死亡率达80%以上,并表现与FAdV-4感染临床发病相似的症状。研究结果为探究国内FAdV-4分子流行与毒力演变以及病毒感染的预防提供了基础材料。

Ⅰ群4型禽腺病毒DC株灭活苗对流行毒株的保护力试验

为了检验Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4)DC株对几个流行毒株的保护力,使用含有DC株的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(Ⅰ群4型)(La Sota株+BX13株+BJQ902株+DC株)四联灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫接种后21 d采血测定FAdV-4中和抗体,然后分别用DC株和2015年-2017年分离的5个FAdV-4分离株(ZB2016株、ZD2015株、SC2016株、DT1-2017株和DT2-2017株)进行攻击,观察新流法腺四联苗对FAdV-4流行毒株的保护效果。结果显示,免疫组鸡FAdV-4中和抗体效价达到9.6 log2~10.1 log2,而对照组鸡中和抗体为0;免疫鸡用DC株、ZB2016株、ZD2015株、SC2016株、DT1-2017株和DT2-2017株攻毒后,免疫组鸡得到100%(10/10)保护,对照组鸡90%(9/10)~100%(10/10)发病。试验证明,用含DC株制备出的新流法腺四联苗对腺病毒的流行毒株具有较好的保护效力。

禽Ⅰ群腺病毒血清1型株灭活疫苗的研制

优化病毒的增殖条件,获得108.14 TCID50/mL,病毒粒子数为108.74 copies/mL的FAV-1抗原液,制备禽I群腺病毒血清1型(FAV-1)油乳剂灭活苗。比较甲醛及β-丙内酯的灭活效果,并进行疫苗成分最佳配比的优化,最后确认HLB 7.0,乳化剂含量10%,油水比为4∶1的比例稳定性最好、免疫效果最佳。疫苗免疫抗体水平的监测结果表明接种后第4周抗体水平达到最高峰,并在接种后第8周时仍具有较高抗体水平。攻毒试验结果显示,该疫苗对免疫组的保护率为100%,能完全抵抗病毒攻击。田间试验表明该疫苗达到预期免疫抗体水平,在接种后4个月保持高效价,到6个月时保持中等水平。本研究所研制疫苗免疫效果好,保存期长,安全性高。

血清1型Ⅰ群禽腺病毒Fiber-2蛋白的表达及其中和作用研究

为研究血清1型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-1)的Fiber-2蛋白对FAdV-1在细胞水平上的中和作用,研究根据FAdV-1亚型Fiber-2基因序列设计引物,进行Fiber-2全基因序列PCR扩增并构建重组质粒,转入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫SPF鸡制备抗血清,通过鸡LMH细胞研究Fiber-2蛋白抗血清对FAdV-1感染的中和作用。结果显示,FAdV-1 Fiber-2基因扩增产物大小为1 233 bp,构建了pCold-FAdV-1-Fiber-2重组质粒,表达的FAdV-1 Fiber-2蛋白分子量大小为105 ku;FAdV-1 Fiber-2蛋白的抗血清孵育LMH细胞后,与阳性对照组相同第4天细胞出现病变,而阴性对照组细胞均无病变。结果表明,FAdV-1 Fiber-2蛋白抗血清在体外试验中不能中和本血清型病毒的感染,FAdV-1 Fiber-2蛋白作为亚单位疫苗的研究存在风险。

Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,参考Gen Bank中已发布的禽腺病毒的六邻体基因(Hexon)序列设计两对引物,通过PCR扩增出Hexon基因的954 bp目的片段,克隆至p MD-19T载体,提取阳性质粒测定浓度,10倍系列稀释作为荧光定量PCR的标准品模板,制备标准曲线。结果显示,荧光定量PCR熔解曲线峰值单一,产蛋下降综合症病毒(EDSV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)等外源病毒均无扩增曲线出现,对标准品模板最低检出值为1.2×101拷贝/μL。对7份Ⅰ群4型禽腺病毒的细胞培养物的检出率为100%,表明建立的实时荧光定量PCR检测方法准确可行。

Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体在鸡体内的消长规律

将Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体注射到SPF鸡体内,通过测定不同时间点鸡血清的抗体效价,确定卵黄抗体在体内的消长规律。结果发现,注射后6 h即可在实验鸡体内检测到较高水平的抗体,平均中和效价达到1:82,12 h抗体水平达到高峰,平均中和效价为1:124,然后逐渐降低,到12 d抗体平均效价降至1:13。卵黄抗体注射后3、6、9、12 d,利用Ⅰ群4型禽腺病毒进行攻毒试验,结果显示,抗体注射后6 d(体内平均中和抗体为1:36)能起到完全保护作用,9 d(体内平均中和抗体为1:22)只能产生部分保护作用,12 d(体内平均中和抗体为1:13)完全起不到保护作用。

血清4型禽腺病毒山东株基因组序列的克隆及遗传演化分析

从山东某地区发生心包积液综合征的发病鸡中收集病料,按常规方法处理后接种SPF鸡胚,分离到1株病毒,经PCR和测序分析鉴定该分离株为Ⅰ群禽腺病毒、血清4型禽腺病毒,命名为FAV-SD。合成引物成功扩增病毒全基因组序列,并进行序列的测定与分析,结果表明FAVSD株全基因组大小为43752 bp,通过hexon基因同源性比对,FAV-SD与我国今年报道的禽腺病毒血清4型同源性最高;遗传进化分析结果表明,FAV-SD分离株与我国禽腺病毒血清4型流行毒株处于同一分支,而与国外禽腺病毒血清4型毒株不在同一分支,存在遗传差异,说明中国流行的血清4型禽腺病毒具有自身地域特点。该病毒株的分离鉴定为禽腺病毒疫苗的研制奠定了基础。

Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

利用纯化的 Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了 Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1% 牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测.

山东省血清4型禽腺病毒的分离鉴定

近期从山东省许多地区爆发的以心包积液为主要病变特征的发病鸡中分离到10株病毒,经PCR检测和血清型鉴定,确定为血清4型禽腺病毒。SPF鸡回归试验证实,分离到的病毒能完全复制出与临床自然发病鸡相同的症状与病变。用该病毒制备的灭活疫苗具有良好的免疫保护作用,制作的抗体也具有良好的治疗效果。

禽腺病毒血清4型fiber-2和penton蛋白亚单位疫苗初步研究及免疫效果评价

选取禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)JLJ13株的fiber-2和penton蛋白作为保护性抗原,利用SWISS-MODEL网站对fiber-2蛋白空间结构进行模拟,截取其主要功能区fiber-2-Shaft 2替代fiber-2,进行密码子优化后,将fiber-2-Shaft 2和penton蛋白基因序列克隆到pET28a(+)载体上并送至北京天一辉远生物科技有限公司进行基因合成,将合成的质粒分别命名为pET-28a-msyb-fiber-2-Shaft 2和pET-28a-msyb-penton。通过原核表达系统进行蛋白表达并使用镍柱纯化。经BCA定量后,用PBS分别将fiber-2-Shaft 2和penton蛋白质量浓度稀释至1000,500,250 mg/L,再将相同质量浓度的fiber-2-Shaft 2和penton蛋白按1∶1体积比混合后作为抗原,配伍ISCOMs佐剂,0.2 mL/只免疫30日龄SPF鸡,即高剂量组免疫fiber-2-Shaft 2和penton蛋白各100μg、中剂量组各50μg、低剂量组各25μg。一免后14 d进行二次免疫,采集二免后7,14,21 d血清检测特异性抗体和中和抗体,并在二免后21 d攻毒。结果显示,成功表达出fiber-2-Shaft 2和penton蛋白,大小分别为69,93 kDa,镍柱纯化后可获得高纯度的蛋白;二免后14 d高中低量组的中和效价依次为1280,640,640,攻毒后阴性对照组表现出明显的临床症状,2~3 d后死亡,疫苗组均未出现任何临床症状。结果表明,利用禽腺病毒血清4型JLJ13株fiber-2-Shaft 2和penton蛋白混合配伍ISCOMs佐剂制备的亚单位疫苗免疫保护效果明显。

禽腺病毒Ⅰ群血清4型的分子鉴定及其卵黄抗体的防控效果

对山东临沂某肉鸡养殖场疑似禽腺病毒感染的病鸡进行了PCR诊断,序列比对及同源性分析。结果发现,该病毒与NCBI中禽腺病毒Ⅰ群血清4型毒株的同源性在99%以上,动物回归试验能够复制出禽腺病毒的典型症状,对发病动物进行病理切片发现肝脏中有大量炎性细胞浸润,脾脏间质增大,出血。利用组织毒免疫商品蛋鸡,提取卵黄抗体分别进行该病原的预防和治疗试验,结果发现0.3 mL/只的卵黄抗体可100%保护15日龄肉鸡不发病;感染发病鸡按照0.8 mL/只和1 mL/只剂量注射卵黄抗体进行治疗,其治愈率分别为86.7%和96.7%,说明制备的卵黄抗体对禽腺病毒Ⅰ群血清4型感染具有较好的预防与治疗作用。

基于抗原蛋白Fiber-2及细胞因子佐剂的Ⅰ群4型禽腺病毒亚单位疫苗的开发

为了开发一种抗I群4型禽腺病毒(FAd V-4)的亚单位疫苗,选择I群禽腺病毒血清4型流行毒株衣壳蛋白Fiber-2作为保护性抗原蛋白。利用昆虫细胞-杆状病毒系统生产Fiber-2蛋白,通过Westernblot检测重组蛋白的表达情况,利用双向琼脂扩散法检测重组Fiber-2的免疫原性。为了增强亚单位疫苗的免疫保护效果,添加鸡源白细胞介素2(chIL-2)和鸡源γ-干扰素(ch IFN-γ)作为免疫佐剂,与重组Fiber-2单独或混合使用,制备多种形式的亚单位疫苗,并进行动物攻毒保护试验。重组蛋白的Western-blot鉴定结果显示,63 ku处出现Fiber-2蛋白目的条带;双向琼脂扩散试验结果显示,重组蛋白效价达到1∶128,表现出良好的反应原性。动物攻毒保护试验结果显示,单独使用Fiber-2免疫SPF鸡,在50 μg/只的剂量下,可为SPF鸡提供100%的保护效果,以chIL-2和chIFN-γ为免疫佐剂,与重组Fiber-2联合免疫SPF鸡,可显著增强Fiber-2在低剂量(10 μg/只)下的免疫保护效果,上述结果表明重组Fiber-2联合chIL-2和chIFN-γ细胞因子佐剂所制备的亚单位疫苗在抗I群4型禽腺病毒感染领域具有良好的应用前景。