微血管内皮细胞来源的外泌体对血管性痴呆模型小鼠脑血管形成及神经损伤的作用研究

目的:探究微血管内皮细胞来源的外泌体对血管性痴呆(VD)模型小鼠脑血管形及神经损伤修复的影响。方法:采用超高速离心法提取小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3的外泌体,透射电子显微镜(TEM)观察外泌体形态,纳米颗粒追踪分析(NTA)测定外泌体径粒分布情况,蛋白质免疫印迹法(Western Blot)测定外泌体标志蛋白CD 63、TSG101、Alix表达;将40只小鼠按照随机数字表法分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、外泌体(b-Exo)组、阳性对照(DP)组,每组10只,除假手术组,其余3组小鼠均采用双侧颈总动脉缩窄法构建VD模型,b-Exo组腹腔注射100μL的b-Exo(100μg/mL),DP组腹腔注射盐酸多奈哌齐(1 mg/kg),假手术组和模型组腹腔注射等体积生理盐水,每日1次,持续28 d;Morris水迷宫行为学实验分析小鼠学习记忆能力,苏木精-伊红(HE)染色法观察小鼠海马组织病理学变化,免疫荧光染色检测小鼠脑组织血管形成情况,Western Blot检测小鼠海马组织中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达水平,免疫荧光染色检测小鼠海马组织中神经元特异核蛋白(NeuN)表达,酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清脑损伤相关因子星形胶质源性蛋白(S-100β)与神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平。结果:从bEnd.3细胞分离的颗粒物呈圆形囊泡状,CD 63、TSG101及Alix蛋白均高表达,说明该颗粒物为外泌体,记为b-Exo;与假手术组比较,模型组小鼠逃避潜伏期延长,通过目标象限次数和在目标象限停留时间百分比减少,海马CA1区神经元细胞数量减少,出现明显病理学损伤,血管形成减少,VEGF蛋白相对表达量下调,NeuN表达减少,血清S-100β与NSE水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,b-Exo组和DP组小鼠逃避潜伏期缩短,通过目标象限次数和在目标象限停留时间百分比增加,海马CA1区损伤明显减轻,神经元细胞数量有所增加,血管形成增加,VEGF蛋白相对表达量上调(P<0.05),NeuN表达增加,同时,血清中S-100β与NSE水平降低(P<0.05)。结论:微血管内皮细胞来源的外泌体能明显促进VD小鼠的血管形成,并修复神经损伤,对VD小鼠起到治疗作用。

锶离子外泌体促间充质干细胞成骨分化和内皮细胞血管生成的实验研究

目的:探究锶离子诱导间充质干细胞(MSC)分泌的外泌体(以下简称为锶离子外泌体)对成骨分化和血管生成功能的影响。方法:向骨髓间充质干细胞(BMSC)中加入锶离子并通过超速离心法提取锶离子外泌体,以未经处理的BMSC外泌体作为对照。通过外泌体荧光标记观察其细胞内化作用;采用碱性磷酸酶(ALP)染色、ALP活性测定、实时荧光定量PCR等实验探究分离的外泌体对BMSC成骨分化的影响;采用细胞划痕实验、迁移实验、内皮细胞成管实验等方法评价外泌体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外血管形成能力的调控作用;利用miRNA测序探讨锶离子外泌体促进成骨和成血管作用的潜在分子机制。结果:锶离子刺激不会影响BMSC分泌外泌体,且分泌的锶离子外泌体可以被BMSC摄取内化,与对照组外泌体相比,锶离子外泌体可以增强BMSC的ALP活性(P<0.05),上调其ALP和Runt相关转录因子2(Runx2)的转录(P<0.05);同时锶离子外泌体可以促进HUVEC细胞迁移和小管形成(P<0.05),并提高血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素1(ANG1)和成纤维细胞生长因子(FGF)的转录(P<0.05);外泌体miRNA测序发现锶离子刺激会引起BMSC外泌体内miRNA的差异性表达,差异表达的miR-125b-5p、miR-132-3p、miR-31a-5p以及miR-450b可能参与锶离子外泌体促成骨和成血管的功能发挥。结论:锶离子诱导MSC分泌的外泌体具有促进成骨分化和血管生成的双重功能。

人脐带间充质干细胞来源的外泌体调控血管内皮生长因子对小鼠胫骨骨折的修复作用研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(huc-MSC)来源外泌体(Exo)对小鼠胫骨骨折的修复作用及可能机制。方法于2018年12月至2022年1月,体外分离、培养hucMSCs,超速离心法收集Exo并鉴定。24只8周龄雄性C57BL/6J小鼠行胫骨骨折,并采用随机数字表法分为模型对照组、磷酸缓冲盐溶液(PBS)对照组及huc-MSC-Exo组,每组各8只,其中huc-MSC-Exo组小鼠骨髓腔内注射huc-MSC-Exo(100μg溶解于100μL PBS),PBS对照组小鼠注射等量PBS,模型对照组小鼠不进行处理。21 d后,X线观察骨折愈合情况;双能X线检测骨矿物质密度(BMD);苏木精-伊红(HE)染色观察胫骨组织学变化;免疫组织化学染色检测骨折区骨组织中血管内皮生长因子A(VEGFA)阳性表达情况;蛋白质印迹法检测骨折区骨组织中VEGFA、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨形成蛋白2(BMP-2)和骨桥蛋白(OPN)蛋白表达水平。结果经鉴定,成功提取huc-MSC-Exo;模型对照组和PBS对照组小鼠胫骨骨折断端明显、骨膜增厚,骨折带的两侧可见大量未分化的间充质细胞及部分软骨细胞,骨痂的软骨内骨区域软骨细胞形态肥大,而huc-MSC-Exo组小鼠胫骨骨折区愈合明显,外侧骨皮质连续性良好,部分软骨细胞已被吸收,膜内成骨区域出现骨痂;另与模型对照组(VEGFA 0.23±0.02)比较,PBS对照组(VEGFA 0.24±0.02)无明显变化(P>0.05),huc-MSC-Exo组小鼠胫骨骨折断端恢复良好,骨折线基本消失,同时骨折愈合评分、BMD、VEGFA IRS评分、VEGFA(0.48±0.04)、RUNX2、BMP-2和OPN蛋白相对表达水平均升高(P<0.05)。结论huc-MSC-Exo可加快小鼠胫骨骨折修复,其作用机制可能与提高VEGFA表达水平,促进血管生成有关。

宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向TJP1调控血管内皮细胞层通透性促癌细胞转移的分子机制研究

目的探讨宫颈癌细胞分泌的外泌体miR-191-5p对血管内皮细胞层的通透性影响,为肿瘤血管相关的基因靶点研究提供理论依据。方法提取并鉴定宫颈癌细胞(SiHa/HeLa)培养上清来源的外泌体。将宫颈癌细胞源外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养,检测外泌体的摄取。跨内皮电阻(TEER)测定HUVEC单层细胞形成时间。内皮细胞层通透性测定HUVEC细胞层通透性。qRT-PCR检测宫颈癌细胞、外泌体及与外泌体共培养48 h的HUVEC中miR-191-5p表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-191-5p与TJP1的靶向关系。qRT-PCR、Western blot检测miR-191-5p、TJP1表达。内皮细胞层穿透实验检测miR-191-5p对HUVEC细胞层通透性的影响以及能否促进宫颈癌转移。恢复实验、qRT-PCR、Western blot检测TJP1的表达。结果提取的微小囊泡确是宫颈癌源外泌体。宫颈癌源外泌体可被HUVEC细胞摄取。TEER随时间增加而增大,在培养3 d时细胞形成单层,TEER达到最大值;外泌体共培养的HUVEC细胞层通透性增大,差异有统计学意义(P<0.0001)。miR-191-5p在宫颈癌源外泌体中富集,并被转运至HUVEC细胞中,miR-191-5p与TJP1存在靶向关系。与PBS组比较,miR-191-5p mimics组的miR-191-5p相对表达水平升高,TJP1的相对表达水平下降,而miR-191-5p inhibitor组的miR-191-5p相对表达水平下降,TJP1的相对表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01);与PBS组比较,miR-191-5p mimics组通透性增加,而miR-191-5p inhibitor组通透性减弱,差异有统计学意义(P<0.0001)。在SiHa细胞中,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组穿透的平均细胞数增加,miR-191-5p inhibitor组穿透的平均细胞数下降,差异有统计学意义(P<0.05)。在HeLa细胞中,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组穿透的平均细胞数增加,miR-191-5p inhibitor组穿透的平均细胞数下降,差异有统计学意义(P<0.05)。恢复实验结果显示,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组TJP1的相对表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-191-5p mimics组比较,pCMV-T+mimics组中TJP1的表达量增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向调控TJP1导致血管内皮细胞层通透性增加,进而促进宫颈癌细胞转移。

M2型巨噬细胞来源外泌体对食管癌细胞生长行为及人脐静脉血管内皮细胞血管生成的影响

目的探讨M2型巨噬细胞来源的外泌体(Exo)对食管癌细胞生长及人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)血管生成的影响。方法采用佛波酯(PMA)和白细胞介素(IL)-4将人单核细胞系THP1细胞诱导为M2型巨噬细胞,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测巨噬细胞相关基因肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、重组人精氨酸酶(Arg)1、转化生长因子(TGF)-β及CD206的表达变化;超速离心法分离M2型巨噬细胞来源的Exo,透射电镜观察形态,粒径分析仪检测粒径分布,Western印迹法检测Exo标志蛋白表达;利用PKH67标记Exo后再与食管癌细胞株EC9706共培养,细胞免疫荧光染色检测Exo被EC9706细胞摄取情况;将分离的Exo与EC9706细胞共培养,CCK-8法和EdU染色检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞迁移与侵袭,细胞成管实验检测HUVEC血管生成情况。结果经PMA和IL-4诱导后的细胞内M1型巨噬细胞相关基因TNF-α、IL-6和iNOS的mRNA表达水平显著下调(P<0.05),M2型巨噬细胞相关基因Arg1、TGF-β和CD206的mRNA表达水平均显著上调(P<0.05);分离的颗粒物为直径100 nm的典型球状小囊泡,Exo标志蛋白CD9、CD63和TSG101均高水平表达,由此说明成功分离到M2型巨噬细胞来源的Exo,且该Exo可被EC9706细胞摄取;将EC9706细胞与M2型巨噬细胞来源的Exo共培养后,细胞增殖活性显著升高(P<0.05),EdU阳性细胞数显著增加(P<0.05),细胞的迁移数目与侵袭数目均显著增加(P<0.05),此外,HUVEC的血管生成能力显著提高(P<0.05)。结论M2型巨噬细胞可通过Exo途径促进食管癌细胞的生长,并促进肿瘤血管的形成。

海马干细胞来源的外泌体对血管性痴呆大鼠学习记忆能力改善作用及其机制探究

目的分析海马干细胞来源的外泌体对血管性痴呆大鼠学习记忆能力改善作用及其机制。方法取新生SD大鼠海马组织,提取海马干细胞外泌体。成年特殊清洁级(SPF)健康雄性SD大鼠90只,随机分为假手术组、模型组及外泌体组,每组30只,检测各组大鼠学习记忆能力、氧化应激因子水平、海马组织病理学变化、海马组织因子、脑微血管密度以及凋亡相关因子变化。结果透射显微镜观察到海马干细胞来源外泌体结构呈圆形或椭圆形杯状结构的小囊泡,其结构完整,直径50~100 nm之间;特异性标记蛋白CD9、CD63表达阳性。与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期及错误次数明显延长,平台区域探索时间及有效区停留时间明显缩短,MDA、AchE、ET-1、VEGF、Bax水平均明显升高,SOD、5-HT、Bcl-2水平均明显降低,脑微血管内皮细胞明显减少(P<0.05);与模型组对比,外泌体组大鼠逃避潜伏期明显缩短,平台区域探索时间及有效区停留时间明显延长,MDA、AchE、ET-1、VEGF、Bax水平均明显降低,SOD、5-HT、Bcl-2水平均明显升高,脑微血管内皮细胞明显增多(P<0.05)。假手术组大鼠海马组织细胞排列紧密,结构清晰,大小、形态一致,且具有丰富的尼氏小体;模型组大鼠海马组织细胞排列紊乱,形态、结构不完整,尼氏小体数量明显减少;外泌体组大鼠海马组织较模型组明显改善,细胞形态较模型组明显完整,尼氏小体数量增多。结论海马干细胞来源的外泌体能够明显改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力,对海马神经元损伤起到一定的保护作用,其作用机制可能与抑制氧化应激与细胞凋亡,调控神经递质含量,促进脑微血管密度有关。

circRNA SIPA1L1修饰牙髓干细胞来源外泌体促血管生成能力的机制

目的 探究环状RNA(circRNA)信号诱导增殖相关蛋白1样蛋白1(SIPA1L1)修饰的人牙髓干细胞(hDPSC)来源外泌体(Exo)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成能力的影响及机制。方法 从牙髓组织分离培养hDPSC,将circSIPA1L1过表达质粒载体转染至hDPSC后,分离Exo并进行鉴定。将HUVEC分为对照组、hDPSC Exo组、circSIPA1L1-hDPSC Exo组,培养48 h后,Matrigel基质胶血管形成实验检测血管形成能力,qRT-PCR和Western blot测定血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)、胎盘生长因子(PGF)的表达水平。结果 从未转染的hDPSC与转染circSIPA1L1的hDPSC中成功分离出Exo,且相较于h DPSC来源的Exo,转染circSIPA1L1的hDPSC来源的Exo中circSIPA1L1相对表达量显著上调(P <0.05)。与hDPSC Exo组比较,circSIPA1L1-hDPSC Exo组HUVEC的管样结构形成数目显著增加(P <0.05),VEGF、VEGFR2、PGF mRNA与蛋白相对表达量也显著上调(P<0.05)。结论 circRNA SIPA1L1修饰hDPSC来源的Exo能够促进血管生成,其机制可能与上调VEGF、VEGFR2、PGF的表达水平有关。

内皮祖细胞外泌体中miRNA-222-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的影响

目的了解内皮祖细胞外泌体(EPCs-Exo)中的miRNA-222-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的影响。方法采用荧光染色法对C57BL/6小鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)进行鉴定。对从EPCs培养基中分离出的EPCs-Exo进行鉴定以及miRNA高通量测序。建立糖尿病小鼠皮肤损伤模型,随机分为5组:PBS组、EPCs-Exo组、空白组、agomiR-222-3p组、antagomiR-222-3p组。根据不同分组,连续处理14 d,观察创面愈合率,免疫荧光方法了解治疗前后创缘组织中活性氧(ROS)、血管内皮生长因子(VEGF)、CD31表达水平变化。结果EPCs-Exo促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合,降低创缘组织中ROS表达水平,增加VEGF、CD31表达水平(P<0.05)。高通量测序提示miRNA-222-3p在EPCs-Exo中高度表达。创缘组织局部皮下注射miRNA-222-3p可显著促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合,降低创缘组织中ROS表达水平,增加VEGF、CD31表达水平(P<0.05)。结论miRNA-222-3p促进糖尿病小鼠伤口愈合,在EPCs-Exo促进创面愈合过程中发挥重要作用。

人脐带间充质干细胞来源外泌体驱动中性粒细胞向N2促血管生成表型转换的研究

背景人脐带间充质干细胞来源外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes,HucMSCExo)已成为再生医学领域中一种应用前景广阔的治疗手段,但人们对其作用的确切机制仍知之甚少。目的探索HucMSCExo能否驱动中性粒细胞向N2促血管生成亚型转换。方法采用超速离心法分离提纯HucMSC-Exo,通过透射电镜、粒径分析和Western blot对提取的外泌体进行鉴定。成功分离HucMSC-Exo后与中性粒细胞共培养,利用qRT-PCR检测中性粒细胞的表型相关分子表达情况。将接受HucMSC-Exo刺激的中性粒细胞与血管内皮细胞进行细胞共培养,通过CCK-8实验、Edu实验、划痕实验和Transwell实验观察中性粒细胞对血管内皮细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响,采用qRT-PCR分析中性粒细胞在接受HucMSC-Exo刺激后,血管生成相关基因的表达变化。结果提取物在透射电镜下显示为类圆形膜状结构,直径约100 nm,能够表达外泌体标记物CD9和Alix,表明提取物为HucMSC-Exo。与PBS处理组相比,HucMSC-Exo处理中性粒细胞后,qRT-PCR发现与N2表型相关的标志物Arg1、CD163和CD206的表达增多(P<0.05)。将HucMSCExo刺激的中性粒细胞与血管内皮细胞进行细胞共培养处理后,通过CCK-8实验、Edu实验、划痕实验和Transwell实验观察到血管内皮细胞的增殖、迁移和侵袭能力均增强(P<0.05)。与PBS处理组相比,中性粒细胞在接受HucMSC-Exo刺激后,促血管生成因子BV8、VEGFα表达升高(P<0.05)。结论HucMSC-Exo可使中性粒细胞向N2表型转换,这种N2型中性粒细胞可促进血管内皮细胞增殖、迁移和侵袭。

心肌细胞来源的外泌体在心血管疾病中的研究进展

心肌损伤后心肌组织自我修复能力降低,限制了其再生与修复,目前尚无理想的心肌损伤治疗药物。几乎所有的细胞均分泌外泌体,外泌体可将蛋白质、信使RNA、微RNA等生物活性分子转运至受体细胞,并通过多种信息分子传递细胞信号,介导各种病理生理过程。近年来,外泌体在心血管疾病中的生理病理作用备受关注,深入研究心肌细胞来源的外泌体的生物发生、分离技术、生物标志物及其在心血管疾病诊疗中的作用,可以为相关疾病的治疗提供新思路。

中性粒细胞胞外诱捕网通过激活NLRP3炎症小体诱导人肺微血管内皮细胞焦亡

目的探讨中性粒细胞胞外诱捕网作用于肺微血管内皮细胞并诱发内皮细胞死亡的具体机制。方法以200 ng/mL的体外分离的中性粒细胞胞外诱捕网刺激人肺微血管内皮细胞,碘化丙锭染色法检测细胞死亡情况,蛋白质印迹法和免疫荧光法检测焦亡标记物。结果与对照组相比,中性粒细胞胞外诱捕网刺激后的肺微血管内皮细胞死亡加剧,NLRP3炎症小体和焦亡相关标记物GSDMD、N-GSDMD表达明显升高,NLRP3抑制剂MCC950预处理可有效减弱NLRP3的激活,抑制细胞焦亡的发生。结论中性粒细胞胞外诱捕网可通过激活NLRP3炎症小体诱发人肺微血管内皮细胞焦亡。

骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

电针血清外泌体促进缺氧诱导的人脐静脉血管内皮细胞血管新生的研究

目的:观察电针血清外泌体对缺氧诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)血管新生的影响,探讨电针血清促进脑缺血后血管新生的作用机制。方法:建立改良的急性局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,在造模成功后5 min大鼠的“人中(Du26)”和“百会(Du20)”穴进行针刺干预。将HUVECs分为对照组、模型组、电针外泌体组、miR-210模拟物组、miR-210抑制剂组与HIF-lα抑制剂组。采用流式细胞术、CCK-8法检测各组细胞凋亡和增殖情况,Matrigel基质胶实验观察血管生成能力,Western bolt和qPCR检测各组HIF-1α、VEGF、Notch 1、CD34和miR-210的表达水平。结果:与模型组比较,电针外泌体和miR-210模拟物均可显著抑制缺血缺氧诱导后的HUVECs细胞凋亡,并促进细胞增殖及细胞迁移,而miR-210抑制剂显著抑制了电针外泌体作用后的细胞增殖和迁移数量。此外,电针外泌体与miR-210模拟物进一步提高了缺氧缺血后HIF-1α、VEGF和Notch 1的水平,miR-210抑制剂与HIF-lα抑制剂逆转电针外泌体诱导的HIF-1α、VEGF和Notch 1的高表达。结论:电针抗脑缺血后的作用机制可能是通过调控外泌体miR-210介导的HIF-1/VEGF/Notch信号通路以促进缺氧缺血后的血管新生。

骨髓间充质干细胞外泌体联合茶多酚治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤

背景:研究表明,抑制内质网应激所致的细胞凋亡能够挽救神经部分功能。茶多酚能抑制内质网应激,但是存在生物利用率差不易透血脑屏障等问题,结合外泌体靶向脊髓修复及高效载药,理论上两者结合能够发挥更优的脊髓保护效能。目的:探讨茶多酚联合骨髓间充质干细胞外泌体对脊髓缺血再灌注损伤大鼠神经功能及内质网应激的影响。方法:SD雄性大鼠50只,随机分为假手术组、模型组、茶多酚组、外泌体组、联合治疗组,每组10只,除假手术组外,其余4组制作脊髓缺血再灌注损伤模型,术后2 h经尾静脉注射生理盐水、外泌体、茶多酚、茶多酚+骨髓间充质干细胞外泌体混合液;脊髓损伤后7,14,28 d进行BBB神经功能评分,脊髓损伤后14 d,取脊髓组织进行苏木精-伊红染色、尼氏染色、ATF6和GADD153内质网应激标志物免疫荧光染色。结果与结论:①神经功能评分:与假手术组比较,模型组、外泌体组、茶多酚组、联合治疗组神经功能评分均不同程度下降,术后14 d联合治疗组神经功能评分优于茶多酚组、外泌体组、模型组(P<0.05),术后28 d后联合治疗组神经功能评分优于模型组和茶多酚组(P<0.05);②苏木精-伊红染色和尼氏染色显示:模型组大鼠神经元细胞数量减少,脊髓损伤区域内大量空洞坏死及瘢痕增生,茶多酚组、外泌体组、联合治疗组神经元数量和周边空洞坏死有不同程度改善,联合治疗组改善最为明显;③内质网应激相关蛋白ATF6、GADD153表达:术后14 d联合治疗组GADD153表达低于模型组和茶多酚组(P<0.05),联合治疗组ATF6表达低于模型组、外泌体组和茶多酚组(P<0.05);④结果表明:茶多酚联合骨髓间充质干细胞外泌体能改善脊髓缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,可能与抑制内质网应激相关蛋白ATF6、GADD153表达有关。

食管鳞状细胞癌外泌体miR-181b-5p通过靶向抑制PTEN促进肿瘤相关巨噬细胞极化

目的:探究食管鳞状细胞癌外泌体miR-181b-5p对M2型巨噬细胞极化的影响及机制。方法:提取并鉴定食管鳞状细胞癌外泌体,qRT-PCR检测miR-181b-5p在食管鳞状癌细胞及其外泌体中的表达。M0型巨噬细胞分为PBS组、HEEC exo组、Eca-109 exo组、miR-NC exo组、miR-181b-5p exo组、miR-NC组、miR-181b-5p mimic组、si-NC组、si-PTEN组、miR-181b-5p exo+PTEN组,qRT-PCR检测各组细胞中CD163、CD206、iNOS、TNF-α表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-181b-5p和PTEN的靶向关系。结果:miR-181b-5p在食管鳞状癌细胞TE-13、TE-12、TE-10、Eca-109、KYSE30及其外泌体中显著高表达(P<0.001)。相比于miR-NC组,miR-181b-5p mimic组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。双荧光素酶报告基因结果显示PTEN为miR-181b-5p的靶基因。相比于si-NC组,si-PTEN组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于PBS组,Eca-109 exo组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于miR-NC exo组,miR-181b-5p exo组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于miR-181b-5p exo组,miR-181b-5p exo+PTEN组CD163和CD206表达显著下调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著上调(P<0.001)。结论:外泌体miR-181b-5p抑制PTEN表达而促进M2型巨噬细胞极化。

基于“亢害承制”理论探讨巨噬细胞外泌体在慢性心力衰竭发展中的作用

巨噬细胞外泌体影响心脏炎症微环境,在慢性心力衰竭病程中发挥了关键作用。“亢害承制”理论是中医认识人体生克制化、病理失衡及指导辨证施治的重要法则。本文基于“亢害承制”理论,从理论依据、发病机制、病理生理联系及现代研究方面阐述巨噬细胞外泌体在慢性心力衰竭发展中的作用,提出运用“扶正调平,祛邪除亢”法治疗慢性心力衰竭,通过调控巨噬细胞外泌体减轻心脏炎症反应,以期为慢性心力衰竭的诊治提供新思路。

丹参活性成分调控人肺腺癌A549细胞外泌体miRNA的变化及外泌体对HUVEC的作用

目的:检测隐丹参酮、丹参酮IIA对人肺腺癌A549细胞分泌的外泌体中内源性非编码小RNA(microRNA,miRNA)的差异表达情况。观察外泌体对HUVEC细胞的作用,并初步探索其作用机制。方法:取对数生长期的A549细胞,分别以隐丹参酮6μg/mL及丹参酮IIA 4μg/mL给药,用无血清的培养基培养24小时后,细胞上清液按照说明书提取外泌体。采用高通量测序技术,检测各组A549细胞中miRNA的表达情况,对外泌体中hsa-miR-1246进行验证,对获得的差异基因进行GO和KEGG分析。以各组外泌体加入HUVEC细胞中,并采用CCK-8实验和划痕实验,分别检测各组外泌体对HUVEC细胞的抑制作用和迁移作用,检测HUVEC细胞中CD31的基因和蛋白表达。结果:高通筛选结果发现隐丹参酮能够上调109个miRNA,下调78个miRNA;丹参酮IIA能够上调35个miRNA,下调40个miRNA。将有差异的miRNA进行功能与通路的富集分析,显示隐丹参酮、丹参酮IIA差异表达基因主要与内吞作用、癌症通路、MAPK信号通路、hippo信号通路、Wnt信号通路、癌症中的microRNAs、Rap1信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调节等相关。细胞增殖实验发现,空白外泌体和隐丹参酮外泌体对HUVEC细胞的增殖均具有显著的抑制作用,且隐丹参酮外泌体的抑制作用明显高于空白外泌体。细胞划痕实验发现,外泌体给药后,迁移率均有显著下降,外泌体作用48 h后,隐丹参酮外泌体和丹参酮IIA外泌体作用后HUVEC的迁移率均显著低于空白外泌体。隐丹参酮处理后的A549细胞外泌体中hsa-miR-1246显著升高,而隐丹参酮外泌体作用后的HUVEC细胞中CD31的基因和蛋白的表达显著降低。结论:隐丹参酮、丹参酮IIA对A549细胞外泌体中miRNA有一定的调控作用,且富集分析与多个癌症有关信号通路相关。隐丹参酮、丹参酮IIA处理下的A549细胞外泌体对HUVEC有抑制作用,进一步从外泌体角度探析隐丹参酮及丹参酮IIA抑制血管内皮细胞增殖可能的作用机制,旨在为肺癌的治疗策略提供新的思路。

高、低表达miR-296-5p的肿瘤细胞外泌体对食管鳞癌细胞迁移和侵袭的调控作用

目的探讨高、低表达miR-296-5p的肿瘤细胞外泌体对食管鳞癌细胞(ESCC)迁移和侵袭的调控作用及其机制。方法提取转染miR-296-5p过表达和miR-296-5p干扰及其阴性对照物(NC)后的ESCC细胞外泌体,并采用透射电镜与Western blotting法进行鉴定;将ESCC细胞分为三组,干扰组、过表达组分别加入miR-296-5p干扰或过表达细胞的外泌体培养,NC组加入NC转染细胞的外泌体培养48 h;取各组细胞,MTT法检测细胞活力、Transwell法检测细胞侵袭迁移能力,RT-PCR、Western blotting法检测细胞黏附分子3(CADM3)、CADM1、CADM4、钙黏蛋白E(E-cadherin)及血管内皮细胞生成浸润相关蛋白CD31、CD44。结果细胞活力、迁移和侵袭细胞数过表达组>NC组>干扰组(P均<0.05)。细胞中CADM1、CADM4、E-cadherin基因及蛋白表达水平干扰组>NC组>过表达组,CADM3、CD31、CD44基因及蛋白表达水平过表达组>NC组>干扰组(P均<0.05)。结论高表达miR-296-5p的肿瘤细胞外泌体可能通过调控CADM、E-cadherin、CD31、CD44等基因表达提高ESCC细胞的侵袭、迁移能力。

低氧条件下食管癌来源外泌体调控巨噬细胞M2型分化与自噬的机制研究

目的:探究低氧条件下食管癌外泌体对巨噬细胞分化和自噬的影响及机制。方法:50 ng/ml PMA诱导THP-1分化为M0型巨噬细胞,超速离心法提取并鉴定HEEC、Eca-109、缺氧诱导的Eca-109细胞分泌的外泌体(记为HEEC-exo、NomEca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo),激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对外泌体的摄取,将PBS、HEEC exo、Nom-Eca-109-exo、HypoEca-109-exo分别与M0型巨噬细胞共孵育,流式细胞术检测各组细胞CD14和CD206表达,ELISA检测细胞因子IL-1β、IL-12、TNF-α、Arg1、IL-10和TGF-β,qRT-PCR检测各组细胞CCR7、TLR2、CD206和CD14表达,Transwell检测各组细胞迁移和侵袭,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62表达及PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平。结果:提取的外泌体符合结构和生物学特征。相比于PBS组,与Nom-Eca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo孵育后,各组M0型巨噬细胞CCR7、TLR2表达显著降低、CD206和CD14表达显著增加,IL-1β、IL-12、TNF-α分泌显著减少,Arg1、IL-10和TGF-β分泌显著增加,LC3-Ⅱ、Beclin-1表达显著增加,p62表达显著降低,细胞迁移和侵袭数显著增加,PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平显著升高。相比于NomEca-109-exo组,Hypo-Eca-109-exo组细胞CD206和CD14表达显著增加,Arg1、IL-10和TGF-β分泌显著增加,LC3-Ⅱ、Beclin-1表达显著增加,p62表达显著降低,细胞迁移和侵袭数显著增加,PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平显著升高。结论:低氧诱导的食管癌细胞外泌体可显著促进M2型巨噬细胞分化和自噬,进而促进肿瘤迁移和侵袭,其机制为激活PI3K/Akt/mTOR信号通路。

小肠黏膜下层脱细胞基质复合外泌体构建组织工程尿道

背景:小肠黏膜下层脱细胞基质已被临床与基础研究证实可用于尿道的修复重建,但其单独应用时存在宿主细胞生长缓慢、支架血管化不足而成活困难、重建尿道狭窄梗阻等问题,仅适用于较短的尿道狭窄。目的:探讨应用小肠黏膜下层脱细胞基质复合外泌体构建组织工程尿道的可行性。方法:从新西兰大白兔骨髓间充质干细胞中分离提取外泌体;制备猪小肠黏膜下层脱细胞基质,将外泌体负载于小肠黏膜下层脱细胞基质上。将小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体(PKH26染料标记)复合物与脐静脉内皮细胞共培养12 h,观察细胞摄取外泌体情况。选取生长状态良好的脐静脉内皮细胞,分3组培养:空白组常规培养,对照组加入小肠黏膜下层脱细胞基质,实验组加入小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物,通过划痕实验、成管实验、血管生成因子分泌检测评估血管生成情况。取30只新西兰大白兔,建立长段(3 cm)尿道缺损模型,采用随机数字表法分3组干预(n=10):单独材料组植入小肠黏膜下层脱细胞基质,对照组植入小肠黏膜下层脱细胞基质-骨髓间充质干细胞复合物,实验组植入小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体复合物,植入后12周进行尿道造影、尿动力学检查及重建尿道切片病理观察。结果与结论:(1)荧光显微镜下可见小肠黏膜下层脱细胞基质中的外泌体可被脐静脉内皮细胞摄取。(2)与空白组、对照组相比,实验组材料可促进脐静脉内皮细胞的迁移、成血管能力以及成血管因子血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、白细胞介素8的分泌(P <0.05)。(3)尿道造影结果显示,单独材料组10只兔均出现尿道狭窄,对照组10只兔中2只出现尿道狭窄,实验组10只兔均未出现尿道狭窄。尿动力检查结果显示,单独材料组兔材料植入后12周的最大尿道压高于术前(P <0.05),对照组、实验组兔植入后12周的最大尿道压均低于空白组(P <0.05)。苏木精-伊红、Masson与免疫组化染色显示,单独材料组可见明显的再生上皮层、少量的皮下平滑肌与血管,以纤维组织增生为主,伴有明显炎性细胞浸润;对照组可见较完整的再生上皮与少量胶原,可见大量的皮下血管与平滑肌,伴有炎性细胞浸润;实验组可见完整的再生上皮层与大量的皮下血管、平滑肌,未见明显炎性细胞浸润,实验组AE1/AE3、ɑ-平滑肌肌动蛋白、CD31阳性表达均高于单独材料组、对照组(P <0.05)。(4)结果表明,小肠黏膜下层脱细胞基质-外泌体组织工程尿道可通过促进血管生成来修复尿道缺损。