人血管内皮抑制素在毕赤酵母中的表达纯化及活性测定

血管内皮抑制素是胶原ⅩⅧ C-末端的一个片段,是有效的血管生成抑制因子。克隆了人血管内皮抑制素的基因,并用毕赤酵母进行表达,表达量为50．5 mg／L。发酵液上清经SP Sepharose Fast Flow凝胶一步层析,产物纯度达到98％以上,纯化收率达到95％以上。毕赤酵母分泌表达的人血管内皮抑制素具有免疫活性,能明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生长,并且能特异性地抑制bFGF刺激的人微血管内皮细胞的迁移,达到抑制效果为50％时所需的蛋白浓度 (IC50)为0．4μg／ml。为应用人血管内皮抑制素治疗肿瘤奠定了初步实验基础。

人血管内皮抑制素基因在毕赤甲醇酵母中的表达

对发生突变的人血管内皮抑制素基因进行了PCR修正,并将其连接到pAO815载体上,然后克隆进大肠杆菌TOP10F’中,提取质粒测序,证实序列正确。再用电激法转化毕赤甲醇酵母KM71,利用RDB平板和PCR技术筛选出阳性克隆菌落后,甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组的人血管内皮抑制素蛋白在毕赤甲醇酵母KM71中获得了有效表达。

毕赤酵母高密度发酵生产重组人内皮细胞抑制素

目的在microDCU-400发酵罐中探讨表达人血管内皮细胞抑制素(Endostatin)的毕赤酵母(GS115)工程菌株的高密度发酵条件。方法在发酵过程中,控制溶氧30%以上、温度30℃、pH5.3(生长阶段)或5.0(诱导表达阶段),在无机盐培养基中生长约18～22h后,补加50%甘油继续生长约3～5h,OD600达到450以上,开始进行甘油-甲醇混合物逐渐过渡至甲醇、甲醇浓度由低至高、8h后达到最大诱导浓度(0.08ml/min/L)的诱导方式,维持诱导约60h。离心收集上清液。利用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶标检测试剂盒检测表达产物。结果在诱导表达阶段,OD600最高达到580以上(细胞湿重达到375g/L),表达产量为27.2mg/L,高于摇瓶表达水平(16.3mg/L)。结论在15L发酵罐中成功表达了人血管内皮细胞抑制素,为进一步大批量生产作了准备。

vasostatin在毕赤酵母中的表达及其抗血管生成的研究

目的:用酵母表达系统表达具有生物活性的vasostatin,并检测其抗血管生成活性。方法:将vasostatin基因克隆入酵母诱导型表达载体pPIC9K中,经过SacⅠ线性化、电转化毕赤酵母蛋白酶缺陷菌株Pichiapastoris KM17、筛选阳性克隆、PCR鉴定和DNA序列分析,获得了vasostatin基因重组到酵母染色体中的阳性重组子,阳性重组子经甲醇诱导和分离纯化,获得了重组vasostatin蛋白,CAM实验检测重组蛋白抑制血管新生活性。结果:酵母表达的重组vasostatin产量达12 mg.L-1,CAM实验表明重组vasostatin能够显著抑制新生血管生成。结论:酵母表达系统能高效表达具有抑制新生血管生成活性的重组vasostatin蛋白。