E1A激活基因阻遏子(CREG)过表达通过抑制p38/JNK信号分子活化对抗人血管平滑肌细胞凋亡

血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡参与了动脉粥样硬化(AS)及冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄(RS)等心血管疾病的发生发展过程.E1A激活基因阻遏子(CREG)是新近发现的一种分泌型糖蛋白,在维持细胞和组织稳态方面发挥重要作用.前期研究发现CREG蛋白过表达能够对抗血清饥饿诱导的人血管平滑肌细胞(hVSMCs)凋亡,进一步探讨CREG对hVSMCs凋亡的调控作用及相关的分子机制.以逆转录病毒稳定转染的CREG过表达及表达抑制的hVSMCs为模型,应用两种药物Staurosporine(STS)和Etoposide(VP-16)诱导细胞发生凋亡,检测细胞凋亡和相关信号通路变化.结果显示,在药物干预后,CREG表达抑制时细胞凋亡明显增多,而CREG过表达明显抑制hVSMCs凋亡.同时也发现,CREG表达抑制时p38及JNK活性明显增强,而CREG过表达时p38和JNK活性被抑制.经腺病毒转染和药物干预抑制p38表达后,细胞凋亡均受到抑制,而且在p38活性被抑制的同时,JNK活化也受到抑制.说明p38和JNK表现为协同作用.结果也显示,VSMCs分化指标SMα-actin和SM MHC与CREG表达呈一致趋势,而细胞外基质蛋白Fibronection与CREG表达呈负相关.以上结果提示,CREG在维持VSMCs表型转换方面发挥重要作用,并且通过p38和JNK信号转导通路对hVSMCs凋亡进行调控.CREG可能对于AS和PCI术后RS的防治具有重要价值.

E1A激活基因阻遏子促进人血管内皮细胞VEGF分泌和单层通透性增加

目的:探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)诱导的人血管内皮细胞(ECs)单层通透性改变中的作用及机制。方法:用CREG过表达及CREG表达下调的ECs为模型,Transwell chamber弥散模型观察ECs单层通透性的改变;荧光倒置显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-actin及黏附连接蛋白VE-cadherin在ECs中的分布和形态学改变;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测ECs血管内皮生长因子(VEGF)分泌。结果:CREG过表达的ECs(EO组)较EN组单层通透性明显增高(P<0.05);CREG表达下调的ECs(ES组)较EN组单层通透性有所下降(P<0.05)。与EN组相比较,EO组细胞中F-actin排列紊乱,形成大量应力纤维;ES组F-actin则主要呈细丝状分布于细胞周边,中央分布较少。同时,EO组VE-cadherin在细胞周边的正常拉链状结构减少或缺失,细胞间隙增宽;而ES组VE-cadherin在细胞周边呈正常拉链状分布,细胞之间连接紧密。ELISA检测显示EO组细胞上清中VEGF分泌较EN组明显增加(P<0.05);ES组VEGF分泌较EN组减少(P<0.05)。应用VEGF中和抗体阻断后,CREG过表达引起的EO通透性增加的现象明显受到抑制。结论:CREG过表达可能通过VEGF介导的信号途径引起F-actin重构及VE-cadherin减少,使血管内皮细胞单层通透性增加。

E1A激活基因细胞阻遏子蛋白在人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

背景:研究内皮细胞凋亡的机制及其与动脉硬化形成的关系将为动脉粥样硬化的防治提供新的思路。而E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白在内皮细胞凋亡中的作用,目前尚未见报道。目的:探讨E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白在去血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用及其调控机制。时间及地点:实验于2007-10/2008-12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所实验室完成。材料:人脐静脉内皮细胞,Phoenixamphotropic293细胞,pLNCX-CREG和pLNCX-GFP反转录病毒真核表达载体。方法:采用持续去血清培养的方法诱导内皮细胞凋亡,用TUNEL染色和Westernblot检测去血清饥饿24,48,72h后各实验组细胞中cleave-caspase3表达;用pLNCX-CREG和pLNCX-GFP反转录病毒真核表达载体转染人脐静脉内皮细胞,并筛选稳定表达的细胞克隆;应用Westernblot检测E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白的表达,并进一步应用流式双荧光染色分析E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白过表达在去血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用。主要观察指标:cleave-caspase3表达量,人脐静脉内皮细胞凋亡率。结果:成功构建了E1A激活基因细胞阻遏子过表达的人脐静脉内皮细胞模型,证实内皮细胞E1A激活基因细胞阻遏子的表达随凋亡的增加而增加,E1A激活基因细胞阻遏子过表达的人脐静脉内皮细胞去血清饥饿后凋亡较对照组明显减少。结论:E1A激活基因细胞阻遏子过表达抑制了去血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,机制可能与调控PI3K蛋白表达有关。

E1A激活基因阻遏子对抗肿瘤坏死因子α引起的血管内皮细胞炎性损伤

目的探讨E1A激活基因阻遏子表达对血管内皮细胞病理性炎症反应的生物学作用及机制。方法以E1A激活基因阻遏子过表达和基因沉默的人动脉血管内皮细胞为细胞模型,应用肿瘤坏死因子α刺激,ELISA检测白细胞介素6的变化,Rhodamin-Phalloidin检测肌动蛋白骨架F-actin分布,应用Transwell小室和Biotin标记的BSA检测单层内皮细胞通透性改变。进一步通过免疫荧光染色和Western blot检测细胞内核因子κB蛋白表达和转位情况。结果 ELISA检测发现,E1A激活基因阻遏子基因过表达显著抑制肿瘤坏死因子α刺激引起血管内皮细胞白细胞介素6的表达及分泌增加。同时,细胞F-actin应力纤维的形成和细胞单层通透性增加受到明显抑制。相反,E1A激活基因阻遏子基因沉默组白细胞介素6分泌较对照组明显增多。细胞F-actin应力纤维形成、细胞单层通透性显著增加。免疫荧光和Western blot分析证实,肿瘤坏死因子α刺激后,E1A激活基因阻遏子过表达组核因子κB出现短时的入核现象并迅速出核,对应蛋白出现相应的表达变化,而E1A激活基因阻遏子基因沉默组核因子κB表达持续增高且发生明显的入核转位现象。结论 E1A激活基因阻遏子可通过减少核因子κB的表达对抗肿瘤坏死因子α刺激引起的血管内皮细胞炎症反应和细胞通透性增加,对抗细胞病理性损伤发生。

E1A激活基因阻遏子蛋白过表达可抑制人血管平滑肌细胞的迁移

背景:成熟动脉中膜血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分化稳态的丧失是血管老化的一个重要原因。目的:观察E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)抑制人血管平滑肌细胞迁移的分子机制。方法:应用已建立的稳定转染CREG过表达细胞hVSMCs-CREG和CREG表达沉默的hVSMCs-siCREG细胞株通过刮伤实验和Transwell小室细胞移行实验检测细胞迁移能力,通过Western blot检测转染前后细胞中CREG蛋白、基质金属蛋白酶和JNK表达及活化情况,应用JNK和基质金属蛋白酶9抑制剂阻断研究分析上述信号分子表达变化在细胞迁移中的作用。结果与结论:Western blot结果证实,CREG蛋白表达在hVSMCs-CREG组中增加(P<0.05),而在hVSMCs-siCREG组中减少(P<0.05)。刮伤实验和Transwell实验分析结果证实hVSMCs-CREG组细胞较正常对照组细胞迁移能力受抑。相反,hVSMCs-siCREG组细胞迁移能力显著增加(P<0.05)。Western blot和明胶酶谱分析证实hVSMCs-siCREG组细胞中MMP9活性明显增加(P<0.05),同时JNK蛋白活化。进一步应用JNK抑制剂阻断研究证实,CREG蛋白表达抑制引起的血管平滑肌细胞迁移能力增加与细胞中基质金属蛋白酶9活性均受到剂量依赖性抑制。结果证实,CREG蛋白表达可抑制JNK-基质金属蛋白酶9信号通路的活化,以此抑制体外培养的人血管平滑肌细胞迁移。

E1A激活基因阻遏子基因表达变化与颈动脉血管重塑的关系

E1A激活基因阻遏子(CREG)是一种广泛表达的小分子糖蛋白,但其生物学功能仍不完全清楚.为了探索病理性血管重塑的病理生理机制以及CREG在其中发挥的调控作用,采用颈动脉导丝损伤模型构建小鼠病理性血管重塑模型,应用小动物超声、Masson染色、免疫组织化学染色、RT-PCR、Western-blot等方法检测小鼠颈动脉内膜-中膜厚度、胶原含量、Ⅰ型胶原和CREG表达变化.结果表明,小鼠颈动脉损伤后3 d血管壁CREG m RNA和蛋白质水平迅速下降,损伤后7 d CREG表达回升,至损伤后14 d和28 d基本恢复到正常对照组水平.血管损伤后3 d血管壁中Ⅰ型胶原m RNA水平开始升高,损伤后7 d血管壁开始增厚,管壁中Ⅰ型胶原表达水平继续增高,损伤后14 d和28 d新生内膜形成,管腔严重狭窄,Ⅰ型胶原在管壁和新生内膜内大量表达.血管损伤早期CREG表达水平的变化与病理性血管重塑程度呈负相关关系,CREG的表达为先迅速降低,再逐渐回升,而胶原表达和血管重塑程度则表现为持续加重.上述研究结果提示,CREG基因表达参与血管损伤导致的病理性血管重塑过程,并可能决定了血管重塑的进程和结局.

E1A激活基因阻遏子在动脉粥样硬化血管中的表达及其与炎症因子的关系

目的探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)在动脉粥样硬化(AS)血管中的表达及其与炎症因子的关系。方法 Apo E(-/-)小鼠6周龄断奶后给予高脂喂养。8周后取主动脉血管,采用HE染色观察血管的形态学变化;采用免疫荧光染色观察CREG、SMα-actin和巨噬细胞标志物Mac-3的表达变化。取高脂喂养的1~8周小鼠血管,采用Western blot方法检测AS血管中CREG及核转录因子(NF)-κB的表达的变化。结果在Apo E(-/-)小鼠高脂喂养8周,主动脉血管AS斑块明显形成,斑块内有胆固醇结晶,斑块凸凹不平,管腔明显狭窄。免疫荧光显示AS血管中,CREG表达明显下降,同时SMα-actin表达也下降,而Mac-3表达增高。Apo E(-/-)小鼠高脂喂养2~8周,取动脉血管行蛋白定量分析,结果显示高脂喂养2周时,CREG在动脉血管中的表达不是降低,而是明显升高,高脂喂养第4周,CREG表达急剧下降,而后又逐渐上升,但不能升至正常水平。同时NF-κB随着时间的推移,表达逐渐升高。结论在AS进程中,血管中膜的VSMCs由收缩表型向合成表型转化,细胞增生活跃、分化减弱,CREG作为维持VSMCs分化的蛋白,在血管中的表达与AS进展密切相关,同时伴随着炎症因子表达逐渐升高。

E1A激活基因阻遏子蛋白对抗人脐静脉血管内皮细胞的凋亡

背景:前期研究显示,E1A激活基因阻遏子能够通过抑制动脉平滑肌细胞的凋亡对抗动脉粥样硬化。目的:进一步阐明E1A激活基因阻遏子在内皮细胞凋亡中的作用。方法:通过去血清方法诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞凋亡,然后进行TUNEL和caspase-3的活性检测。结果与结论:伴随着E1A激活基因阻遏子的表达下降,内皮细胞的凋亡增多。功能获得和功能缺失分析显示:E1A激活基因阻遏子过表达后能够明显抑制内皮细胞的凋亡,而E1A激活基因阻遏子表达减少可以明显增加诱导内皮细胞的凋亡。进一步应用Western blot分析显示:E1A激活基因阻遏子对于内皮细胞凋亡的保护作用主要通过激活PI3K/AKT信号通路介导。提示E1A激活基因阻遏子对抗去血清诱导的内皮细胞凋亡中具有重要的作用。并且,E1A激活基因阻遏子抑制的内皮细胞凋亡可能通过PI3K/AKT信号转导通路。

E1A激活基因阻遏子基因表达与血管外膜成纤维细胞表型转化的关系

目的探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)基因表达与血管外膜成纤维细胞(AFs)表型转化间的关系。方法制作小鼠颈动脉损伤模型,免疫荧光染色观察血管外膜中CREG与平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;培养小鼠原代AFs,外源性应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导其表型转化,RT-PCR和Western-blot检测不同作用时间及不同浓度AngⅡ刺激AFs后CREG和α-SMA mRNA和蛋白质表达。结果血管损伤后1 d、3 d血管外膜增生显著,外膜中α-SMA表达显著上调,而CREG表达显著下调;血管损伤后7 d、14 d外膜增生有所缓解,α-SMA表达水平逐渐下降,而CREG表达也有所恢复。应用AngⅡ诱导AFs发生表型转化,AFs中α-SMA mRNA和蛋白水平显著上调,而CREG mRNA和蛋白水平显著下调,并且呈时间和剂量依赖性。结论在体和离体模型均表明AFs表型转化过程中伴随CREG基因表达下调,提示CREG基因可能参与AFs的表型转化。

过表达E1A激活基因阻遏子对OxLDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响

目的:研究过表达E1A激活基因阻遏子(CREG)对氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)诱导的血管内皮细胞损伤的影响。方法:血管内皮细胞分为4组,空白对照组不处理; Ox LDL组用100 mg/L Ox LDL处理24 h;另2组分别感染对照逆转录病毒(阴性对照组)和p LNCX-CREG重组逆转录病毒(p LNCX-CREG组),之后均用100 mg/L OxLDL处理24 h。用Real-time PCR和Western blot法检测4组细胞CREG mRNA和蛋白的表达,用硫代巴比妥酸法检测培养液中丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法检测培养液中超氧化物歧化酶(SOD)活性,DCFH-DA法检测培养液中活性氧(ROS)水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)蛋白的表达水平。结果:与空白对照组比较,Ox LDL组细胞中CREG mRNA和蛋白表达水平均降低; p LNCXCREG组细胞中CREG mRNA和蛋白表达水平均较Ox LDL组升高(P <0. 05)。与空白对照组比较,Ox LDL组细胞SOD活性降低,MDA和ROS水平升高,细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均升高;与Ox LDL组比较,p LNCX-CREG组细胞氧化损伤指标的变化被逆转,细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均降低(P <0. 05)。结论:过表达CREG可以抑制Ox LDL诱导的血管内皮细胞氧化损伤并抑制细胞凋亡。

肝细胞E1A激活基因阻遏子通过转化生长因子激酶1依赖减轻小鼠肝缺血再灌注损伤

【据《Hepatology》2019年1月】报道:肝细胞E1A激活基因阻遏子通过转化生长因子激酶1依赖减轻小鼠肝缺血再灌注损伤(作者 Yang L等)肝缺血再灌注损伤是在肝移植、肝切除手术中不可避免的损伤过程,是肝脏外科手术的一大难题。目前唯一有效的治疗方案是缺血预处理,但在适应症上存在缺陷。因此,对肝缺血再灌注损伤发病机制的深入了解并开发有效的治疗方法至关重要。E1A激活基因阻遏子(CREG)是细胞增殖的关键调节因子,已有相关文献报道其在心血管疾病中发挥重要的保护作用,同时也可在肝脂质积累和炎症反应中发挥保护作用。然而,其在肝缺血再灌注损伤中的作用尚未见报道。因此,探讨CREG在肝缺血再灌注损伤中的作用可为临床诊疗提供新的思路。

巨核细胞/血小板E1A激活基因阻遏子基因敲除小鼠构建及胎肝巨核细胞诱导分化

目的构建巨核细胞/血小板特异性E1A激活基因阻遏子基因(Creg1)敲除小鼠,并诱导小鼠胚胎胎肝巨核细胞的分化,为研究Creg1在巨核细胞分化和血小板生理功能中的作用提供实验工具及方法。方法将雌性Creg1^(flox/flox)小鼠与雄性血小板因子4(Pf4)-Cre^(+)小鼠繁育,获得Creg1flox/wtPf4-Cre^(+)小鼠,进一步交配获得巨核细胞/血小板特异性Creg1敲除小鼠(Creg1^(flox/flox)Pf4-Cre^(+),简写为Creg1^(-/-))。采用聚合酶链式反应及琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。取Creg1^(flox/flox)和Creg1^(-/-)孕龄约15 d小鼠的胎肝,体外培养胎肝细胞4 d,加入血小板生成素,光镜下观察两组巨核细胞形态和大小的区别。结果本研究成功构建了Creg1^(-/-)小鼠。与Creg1^(flox/flox)小鼠比较,Creg1^(-/-)小鼠巨核细胞中Creg1 mRNA的表达量显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与Creg1^(flox/flox)小鼠比较,Creg1^(-/-)小鼠胎肝巨核细胞诱导分化4 d时,光镜下观察发现,巨核细胞的直径明显变小,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Creg1^(-/-)小鼠作为研究巨核细胞和血小板相关疾病发生机制的实验工具鼠,可能揭示尚未发现和阐明的重要病理生理学机制,为临床治疗血小板疾病提供理论基础支持。

载脂蛋白E背景E1A激活基因阻遏子转基因小鼠建立及鉴定

目的建立并鉴定载脂蛋白E(ApoE)背景E1A激活基因阻遏子(CREG)转基因(Apo^E(⁃/⁃)CREG^(Tg))小鼠。方法将雄性Apo^E(⁃/⁃)小鼠与雌性CREG^(Tg)小鼠进行交配,获得雄性Apo^E(+/⁃)小鼠和雌性Apo^E(+/⁃)CREG^(Tg)小鼠,再将两者进行交配,以获得Apo^E(⁃/⁃)CREG^(Tg)小鼠。第4周时,提取鼠耳基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。提取小鼠脂肪组织和脾组织的RNA、蛋白,采用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法检测小鼠脂肪组织和脾组织CREG基因转录水平、蛋白表达水平。结果子代小鼠中,ApoE^(+/+)小鼠9只(12.33%),ApoE^(+/+)CREG^(Tg)小鼠10只(13.70%),Apo^E(+/⁃)小鼠19只(26.03%),Apo^E(+/⁃)CREG^(Tg)小鼠16只(21.92%),Apo^E(⁃/⁃)小鼠8只(10.95%),Apo^E(⁃/⁃)CREG^(Tg)小鼠11只(15.07%),成功构建Apo^E(⁃/⁃)CREG^(Tg)小鼠模型。Apo^E(⁃/⁃)CREG^(Tg)小鼠脂肪组织、脾组织的CREG基因转录水平、蛋白表达高于Apo^E(⁃/⁃)小鼠,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论本研究成功建立了Apo^E(⁃/⁃)CREG^(Tg)小鼠模型,为深入阐明CREG在动脉粥样硬化等心血管疾病中的作用及机制提供了新的实验工具。

血清CREG及CXCL16水平与急性心肌梗死后认知功能障碍的关系

目的:探讨血清E1A激活基因阻遏子(CREG)、巨噬细胞趋化因子配体16(CXCL16)水平与急性心肌梗死(AMI)患者认知功能障碍的关系。方法:选择AMI后认知功能障碍患者50例为认知功能障碍组,另选择同期AMI无认知障碍患者50例为无认知功能障碍组,采用酶联免疫分析法检测患者血清CREG、CXCL16水平,同时分析蒙特利尔认知评估量表(MOCA)各项评分与血清CREG、CXCL16水平的相关性。结果:认知功能障碍组血清CREG、CXCL16水平均显著高于无认知功能障碍组[(346. 56±24. 71) ng/mL vs (238. 64±18. 33) ng/mL,(2. 14±0. 43) mg/L vs (1. 58±0. 37) mg/L,均P <0. 05]。Spearman相关分析显示,认知功能障碍组血清CREG、CXCL16水平均与MOCA总分呈负相关(均P <0. 05);其中患者血清CREG、CXCL16水平均与视空间与执行能力、命名、注意与计算力、语言、延迟回忆呈负相关(均P <0. 05),但和抽象思维、定向力无关(均P>0. 05)。结论:血清CREG、CXCL16水平与AMI后认知功能障碍紧密相关;血清CREG、CXCL16水平高表达可以促进AMI后认知功能障碍的发生及发展。

大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞E1A激活基因阻遏子的表达变化

目的 探讨血管再狭窄发生的病理生理机制及E1A激活基因细胞阻遏子 (CREG)在新生内膜增殖中的调控作用 ,为研究CREG防治增生性血管疾病的作用奠定基础。方法 采用大鼠颈动脉球囊损伤后血管再狭窄的动物模型 ,以免疫组织化学染色、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法 ,检测新生内膜中增殖细胞核抗原 (PCNA)和平滑肌α肌动蛋白 (SMα actin)的表达变化及血管壁中CREGmRNA水平、蛋白表达的动态变化。结果 大鼠颈动脉球囊损伤后 1d血管壁CREGmRNA水平开始下降 ,至损伤后 5d达最低 ,损伤后 7dCREGmRNA表达回升 ,至 2 8d时仍未回到正常对照组的水平。血管损伤后 3d血管内表面可见增殖的血管平滑肌细胞 (VSMC) ,PCNA染色阳性 ,其胞浆内SMα actin和CREG染色均为阴性 ;损伤后 5d新生内膜形成并增厚 ,PCNA阳性细胞数达到高峰 ,部分VSMC胞浆内SMα actin和CREG染色均呈阳性 ;损伤后 2 8d管腔严重狭窄 ,新生内膜中PCNA表达已较低 ,SMα actin和CREG表达均明显增加 ,新生内膜SMα actin表达程度仍弱于中膜 ,CREG表达程度接近中膜。损伤后不同时间点VSMC增殖程度与血管壁中CREGmRNA水平的变化呈负相关 (r =- 0 80 ,P <0 0 5 ) ,CREGmRNA的表达为先降低 ,后回升 ,而细胞增殖指数为先升高 ,后回降。结论 VSMC的表?

E1A激活基因阻遏子（CREG）对过氧化氢诱导骨髓间充质干细胞凋亡保护作用的实验研究

目的探讨EIA激活基因阻遏子（CREG）过表达修饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）能否有效对抗炎症因子过氧化氢（H2O2）诱导的BMSCs细胞凋亡，为其在视网膜变性类疾病的治疗提供理论基础。方法实验研究。对2012年1月至2014年12月在内蒙古民族大学附属医院眼科实验研究，以原代培养的大鼠BMSCs为实验细胞模型，以携带有CREG基因的腺病毒载体感染BMSCs，制备CREG基因修饰的BMSCs，Western blot及荧光显微镜鉴定CREG基因在BMSCs中的表达效率。TUNEL法检测添加500μmol／L过氧化氢（H2O2）刺激24h后，检测controlBMSCs组、normBMSCs组、GF—PBMSCs组、CREGBMSCs组的BMSCs凋亡率。Western blot方法检测caspase-3及BCL-2表达量。结果（1）瞬时转染Ad—GFP的BMSCs中GFP（绿色荧光蛋白）表达量达到90％，所构建的载体成功将目的基因CREG转染BMSCs。（2）通过TUNEL法和Western blot检测研究发现，Ad—CREG瞬时转染的BMSCs可以有效抑制500μmol／L H2O2刺激24h后诱导的凋亡，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论体外诱导BMSCs过表达CREG能有效抑制炎性因子H2O2诱导的BMSCs凋亡，对提高移植后BMSC存活率及今后应用于治疗视网膜变性类疾病可能发挥一定作用。

人CREG启动子报告基因质粒的构建及转录活性分析

目的构建人E1A激活基因阻遏子基因(hCREG)不同截短片段的启动子增强型绿色荧光蛋白(pEGFP1)报告基因载体,比较各启动子转录活性,从而确定hCREG核心启动子区。方法通过查询美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库hCREG序列并结合启动子特点,获得长度为2003(–1925/+78) bp的启动子片段。利用PCR法及双酶切法截短5个启动子片段并克隆至pEGFP1中,构建pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_586、pEGFP1_hCREG_478、pEGFP1_hCREG_358报告基因载体质粒。并将其与内参质粒pGL4.73[hRluc/SV40]瞬时共转染入293T细胞48 h,荧光显微镜下观察pEGFP1hCREG启动子报告基因的绿色荧光表达;采用实时定量PCR检测各启动子mRNA的表达,并确定核心启动子区。采用生物信息学方法预测核心启动子区可能结合的转录因子。结果通过双酶切和基因测序法证实成功构建5个hCREG启动子报告基因载体。荧光显微镜下的观察结果和实时定量PCR结果均显示,pEGFP_1hCREG_586转录活性最高(P<0.05),pEGFP1_hCREG_358转录活性最低(P<0.05),pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_478转录活性差异均无统计学意义(P>0.05),提示–867/–509 bp为负性调控区,–400/–281 bp和–508/–401 bp均存在增强子序列,故hCREG基因核心启动子区位于基因5’上游序列–508/–281 bp区域。生物信息学预测关键启动子区–508/–281 bp可能结合的转录因子为Pax5/P53、C/EBPβ、GR-β、GATA-1、GR-α、c-Jun、PRB/PRA、YY1、RXR-α、AP-2、FOXP3、GR、TFIID、STAT4、c-Ets-1。结论成功构建了hCREG基因启动子重组质粒,其核心启动子位于–508/–281 bp区域,此区域可结合多个转录因子。

心肌缺血再灌注损伤小鼠E1A激活基因阻遏子基因表达及其对心肌的保护作用

目的探讨心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIR)小鼠E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated gene,CREG)表达变化,及其对损伤心肌的保护作用。方法 CREG基因半敲除C57BL/6模型小鼠18只(A组),36只未敲除CREG基因C57BL/6小鼠随机分为B、C组各18只,3组采用线栓法制备MIR模型。建模前B组皮下微渗透泵给予外源性重组CREG蛋白1.5mg/(kg·d),连续14d,A、C组给予等量生理盐水。MIR后2h各组均处死6只小鼠,采用Western blot法检测心肌CREG蛋白表达,反转录PCR法检测心肌CREG mRNA表达;MIR后12h各组均取6只小鼠检测左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、左心室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume,LVESV),血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOP)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH);MIR 24h检测各组剩余6只小鼠心肌细胞凋亡指数。结果 A组心肌组织CREG蛋白、CREG mRNA表达(0.33±0.07、0.51±0.09)低于B组(0.85±0.19、0.97±0.10)、C组(0.67±0.15、0.99±0.05)(P<0.05);C组CREG蛋白表达低于B组(P<0.05),CREG mRNA表达与B组比较差异无统计学意义(P>0.05);A组LVEF[(34.2±3.1)%]低于B、C组[(58.7±5.1)%、(41.4±4.5)%](P<0.05),LVEDV[(121.8±14.0)μL]、LVESV[(77.2±9.0)μL]高于B组[(93.1±7.7)、(43.8±6.1)μL]、C组[(95.0±8.5)、(45.2±5.4)μL](P<0.05),C组LVEF低于B组(P<0.05);A组血清CK[(1 481.6±339.2)]u/L、CK-MB[(539.5±54.0)u/L]、GOP[(519.8±43.2)u/L]、LDH[(923.8±211.3)u/L]高于B组[(682.3±155.9)、(458.7±44.4)、(431.2±29.7)、(401.4±98.6)u/L]、C组[(874.0±193.5)、(489.1±47.1)、(460.0±32.5)、(600.5±115.8)u/L](P<0.05),且C组各指标均高于B组(P<0.05);A组心肌细胞凋亡指数[(57.21±2.26)%]明显高于B、C组[(16.94±1.75)%、(26.16±1.90)%](P<0.05),C组高于B组(P<0.05)。结论 CREG蛋白高表达对MIR心肌具有保护作用,其机制可能与减轻心肌细胞凋亡、降低心肌酶水平有关。

E1A激活基因阻遏子基因对血管紧张素Ⅱ刺激后小鼠原代心肌细胞凋亡影响

目的探讨E1A激活基因阻遏子基因(CREG)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激后小鼠原代心肌细胞凋亡的影响。方法将小鼠乳鼠原代心肌细胞培养后分为对照组与AngⅡ组(刺激24 h),采用荧光定量PCR和Western blot检测CREG基因mRNA和蛋白表达;将CREG过表达的腺病毒(adCREG)及其对照病毒(adcon)加入到小鼠原代心肌细胞上清后再给予AngⅡ刺激24 h后,Western blot检测凋亡相关指标Cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达。结果对照组与AngⅡ组的CREG基因mRNA表达情况比较,差异无统计学意义(P>0.05);但AngⅡ组CREG蛋白水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。adCREG组CREG蛋白表达明显高于adcon组,差异有统计学意义(P<0.01);但两组Cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05);adcon+AngⅡ组CREG和Bcl-2蛋白表达明显低于adcon组,而Cleaved-caspase3和Bax蛋白表达明显高于adcon组,差异均有统计学意义(P<0.01);adCREG+AngⅡ组Cleaved-caspase3和Bax蛋白表达明显低于adcon+AngⅡ组,而Bcl-2蛋白表达明显高于adcon+AngⅡ组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论AngⅡ刺激后降低心肌细胞中CREG蛋白表达,CREG过表达后可显著抑制AngⅡ引起的心肌细胞凋亡。

CREG1蛋白对血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心功能损伤的影响

目的探讨E1A激活基因阻遏子(CREG1)蛋白能否改善心肌纤维化小鼠的心功能。方法应用基因打靶方法建立广泛性基因敲除的CREG1杂合子小鼠和CREG1野生型小鼠模型。应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)皮下埋泵方法建立小鼠心肌纤维化损伤模型,给予AngⅡ刺激14d后,采用HE和Masson染色检测小鼠心肌纤维化情况。应用Western blotting和免疫组化染色技术检测给予AngⅡ前及3、7、14d后两组小鼠心肌中CREG1蛋白的表达,并于给予AngⅡ14d后应用小动物超声仪检测心功能情况。AngⅡ给药同时,以皮下埋泵方式分别给予15、30、60、300μg/(kg·d)的外源性重组CREG1蛋白(治疗组)和生理盐水(对照组)14d,检测心功能,并应用TUNEL染色和Western blotting检测心肌凋亡情况。结果 Western blotting和免疫组化检测结果显示,未给予AngⅡ刺激时杂合子小鼠心肌中CREG1蛋白表达明显低于野生型小鼠(P<0.05)。给予AngⅡ刺激3、7、14d时,野生型小鼠和杂合子小鼠心肌中CREG1蛋白表达均明显下降(P<0.05),但杂合子小鼠下降更为显著(P<0.01);HE和Masson染色显示杂合子小鼠心肌纤维化程度较野生型小鼠严重,二者心功能明显下降,且杂合子小鼠心功能下降更为明显(P<0.05)。给予外源性重组CREG1蛋白治疗后,治疗组心功能较对照组明显改善(P<0.05),心肌凋亡数量明显下降(P<0.05)。结论在AngⅡ引起的小鼠心肌纤维化模型中,CREG1蛋白减少可使小鼠心功能损伤加重,给予外源性重组CREG1蛋白可明显改善心功能。