阴囊热应激对山羊血睾屏障结构和功能的影响

旨在探究热应激对山羊血睾屏障(BTB)结构和功能的影响,为山羊热应激防治提供理论依据。本研究选择6只1~1.5岁的健康雄性关中山羊,随机分为2组,每组3只。对照组正常饲喂,试验组采用改良后的阴囊热刺激法建立山羊睾丸热应激模型。利用CASA法检测精液质量变化,光镜与透射电镜观测睾丸结构,生物素示踪法显示BTB通透性改变,蛋白质印记法与免疫组织化学法检测BTB关键蛋白表达定位。热应激组中山羊睾丸指数、精子数量、精子活率、精子总运动性和精子前进运动率均显著降低(P<0.05)。热应激导致睾丸组织形态受损明显,生精细胞数量减少且排列紊乱;支持细胞内质网扩张,并出现大量空泡;支持细胞间紧密连接结构松散且不连续。热应激引起BTB通透性升高,关键连接蛋白表达水平显著降低(P<0.05),但分布定位未受影响。热应激损伤山羊睾丸组织形态,破坏支持细胞结构并降低BTB关键蛋白表达,从而导致BTB结构和功能完整性受损,造成精子质量下降,影响雄性山羊繁殖性能。

Ⅳ型胶原蛋白NC1片段在精子发生及血睾屏障中作用的研究进展

在哺乳动物睾丸中,位于生精上皮基底膜附近的血睾屏障(blood-testis barrier,BTB)对精子发生至关重要。BTB由相邻的支持细胞(Sertoli细胞)连接而成,将生精上皮分为靠近基底膜的“基底室”和靠近生精小管管腔的“近腔室”,为精子发生提供了免疫屏障。Ⅳ型胶原蛋白是基底膜的重要组成成分,啮齿类动物的睾丸中Ⅳ型胶原蛋白主要是由3条α3链组成的三螺旋结构。大鼠睾丸的Ⅳ型胶原蛋白α3链C端可以水解成大小为28 ku的蛋白片段,称为C端非胶原结构域(noncollagenous domain-peptide,NC1片段)。NC1片段作为一种基底膜源性多肽在参与精子发生与维系BTB功能方面发挥了重要作用。本文通过分析、总结近期研究结果,概述Ⅳ型胶原蛋白NC1片段在睾丸中的作用及其机制,尤其是其在精子发生与BTB中作用的研究进展。

高功率微波辐射对大鼠血睾屏障的影响

目的:探讨高功率微波(HPM)辐射对血睾屏障(BTB)结构与功能的影响。方法:166只二级雄性Wistar大鼠经0、10、30、100mW/cm2HPM辐射5min,于辐射后6h,1、3、7、14d,采用镧醛(含20g/L硝酸镧,50mg/L戊二醛)心脏灌注和2%伊文思蓝(EB)尾静脉注射,经光镜、电镜和激光共聚焦显微镜(LSCM)观察BTB结构变化及硝酸镧和EB分布。结果:10～100mW/cm2HPM辐射后大鼠睾丸间质水肿伴血管充血、出血;生精小管近腔室内血浆蛋白和红细胞积聚,病变在辐射后6h出现,1～7d明显加重,范围扩大,14d有所减轻;30、100mW/cm2辐射组明显重于10mW/cm2辐射组。电镜下见各辐射组硝酸镧颗粒于近腔室内精母细胞、精子细胞和精子之间沉淀。LSCM观察见生精小管近腔室内弥散分布的EB颗粒。结论:HPM辐射可引起BTB结构破坏,通透性增加。

血睾屏障开放调节机制研究进展

血睾屏障是生精上皮中以支持细胞间的紧密连接为基础形成的结构,具有形成稳定的微环境和独特的免疫屏障,有序的开放机制保证了精子发生的顺利完成等功能。血睾屏障有序的开放是精子生成的保证,Oc-cludins,Claudins和JAMs这三种膜蛋白在调节血睾屏障的有序开放中发挥了重要作用,体内许多细胞因子和激素,如NO,TGF-β和TNF-α就是通过调节这几种蛋白的水平来调控血睾屏障的开放。尽管对血睾屏障的开放机制有了一定的认识,但目前还缺乏合适的体外模型,建立一种合适的体外模型是目前急需解决的问题。

邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯对血睾屏障完整性的损伤及机制

目的探讨邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(DEHP)破坏睾丸血睾屏障完整性的机制研究。方法将出生后60 d的SD雄鼠随机分为两组,即玉米油对照组和DEHP暴露组,DEHP的用药剂量为750 mg/kg,采用灌胃的方式给药,每天1次,连续处理30 d,并于最后1次处理后麻醉处死。HE染色观察睾丸的组织病理学改变情况;Western blot检测睾丸组织中构成血睾屏障的关键连接蛋白N-cadherin、β-catenin、occludin和connexin43(Cx43)的膜蛋白表达水平;MTT检测睾丸支持细胞(Sertoli cell)的活力,活性氧检测试剂盒检测细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成水平;Western blot检测抗氧化应激蛋白Nrf2以及p-p38的蛋白表达水平。结果与对照组相比,DEHP暴露后的睾丸曲细精管结构紊乱,管腔中可见圆形的精子细胞,精子排列失去极性;Western blot结果表明occludin和connexin43的表达明显降低,N-cadherin和β-catenin表达明显升高(P<0.05);Sertoli细胞随着DEHP暴露浓度的增加,活力显著降低,ROS生成水平明显增加,Nrf2和p-p38的蛋白表达明显增高(P<0.05)。结论 DEHP暴露可通过氧化应激激活p38 MAPK信号通路,破坏血睾屏障完整性,并最终损伤生精功能。

支持细胞骨架与血睾屏障的研究进展

血睾屏障(BTB)对精子的发生、穿越及排放有特殊的调控机制。支持细胞骨架成分与BTB有极其密切的关系。支持细胞骨架成分如微丝、微管、中间丝等及其所表达的肌动蛋白、微管蛋白、Claudins、波形蛋白、4.1蛋白家族等多种蛋白,可通过支持、黏附、信号转导和基因位点表达等对BTB的结构和功能起维持和促进作用。着重对支持细胞骨架成分所表达的各种蛋白与BTB的结构和功能的关系做进展性综述。

镉的生殖毒性与血睾屏障结构和功能的关系

镉是一种主要的重金属污染物,能够通过消化道、呼吸道等途径进入人体并在体内积累,导致多器官损害。其中镉对雄性生殖系统的毒性作用尤为复杂,严重者可导致不育。因此,通过对镉毒性机制的深入探讨,寻找对抗药物的作用靶点,已成为当前该领域研究的热点。该文针对镉对血睾屏障相关连接蛋白的影响以及可能参与其中的信号通路作一综述。

血睾屏障在精子发生中的作用

血睾屏障(blood-testis barrier,BTB)广泛存在于哺乳动物的睾丸组织中,支持细胞是曲细精管中与生精细胞相接触的唯一体细胞,其参与形成血睾屏障,可分泌多种生精细胞分化成熟所需的物质。BTB的动态开合可调控精子发生所需的营养物质、重要分子以及危害精子发生的有害毒物进入减数分裂期和分裂后期生殖细胞形态变化的近腔室,为哺乳动物的精子发生提供一个适宜的微环境。BTB还可赋予生精上皮细胞极性,参与生精细胞迁移,为生精细胞的迁移提供导向,保证了生精细胞在曲细精管内迁移方向的正确性,同时还能阻止自身对精子抗原产生的自体免疫反应。因而血睾屏障对于精子发生具有极为重要的作用,本文就血睾屏障在精子发生中的作用及机制做一综述,为今后从血睾屏障方面调控男性不育的预防及控制提供线索。

微波对大鼠血睾屏障影响的近期和远期效应观察

本实验在一次性微波照射大鼠睾丸后(采用谐振腔式辐射头照射,功率6～8W,睾丸表面温度保持在41～43℃之间,时间25分钟),用硝酸镧和氯化锂示踪,经电镜和光镜观察了大鼠急性期和恢复期的血睾屏障及支持细胞,并结合光镜观察,经多次(14～176次)微波照射(加温睾丸表面温度达40～43℃,时间30分钟)后恢复期的人睾丸组织的血睾屏障.结果发现大部分曲细精管中,血睾屏障的通透性未见明显改变,但有部分曲线精管中示踪剂进入近腔小室,显示出血睾屏障的局灶性损伤.此外还发现支持细胞的超结构有明显改变.

Rab13通过影响PKA活性调节occludin及F-actin在大鼠血睾屏障的分布

目的探讨Rab13-PKA通路对大鼠血睾屏障功能的调节。方法首先构建靶向大鼠Rab13的shRNA载体,通过大鼠睾丸内注射转染Rab13 shRNA,Western印迹检测Rab13体内沉默效果及沉默后BTB相关连接蛋白表达改变,放射自显影检测睾丸组织内PKA活性变化,睾丸组织冰冻切片免疫荧光染色及鬼笔环肽染色分别观察occludin及肌动蛋白丝在生精上皮的分布。结果 Rab13 shRNA睾丸内转染后Rab13表达量与对照shRNA转染相比下降约70%(P<0.01),而BTB相关连接蛋白表达无变化;Rab13沉默后PKA活性与对照组相比有明显升高(P<0.01);免疫荧光结果表明,Rab13沉默后occludin在VIII期生精上皮的分布显著高于对照组,而在其他期别生精上皮中则无显著变化;鬼笔环肽染色显示Rab13沉默后F-actin在BTB处的分布明显增强;此外,occludin及F-actin的分布变化可被PKA抑制剂H89所拮抗。结论 Rab13可通过影响PKA活性调节大鼠BTB紧密连接蛋白occludin及F-actin的分布,从而参与调节BTB功能。

大鼠血睾屏障形成初期细丝蛋白A对肌动蛋白丝排布的影响

目的根据肌动蛋白丝(F-actin)在血睾屏障(BTB)形成与变化过程中发挥的作用,初步探讨细丝蛋白A(FLNA)在大鼠血睾屏障形成初期对F-actin排布的影响。方法 Western印迹检测FLNA在大鼠睾丸、支持细胞及精子中的表达;免疫荧光染色观察FLNA与F-actin在20d龄大鼠生精上皮中的共定位;体外无血清体系分离培养大鼠睾丸支持细胞,待细胞连接形成后通过siRNA干扰沉默FLNA的表达,鬼笔环肽染色观察F-actin的分布定位;睾丸内siRNA注射,观察FLNA对血睾屏障形成时F-actin分布的影响。结果 FLNA在20d龄大鼠主要由支持细胞表达,体外siRNA沉默FLNA的效率可达70%以上,在体外支持细胞连接形成及体内屏障形成过程中,FLNA沉默组的F-actin与对照组相比排列紊乱、无序。结论 FLNA参与调节大鼠血睾屏障形成初期FLNA的排布。

雌激素对青春期大鼠Sertoli细胞及血睾屏障的影响

目的:研究在Sertoli细胞分化和成熟阶段,外源性雌激素对Sertoli细胞FasL表达以及血睾屏障的影响,进一步讨论影响血睾屏障的相关因素及其可能机制。方法:体内体外分别给与青春期SD大鼠大剂量的雌激素(二乙烯雌酚和雌二醇),运用免疫荧光方法和Western印迹观察Sertoli细胞内FasL的表达以及电镜下血睾屏障结构的变化。结果:外源性大剂量雌激素作用下,Sertoli细胞内FasL表达量明显增强(P<0.05);同时出现Sertoli细胞膜和生精上皮血睾屏障部位FasL的表达量上升;在18d实验组,电镜显示示踪剂镧透过血睾屏障,到达生精上皮全层。结论:外源性大剂量雌激素能使Sertoli细胞内FasL的表达量和分布区域发生改变并影响血睾屏障的结构。

睾丸支持细胞发育与血睾屏障形成的微观结构

为探明睾丸发育过程中支持细胞发育和血睾屏障形成的形态学变化,以期为猪血睾屏障和雄性生殖细胞的研究和应用提供理论依据,试验选取7,30,60,70,90,110日龄的民猪睾丸,制做光镜和电镜的组织学切片,并对切片进行免疫荧光染色。结果表明:民猪7日龄时支持细胞生长在曲细精管管壁内的基膜上。随着日龄的增加,生殖细胞向基膜迁移,将支持细胞推向管腔中心侧。民猪60日龄时生殖细胞和支持细胞镶嵌排列,支持细胞的细胞质特别发达,细胞质相连,开始形成血睾屏障。民猪70日龄时管腔中央充满支持细胞的细胞质,细胞质相连。90日龄时支持细胞的细胞质内附着大量的初级精母细胞和精细胞,生殖细胞之间存在支持细胞的连接。民猪110日龄时管腔内出现变形的精子。说明民猪支持细胞血睾屏障的形成在60~90日龄之间,90日龄之后血睾屏障已经具备了完整的功能,能够支持精子发生。

增龄对大鼠睾丸自噬水平和血睾屏障完整性的影响

目的探究增龄过程中大鼠睾丸自噬水平的变化及其对血睾屏障的影响。方法HE染色法观察6、12、18和24月龄SD♂大鼠睾丸组织形态学的变化。Western blot法检测各组大鼠睾丸自噬相关蛋白Beclin1、ATG5、ATG7和LC3Ⅱ,以及血睾屏障相关蛋白Occludin和β-catenin的表达水平变化。免疫荧光法检测睾丸自噬相关蛋白Beclin1和LC3,以及血睾屏障相关蛋白β-catenin的蛋白表达及定位。结果HE染色观察发现,增龄过程中大鼠睾丸组织形态结构发生明显变化,生精小管萎缩,生精细胞层数减少,细胞间间隙增大,且发生部分脱落现象;Western blot结果显示,增龄过程中大鼠睾丸自噬相关蛋白Beclin1、ATG5、ATG7和LC3Ⅱ,以及Occludin和β-catenin表达水平均逐渐下降;免疫荧光结果显示,增龄过程中大鼠睾丸生精小管上皮细胞中Beclin1和LC3蛋白表达逐渐下调,并且血睾屏障标志蛋白β-catenin表达也逐渐下降。结论增龄过程中大鼠睾丸生精功能减退,其机制与睾丸生精上皮细胞自噬水平下降,进而破坏血睾屏障的完整性有关。

“菟丝子-枸杞子”药对修复生精功能障碍大鼠血睾屏障的机制研究

目的观察"菟丝子-枸杞子"药对对雷公藤多苷(GTW)诱导的生精障碍大鼠模型血睾屏障的影响,初步探讨其改善模型大鼠生殖功能的机理。方法将56只SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组和药对组。以GTW 40mg/(kg·d)灌胃4周构建SD大鼠生精障碍模型,成模后阳性对照组每日给予左卡尼汀悬液[0.2g/(kg·d)]灌胃,药对组每日给予菟丝子-枸杞子悬液[6g/(kg·d)]灌胃,治疗4周后检测各组大鼠的精子质量、生殖激素和抑制素B、附睾肉毒碱,观察支持细胞形态,并采用Western blot检测睾丸组织血睾屏障相关蛋白的表达,分析比较不同组间的差异。结果药对组大鼠精子浓度[(39.17±13.75)×10~6/mL]高于模型对照组[(28.23±8.05)×10~6/mL],其差异具有统计学意义(P<0.05)。药对组[(29.92±5.25)%]和左卡尼汀组精子活动率[(29.31±6.33)%]均显著高于模型对照组大鼠[(20.13±6.63)%],其差异具有统计学意义(P<0.01);药对组和左卡尼汀组大鼠卵泡生成素(FSH)、黄体生成素(LH)和泌乳素(PRL)与模型对照组相比均显著降低,附睾肉毒碱含量显著升高,其差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。药对组与模型对照组比较,支持细胞结构和形态改善,生精小管结构、排列较为正常,生精细胞明显增多,形态改善;药对组Occludin、ZO-1和connexin 43的蛋白表达比模型对照组显著增多,其差异具有统计学意义(P<0.05);β-catenin和N-cadherin的蛋白表达也有不同程度增高,虽然未见明显差异,但增高趋势明显。结论 "菟丝子-枸杞子"药对能够有效减轻GTW造成的生精功能障碍,其机制可能与修复血睾屏障损伤有关。

Rictor/mTORC2调节小鼠睾丸血睾屏障与精子发生

目的研究Rictor/m TORC2在睾丸血睾屏障形成、睾丸发育和精子发生中的作用及相关机制。方法采用Cre-lox P重组酶系统,构建睾丸支持细胞中rictor基因敲除小鼠。比较敲除鼠和对照鼠的生殖器官外观和质量。HE染色观察睾丸和附睾的组织形态。采用流式细胞技术检测生精小管的细胞周期。采用免疫荧光技术检测增殖蛋白(Ki-67)和分离酶蛋白的表达。采用免疫组化和Western blot技术检测血睾屏障相关蛋白表达。结果相比对照鼠,敲除鼠的睾丸和附睾体积和重量都明显变小(P<0.01);敲除鼠的生精细胞中二倍体细胞显著上升(P<0.01),单倍体细胞显著下降(P<0.01),而四倍体细胞、Ki-67和分离酶蛋白无显著差异;血睾屏障相关蛋白出现严重的位置错乱,而蛋白表达量不受影响。结论睾丸支持细胞中rictor基因的正常表达,在血睾屏障结构完整性维持和功能发挥以及精子正常发生中起着至关重要作用。

血睾屏障中支持细胞间紧密连接结构和功能的研究进展

精子发生是一个十分复杂的生物学过程,牵涉到细胞水平和分子水平上不同分子及通路的调节。血睾屏障中支持细胞间紧密连接对精子发生过程中生精细胞的移行成熟至关重要。因此,揭示血睾屏障中紧密连接的动力学过程及其在重建过程中的调节机制,有利于理清精子发生的机制。本文对血睾屏障中支持细胞间紧密连接结构和功能的研究进展进行综述。

哺乳动物血睾屏障相关细胞连接及连接蛋白的研究进展

在雄性哺乳动物的睾丸中,紧密连接是血睾屏障中的主要结构,为相邻Sertoli细胞之间的一种联系,并与基部外胞质特殊结构和细胞桥粒连接共同存在。血睾屏障在生理上将生精上皮分为两个腔室:基底小室和近腔小室。基底小室内主要有精原细胞和早期精母细胞,而近腔小室有精子发生过程中各个阶段的生精细胞。前细线期精母细胞为了能够进入近腔小室必须穿过血睾屏障,该过程涉及多种分子以及相关的信号传导通路。分析目前与血睾屏障相关的细胞连接及连接蛋白的研究结果,进一步探讨这些细胞连接及连接蛋白对前细线期精母细胞穿越血睾屏障过程的作用。

金鱼精巢支持细胞间连接和血睾屏障

本文主要采用冷冻断裂-蚀刻方法,同时结合超薄切片和镧标记实验,研究金鱼精巢内的支持细胞间连接特点及血-睾屏障的形成。结果发现:1)金鱼精巢内支持细胞间连接呈紧密连接、桥粒和间隙连接同时存在的形式。2)各种连接的数量、面积、分布密度会随着小囊内生精细胞的发育而改变。3)紧密连接在精子发生过程的各个阶段都存在,但在形态上表现为Ⅰ型和Ⅱ型两种。4)血-睾屏障是在粗线期精母细胞期后形成,它是Ⅰ型紧密连接发育为Ⅱ型紧密连接的结果。