hVEGF_(165)和嵌合水蛭肽融合基因的构建、表达和活性检测

根据抗PTCA或支架后再狭窄的基因治疗需要多基因治疗的特点,用基因重组技术构建了hVEGF165和嵌合水蛭肽(fusedhirudin,FH)融合基因,并克隆到真核表达载体pcDNA3.0中,通过脂质体介导将pcDNA3.0/hVEGF165-FH转染到人内皮细胞株(ECV304)中,RT-PCR及蛋白质印迹证明融合基因hVEGF165-FH在ECV304细胞中得到表达(分子质量为24ku左右).通过体外活性检测——MTT法检测hVEGF165-FH对ECV304细胞增殖的影响,通过体外血管生成分析hVEGF165-FH对内皮细胞株ECV304增殖的影响.通过体外抗栓活性检测,表明表达产物具有促进内皮细胞株增殖及加快血管生成的作用,同时显著抑制了ADP诱导的血小板聚集率(P<0.05)并显著延长APTT和TT(P<0.05).实验结果表明,融合基因在内皮细胞株中得到表达,表达的融合蛋白具有hVEGF165和嵌合水蛭肽(FH)的双重活性,这为以后的融合基因治疗再狭窄的动物实验打下了良好基础.