1株血清7型副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

研究旨在确定河南省南阳市一猪场送检样品中的病原,对病例进行流行病学调查和临床症状观察,对送检病料进行细菌分离、纯化、鉴定和基因测序分析等检测。结果显示,送检病料中分离得到一株革兰氏阴性短杆菌,分离菌在常用细菌鉴别培养基上无法生长,在含有NAD的TSA培养基上呈露珠状;纯化得到的分离菌NY2020株和金黄色葡萄球菌共同培养具有"卫星现象";采用副猪嗜血杆菌16S rRNA鉴定引物和血清7型引物均能够扩增出特异性条带。序列分析表明,该分离菌NY2020株与7型副猪嗜血杆菌处于同一进化树分支。研究表明,该分离菌为血清7型副猪嗜血杆菌。

血清7型副猪嗜血杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

为了对疑似副猪嗜血杆菌感染的仔猪病例进行诊治,对病死仔猪进行了细菌分离,用16S rRNA测序、套式PCR、血清型分型PCR、基因型分型PCR等方法对分离菌株进行鉴定,并对分离菌株进行药敏试验和小鼠致病性试验。结果显示,从发病仔猪的关节液中分离得到1株革兰氏阴性菌;16S rRNA测序和特异性套式PCR结果表明,该分离菌株为副猪嗜血杆菌;血清型分型PCR结果表明,分离菌株为血清型7型;多点位序列分型ST-400;分离菌株对头孢曲松、阿莫西林/棒酸、庆大霉素、壮观霉素、多西环素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、左氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考、多黏菌素B敏感,对亚胺培南、林可霉素耐药;小鼠致病性试验结果表明,该菌株致病性和毒力较低。结果表明,在饲养条件不良或者有混合感染的条件下,血清7型副猪嗜血杆菌可能感染猪群并表现出相应的临床症状,可以根据药敏试验的结果选择头孢曲松、氟苯尼考等敏感药物对患病仔猪进行用药治疗。试验证实了血清7型副猪嗜血杆菌在临床中的感染情况,并为临床上对该病的治疗用药提供了一定参考依据。

血清14型副猪嗜血杆菌的分离与多克隆抗体制备

【目的】探明引起猪副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)病发病的病原菌,并制备分离病原菌的多克隆抗体,为该病的治疗及疫苗的研发提供技术支撑。【方法】从送检病料分离出保育猪发病病原菌,并对其进行形态观察、生化鉴定与PCR鉴定,明确分离病原菌的类型及血清型;同时使用甲醛对分离病原菌进行灭活后再与弗氏佐剂乳化制备灭活菌体抗原,经肌肉和皮下免疫BALB/C小鼠,制备该分离病原菌的鼠源多克隆抗体;采用饱和硫酸铵沉淀法对制备的多克隆抗体进行纯化,利用SDS-PAGE方法鉴定纯化抗体的纯度,通过免疫荧光进一步检测抗体与抗原的结合效果。【结果】从病料中分离得到1株革兰氏阴性短小杆菌,经形态学观察、生化鉴定与PCR鉴定,分离到的病原菌为血清14型副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS);灭活后的HPS与佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠制备得到分离病原菌的多克隆抗体,阳性菌液与纯化后稀释500倍和2000倍的多克隆抗体结合并加入荧光二抗后于显微镜下观察,病原菌发出红色荧光;经Western blot检测,制备多克隆抗体在约13 ku、30 ku和50 ku处有3条清晰条带,Western blot和免疫荧光试验均证实制备的多克隆抗体可与分离病原菌发生特异性反应。【结论】制备的血清14型HPS多克隆抗体可与分离病原菌发生特异性反应。

1株血清10型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性分析

【目的】阐明引起荆州某猪厂仔猪疑似副猪嗜血杆菌病的病原生理生化特性、毒力与药物敏感性,为今后对该病的防治提供科学依据。【方法】从患病仔猪中分离培养病原菌,通过形态学观察、生理生化鉴定、PCR鉴定、16S rRNA基因测序、血清型鉴定、多序列位点分型(MLST)对分离菌株进行鉴定。通过毒力基因检测、小鼠致病性、药敏试验、中药治疗试验等对分离株进行致病性、耐药性分析。【结果】通过形态学观察、生理生化试验、16S rRNA序列比对、系统进化树分析确定分离菌株为副猪嗜血杆菌。通过血清型与MLST分析确定分离菌株为血清10型、ST型为299。毒力基因检测发现,分离菌株具有CapD、vta 1、vta 2等15种毒力基因。将分离菌株腹腔注射感染小鼠,可导致小鼠多个脏器发生明显病变,具有较强致病性。耐药基因检测试验发现,分离菌株具有β-内酰胺类耐药基因bla OXA和氟喹诺酮类耐药基因gyrA。药敏试验结果显示,分离菌株对头孢他啶、新霉素、米诺环素等10种抗菌药物敏感,同时对明雄黄、款冬花、全蝎3种中药敏感。中药治疗试验结果表明,明雄黄和全蝎对分离菌株感染小鼠有较明显的治疗作用。【结论】试验成功分离1株血清10型副猪嗜血杆菌,侵染小鼠可致多个器官出血坏死,该菌株对10种抗菌药物及3种中药敏感,且明雄黄和全蝎对分离菌株感染小鼠治疗效果明显。研究结果可为今后副猪嗜血杆菌的防治和临床诊疗提供参考依据。

副猪嗜血杆菌血清7型菌株毒力及耐药性分析

【目的】了解河南地区副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)血清7型流行菌株的毒力及耐药情况。【方法】以Hps血清7型参考菌株为对照,对6株Hps血清7型临床分离菌株进行16S rRNA基因扩增、序列分析、毒力基因检测、致病性试验和药敏试验研究。【结果】16S rRNA基因测序及相似性比对结果显示,菌株1436与参考菌株0007相似性为100%,菌株1565、1624与参考菌株0007相似性均为98.6%。系统发育树分析表明,菌株1436与参考菌株0007亲缘关系最近;菌株1624与参考菌株0007亲缘关系最远。6株临床菌株与参考菌株表现为2种毒力基因型,菌株均携带有vta1、vta2、vta3、wza、nanH、cdtA、cdtB、cdtC和espP2毒力基因,其中5株临床菌株还携带ompP2毒力基因。豚鼠致病性试验结果显示,临床菌株毒力较参考菌株表现出不同程度的增强,参考菌株不能感染豚鼠发病,未表现任何临床症状;临床菌株可感染豚鼠发病,表现出一定的临床症状,发病率为20%~40%,死亡率为0。参考菌株和临床菌株均对头孢他啶和头孢噻呋敏感,对强力霉素、氟苯尼考中介,对新霉素、卡那霉素、阿米卡星、红霉素、替米考星等耐药,且均表现出多重耐药现象。【结论】Hps血清7型临床菌株有一定的致病性,但毒力较弱,对头孢类药物敏感,有明显的多重耐药现象,临床上应注意对该血清型的防控。本研究为Hps血清7型流行病学、致病机制研究奠定了基础,为Hps血清7型的临床防控提供了参考依据。

副猪嗜血杆菌血清7型菌株的分离鉴定及生物学特性研究

为了掌握河南某规模化猪场保育猪发病猪群的感染病原,研究从濒死期病猪的肺脏、心血样品中分离获得一株细菌,通过对该株细菌分离鉴定、血清型分型、致病性试验、毒力基因检测和药敏试验等一系列研究工作。结果表明,该株细菌为副猪嗜血杆菌,血清型为7型,与副猪嗜血杆菌vHPS7株(GenBank登录号:CP049089)同源性为100%。该菌株同时携带有vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、dtC、espP等毒力基因,结合豚鼠致病性试验结果和临床发病情况,该菌株具有较强的致病性;对头孢噻呋、头孢他啶、强力霉素、土霉素、四环素、阿奇霉素6种药物敏感;对青霉素G、阿莫西林、氨苄西林、复方新诺明、左氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、壮观霉素、卡那霉素、阿米卡星11种药物耐药。该研究为今后副猪嗜血杆菌血清7型致病机制研究奠定了基础,为副猪嗜血杆菌血清7型的临床防控提供了理论基础。

保育仔猪猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染的诊疗

为查清山西省吕梁市中阳县某猪场从山东购买的保育仔猪大量出现的急性死亡、关节发炎、呼吸困难、高热等症状的病原,无菌采集病猪并带回实验室进行临床剖检,随后采集血液、淋巴结、肺、肾脏和脾脏进行实验室诊断,做出初步判断,制定综合防治策略,病情得到控制。本研究采用灵敏度和准确度较高的实时荧光PCR技术定性检测病料样品中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和副猪嗜血杆菌(HPS)。结果表明:中阳县某猪场保育仔猪为PCV2与HPS混合感染。基于诊断结论对保育猪免疫治疗程序和消毒进行合理调整,综合防治13 d后,猪群无新增发病率和新增死亡率,最大程度地减少了经济损失。本研究为猪场后续的治疗与预防提供了诊断依据。

副猪嗜血杆菌血清7型crp基因缺失株的部分生物学特性

副猪嗜血杆菌(HPS)是引起猪格拉瑟病(Glasser’s disease)的病原菌,给全球和中国规模化养猪业造成了重大经济损失。副猪嗜血杆菌血清型众多,其中血清7型是近年来分离比例越来越高的血清型,也是危害越来越严重的血清型。crp是最重要的系统调控因子之一,在细菌感染过程中对细菌适应环境变化起着至关重要的作用。为了筛选副猪嗜血杆菌血清7型crp基因缺失弱毒株,采用自然转化法构建了副猪嗜血杆菌血清7型临床分离株HPS7的crp基因缺失株,对HPS7及其crp基因缺失株的生长特性、生物膜形成、抗药性、毒力等进行了研究。结果表明,HPS7的crp基因缺失后,生长显著减慢,自凝速度减慢,生物膜形成能力明显减弱,对大部分抗生素的抗性降低,对豚鼠的毒力降低。以上结果说明crp基因对HPS7的生长、抗药性、毒力均有明显影响。本研究结果为筛选副猪嗜血杆菌血清7型弱毒株提供了参考。

副猪嗜血杆菌4型灭活疫苗攻毒菌株的筛选

为筛选副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)4型攻毒菌株,对8株HPS进行血清型鉴定,并绘制细菌生长曲线;用豚鼠攻毒实验对其中5个菌株进行毒力测定,同时记录发病豚鼠的临床症状和剖检病变。结果显示8个菌株均为HPS4型,确定了候选菌株的最佳扩大培养时间为8~10h,筛选出毒力最强的CVCC4355。本研究确定CVCC4355可作为HPS4型疫苗产品效力检验的攻毒菌株。

副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定

从全国十多个省市送检的疑似患多发浆膜炎与关节炎猪的病料中分离到 32株细菌,进行了细菌形态观察、培养特性和生化特性鉴定;根据副猪嗜血杆菌 16SrRNA序列设计引物进行PCR扩增, 将 822bp扩增片段连入T 载体后测序, 再与GenBank(M75065 )中的序列进行比对,表明其与国外副猪嗜血杆菌菌株 16SrRNA序列的同源性为 97%以上,确定为副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis, Hps)。将其中的 15株按Kieletein Rapp Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法进行血清型鉴定,结果为血清 5型 3株、血清 4型 4株、血清 13型2株、血清 12型 2株,另外有 4株不能进行分型。该结果表明副猪嗜血杆菌在我国广泛存在。

2012年我国部分省市规模化猪场副猪嗜血杆菌分离鉴定及菌株血清分型

为掌握2012年我国猪场副猪嗜血杆菌(Hps)感染的发病状况,在我国部分省市规模化猪场采集疑似副猪嗜血杆菌病猪的心包积液及发生纤维素性浆膜炎的肺脏等病料共168份,通过病原分离培养、形态及培养特性观察、生化试验、PCR扩增等方法进行鉴定,最终分离出51株副猪嗜血杆菌,分离率约为30.4%。对51株副猪嗜血杆菌用琼脂扩散法进行血清分型,得到4型的6株(11.8%),5型的9株(17.6%),13型9株(17.6%),12型、14型各2株,1型、6型、10型、11型各1株,未能确定血清型19株,4型、5型、13型占总比例的47.1%,占有毒力血清型(强毒和中等毒力血清型)比例80.0%,表明副猪嗜血杆菌4型、5型、13型菌株是我国的优势血清型。

华东地区副猪嗜血杆菌的分离、血清型鉴定与药敏分析

2008年1～6月从华东地区养猪场送检的病猪中分离到13株细菌，经细菌形态、染色镜检、培养特性和生化试验鉴定为副猪嗜血杆菌，同时对所分离的细菌进行了血清型的鉴定和药敏试验。结果显示，13株副猪嗜血杆菌分属6个血清型，其中血清1型2株，4型4株，5型2株，12型3株，10型和13型各1株。13株分离细菌对头孢类药物、沙星类药物和阿莫西林等敏感。本研究为华东地区规模化猪场的副猪嗜血杆菌病防治提供了临床指导依据。

副猪嗜血杆菌分型血清的制备及其在流行病学研究上的应用

用副猪嗜血杆菌1~15血清型参考菌株和2株澳大利亚分离株高免健康家兔制备副猪嗜血杆菌分型血清,建立副猪嗜血杆菌KRG血清学分型方法（基于热稳定抗原免疫扩散试验的血清学分型方法）,并用该方法对田间分离的62株副猪嗜血杆菌进行血清型鉴定。结果顺利制备出了副猪嗜血杆菌15个血清型菌株的分型血清,建立了副猪嗜血杆菌KRG分型方法,62株副猪嗜血杆菌分离株中血清5型占22.5%、4型占16.1%、12型占14.5%、不能分型的菌株占16.2%。试验建立的副猪嗜血杆菌KRG分型方法,可为中国副猪嗜血杆菌血清学分型提供技术支持;血清型5、4、12为中国部分地区近2年最流行的血清型,为副猪嗜血杆菌病的防制提供了有效的参考依据。

副猪嗜血杆菌的分离与血清型鉴定

为了解副猪嗜血杆菌的血清型流行情况,采用细菌分离培养结合PCR的方法,对2008年至2012年,从山东、河南、河北、湖南、江苏、上海的多个猪场送检的186份疑似样品进行副猪嗜血杆菌的检测,再通过琼脂扩散试验对分离菌株进行了血清型鉴定。结果表明,从186份疑似样品中最终分离鉴定到57株副猪嗜血杆菌,分离率为30.6%。结果提示,我国副猪嗜血杆菌病存在不同程度的感染,以血清4型和5型最为流行,其次是血清1、12、13型,且该病的发生与季节和猪的日龄有关。

副猪嗜血杆菌血清5型分离株生长曲线与致病力研究

本文对副猪嗜血杆菌血清5型生长曲线进行了研究。结果表明:种子液接种后6 h开始进入对数生长期,培养24 h后活菌数达到最高峰,20～30 h活菌数维持在同一个水平,进入稳定期,30 h后活菌数呈现下降趋势,进入衰退期。该曲线提供了副猪嗜血杆菌生长规律,为疫苗研制提供了理论基础。

血清6型副猪嗜血杆菌的分离鉴定和生物学特性研究

为了明确河南地区血清6型副猪嗜血杆菌流行菌株的生物学特性,试验从发病猪的肺脏、心血、关节液等病料中分离、纯化副猪嗜血杆菌,并对分离纯化的副猪嗜血杆菌进行PCR鉴定,同时进行血清型分型、致病性试验、毒力基因检测和药敏试验。结果表明:从肺脏中分离得到一株血清6型副猪嗜血杆菌,该菌株携带有vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtC、espP2 9种主要毒力基因;对保育仔猪表现出轻微的致病性;对头孢噻呋、头孢他啶、阿莫西林等16种抗生素敏感,对氨苄西林、青霉素G、卡那霉素等8种抗生素耐药。说明分离得到的血清6型副猪嗜血杆菌毒力较弱,对大多数药物敏感。

镇江地区副猪嗜血杆菌分离鉴定血清型及耐药性检测

为了解镇江地区副猪嗜血杆菌血清型流行情况与耐药性情况,本试验采集患病仔猪的肺脏、肝脏、关节渗出液等病料组织85份,采用细菌分离、形态学观察、培养特征鉴定、PCR鉴定等方法对副猪嗜血杆菌进行鉴定,采用PCR法和K-B药敏纸片法分别检测副猪嗜血杆菌血清型及耐药性。结果显示,从85份病料组织中分离得到48株副猪嗜血杆菌;48株副猪嗜血杆菌具有7种血清型,其中,血清5型和12型为流行的主要优势血清型,分别占分离菌株的25.0%和31.3%;48株副猪嗜血杆菌对磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、庆大霉素等9种药物耐药率在50.0%~100.0%之间,对其他药物耐药率在12.5%~25.0%之间。说明该地区分离的副猪嗜血杆菌血清型流行情况复杂,且耐药性严重。本试验为该地区的副猪嗜血杆菌防控提供研究基础。

猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的鉴别诊断及血清型鉴定

利用PCR技术、琼脂扩散试验、糖发酵试验和间接血凝试验(IHA)对野外分离到的可疑猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌进行了诊断和血清型鉴定。PCR鉴定分离物HS1580为副猪嗜血杆菌,分离物HS1582为猪胸膜肺炎放线杆菌; 生化试验表明分离物HS1581和HS1582为猪胸膜肺炎放线杆菌; 血清型鉴定分离物HS1580不属于被检的14个血清型之列,HS1581为App血清15型,HS1582为App血清7型。试验结果表明,综合使用PCR等技术可快速、准确地对这两种传染性细菌进行鉴别诊断和血清型鉴定。

副猪嗜血杆菌血清型和外膜蛋白P5基因型多样性的研究

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)的血清型及基因型具有复杂多样性。本研究用间接血凝试验对某一猪场分离的Hps进行血清分型鉴定,并对部分菌株的外膜蛋白P5基因进行克隆测序和进化发育分析。试验结果显示,在21头病死猪不同部位共分离了42株Hps,其中Hps血清5型17株(40.7%)、血清14型12株(28.5%)、血清4型1株(2.3%)和未定型12株(28.5%)。本试验中有5头猪同时感染2种不同血清型的Hps。21株Hps临床分离株分属5个不同基因序列型(STA～STE),其中STA有12株(12/21)为优势基因型;相同血清型的Hps分离株具有不同的STs型,来自同一头猪的Hps血清型和STs型也不相同。以上结果表明,同一猪群感染的Hps血清型和基因型存在明显的多样性,同一头猪感染Hps的血清型和基因型也存在多样性。本研究为进一步揭示猪群感染Hps的复杂性,研究该病的感染与流行机制提供了有价值的参考。

副猪嗜血杆菌的培养及流行血清型鉴定

为了对引起重庆垫江、荣昌、永川等地和四川省宜宾、隆昌等地的10个猪场的猪发现的病原进行鉴定,试验对分离到的14株革兰阴性细小杆菌进行了细菌培养特性试验、生化特性及血清型鉴定。结果表明:重庆地区分离到的14株疑似菌株均为副猪嗜血杆菌,流行血清型为4型、5型和13型。