灯盏花对血管内皮细胞损伤大鼠Wnt/β-catenin信号通路及炎症介质的影响

目的:研究灯盏花素对血管内皮细胞损伤大鼠的保护机制及对Wnt/β-catenin信号通路的作用机制。方法:选取60只SD大鼠,随机分为健康组、模型组、灯盏花素低剂量组(BL组)、灯盏花素高剂量组(BH组),每组15只。采用苏木精-伊红(HE)染色观察血管形态;逆转录PCR测Wnt信使RNA(mRNA)、卷曲蛋白1(FZD1) mRNA、轴蛋白1(AXIN1) mRNA、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β) mRNA、β-连环素mRNA、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA;酶联免疫吸附试验测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP);显微镜观察血管内皮细胞形态;MTT测血管内皮细胞增殖;蛋白质印迹法(Western Blotting)测Wnt、FZD 1、AXIN1、GSK-3β、β-连环素、VEGF水平。结果:健康组大鼠血管内无明显改变;模型组有明显血管损伤;BL组与BH组大鼠血管损伤有所改善,且以BH组效果明显。与健康组比较,模型组血管内皮细胞间隙宽、细胞形态变小、脱落;BL组血管内皮细胞与模型组较为接近;BH组血管内皮细胞间隙变窄且凋亡减少,形态有所改善。与健康组比较,模型组Wnt、VEGF、FZD1、β-连环素、AXIN1、血管内皮细胞不同时间点OD值均降低,GSK-3β、TNF-α、CRP、血管内皮细胞凋亡率升高(P<0.05),与模型组比较,BL组与BH组Wnt、VEGF、FZD1、β-连环素、AXIN1、血管内皮细胞不同时间点OD值均升高,GSK-3β、TNF-α、CRP、血管内皮细胞凋亡率降低(P<0.05),且以BH组效果更为显著(P<0.05)。结论:灯盏花素通过调控Wnt/β-catenin信号通路表达,控制血管的稳定性,从而对血管内皮细胞损伤大鼠的起保护作用。

姜黄煎剂对血管内皮细胞损伤大鼠TNF-α及CRP的影响

目的:探讨姜黄煎剂对血管内皮细胞损伤大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)及C反应蛋白(CRP)的影响,旨在分析姜黄煎剂保护血管内皮细胞的应用价值。方法:选取90只成年雄性Wistar大鼠,随机分为对照组,建模组以及姜黄煎剂组,每组30只,建模组和姜黄煎剂组大鼠建立血管内皮损伤模型。造模成功后,姜黄煎剂组给予姜黄煎剂(剂量100 mg/kg)灌胃治疗,建模组给予生理盐水(3 mg/d),对照组不做任何处理。干预的第3、7及14天对大鼠进行采血,观察TNF-α及C反应蛋白水平变化。结果:正常血管内为单层内皮细胞,建模组大鼠和姜黄煎剂组大鼠损伤处具有内皮脱落、内膜损伤及狭窄等情况。同对照组相比,建模组和姜黄煎剂组血清中TNF-α及CRP水平显著上升(P<0.05);但姜黄煎剂组血清TNF-α及CRP升高幅度小于建模组,并且在干预的第7天及第14天TNF-α及CRP释放受抑制,明显回落,同建模组相比,P<0.05,存在显著性差异。结论:姜黄煎剂能够降低血管内皮细胞损伤大鼠TNF-α含量,减少CRP表达,具有保护血管内皮细胞功能。

常压高浓度氧对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤与Nrf2/HO-1信号通路的影响分析

目的探究常压高浓度氧(NBO)对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤及核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法取新生SD大鼠45只,采用随机数字表法分为常氧组、NBO组和NBO+Nrf2激活剂组,每组各15只。常氧组大鼠置于普通空气(21%氧气)中饲养,NBO组和NBO+Nrf2激活剂组大鼠置于90%常压氧气饲养,NBO+Nrf2激活剂组每日灌胃5 mg/kg Nrf2激动剂莱菔硫烷。测定脑组织伊文思蓝(EB)含量,采用酶联免疫法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量,干湿重法检测脑组织含水量,HE染色和TUNEL染色观察脑组织病理变化,蛋白质印迹法检测海马组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达,水迷宫检测大鼠认知功能。结果与常氧组比较,NBO组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理染色结果显示,常氧组大鼠神经细胞形态及结构完整,未见明显病理变化和细胞凋亡;NBO组神经细胞形态及结构不规则,出现明显的水肿和空泡,并伴有大量的凋亡细胞;NBO+Nrf2激活剂组脑组织病理损伤较NBO组明显减轻。与常氧组比较,NBO组脑组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与常氧组比较,NBO组第2~4天逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组第2~4天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NBO可诱导新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤,导致远期认知功能障碍,可能与下调Nrf2/HO-1信号通路表达有关。

榛蘑多糖对乙醇所致大鼠血管内皮细胞损伤的保护作用

探究榛蘑多糖对乙醇所致大鼠血管内皮细胞损伤的保护作用。将40只SD大鼠随机分成4组(正常对照组、损伤组、榛蘑多糖低剂量组、榛蘑多糖高剂量组)。除正常对照组外的其余各组均按10 mL/kg mb灌胃体积分数40%乙醇诱导血管内皮细胞损伤。榛蘑多糖低、高剂量组分别以100、400 mg/kg mb灌胃榛蘑多糖,其余组以等体积生理盐水代替,实验共进行4周。使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察颈动脉组织病理变化;检测血清甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,T-CHO)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、内皮型一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、一氧化氮(NO)、内皮素1(endothelin 1,ET-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平。此外,以600μmol/mL乙醇诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型,分析不同剂量(100、400μg/mL)榛蘑多糖对细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体跨膜电位、细胞凋亡以及凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤2(B cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和Caspase-3表达的影响。结果表明:榛蘑多糖减轻乙醇所致的血管内膜损伤,降低T-CHO、TG、LDL-C、iNOS、NO、ET-1和MDA水平,提高HDL-C和SOD活性;在体外条件下,榛蘑多糖降低细胞ROS水平,抑制乙醇所致的线粒体跨膜电位的下降和细胞凋亡,并提高Bcl-2/Bax,下调Cleaved caspase-3表达水平。综上,榛蘑多糖对乙醇诱导的大鼠血管内膜损伤有保护作用,机制可能与其降脂、抗氧化和抗凋亡作用有关。

大鼠周围神经损伤后外周血内皮祖细胞动员及相关因子含量变化

目的探讨大鼠周围神经损伤(PNI)后外周血内皮祖细胞(EPCs)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平变化及EPCs与其他指标的相关性。方法42只SD大鼠按随机数字表法分为对照组、PNI 1 d组、PNI 3 d组、PNI 5 d组、PNI 7 d组及PNI 14 d组,每组7只,除对照组外其余组均采用钳夹法建立坐骨神经损伤模型。对每组在预定时间点采用活体心脏穿刺法采血;采用Ficoll密度梯度离心法提取单个核细胞,CD34和CD133双阳性细胞标记EPCs,应用流式细胞仪检测各组EPCs数量。采用酶联免疫吸附试验检测各组外周血bFGF、VEGF及MMP-9含量,分析EPCs数量与bFGF、VEGF、MMP-9水平的相关性。结果与对照组相比,PNI 3 d组、PNI 5 d组、PNI 7 d组外周血EPCs数量升高,PNI 3 d组、PNI 5 d组、PNI 7 d组及PNI 14 d组外周血bFGF含量升高,其余各组外周血VEGF含量升高,PNI 5 d组、PNI 7 d组及PNI 14 d组外周血MMP-9含量升高(P<0.05)。PNI 5 d组和PNI 7 d组外周血EPCs数量与血清bFGF水平呈正相关(r分别为0.784和0.788,P<0.05),与血清VEGF水平呈正相关(r分别为0.889和0.852,P<0.05);PNI 5 d组、PNI 7 d组和PNI 14 d组外周血EPCs数量与血清MMP-9水平呈正相关(r分别为0.788、0.852和0.873,P<0.05)。结论EPCs与bFGF、VEGF和MMP-9共同参与了PNI后血供修复的病理生理过程。

微血管内皮细胞在脊髓损伤中的作用机制及中药干预脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种神经破坏性疾病,引起患者感觉、运动及自主神经功能障碍[1]。根据病因,SCI可以分为创伤性与非创伤性,研究[2]发现,发展中国家创伤性SCI发病率逐年下降,而其中坠落伤及老年患者占比上升,男性多于女性,且以不完全性四肢瘫多见。

银杏素调节TGF⁃β1/Smad通路对ox⁃LDL诱导血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨银杏素调节转化生长因子⁃β1(TGF⁃β1)/Smad信号通路对ox⁃LDL诱导血管内皮细胞损伤的影响。方法将人脐静脉血管内皮细胞HUVEC分为对照组(未处理的HUVEC细胞)、模型组(50μg/mL ox⁃LDL处理的HUVEC细胞)、银杏素组(50μg/mL ox⁃LDL+12.5μmol/L银杏素处理HUVEC细胞)、SRI⁃011381组(50μg/mL ox⁃LDL+10μmol/L的TGF⁃β1/Smad激活剂SRI⁃011381处理HUVEC细胞)、银杏素+SRI⁃011381组(50μg/mL ox⁃LDL+12.5μmol/L银杏素+10μmol/L的SRI⁃011381共同处理HUVEC细胞)。ELISA试剂盒检测HUVEC细胞丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、IL⁃6、IL⁃1β、TNF⁃α水平;CCK⁃8法检测HUVEC细胞增殖;流式细胞术检测HUVEC细胞凋亡率;Western blot检测细胞上皮间质转化(EMT)、TGF⁃β1/Smad通路相关蛋白表达。结果与对照组相比,模型组IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α、MDA水平、细胞凋亡率、TGF⁃β1、Smad3、神经型钙黏附蛋白(N⁃cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白水平显著增加(P<0.05),A值、GSH、SOD水平、上皮钙黏附素(E⁃cadherin)蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,银杏素组IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α、MDA水平、细胞凋亡率、TGF⁃β1、Smad3、N⁃cadherin、Vimentin蛋白水平显著下降(P<0.05),A值、GSH、SOD水平、E⁃cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05),而SRI⁃011381组趋势相反,SRI⁃011381减弱了银杏素对ox⁃LDL诱导的HUVEC细胞损伤的抑制作用。结论银杏素可能通过下调TGF⁃β1/Smad信号通路对ox⁃LDL诱导的血管内皮细胞损伤起到改善作用。

脂肪间充质干细胞外囊泡通过增加LC3B表达对人微血管内皮细胞损伤的影响

目的:探讨低氧微环境诱导下脂肪间充质干细胞(ADSCs)外囊泡(Evs)通过增加微管相关蛋白轻链3B(LC3B)表达对人微血管内皮细胞损伤的保护作用。方法:分离大鼠ADSCs,并通过成骨、成脂分化和细胞表面标志物的表达进行鉴定。利用常氧(21%O2)和低氧(1%O2)条件分别获得常氧Evs和低氧Evs,通过形态和表面标志物的表达进行鉴定。构建心肌微血管内皮细胞(CMECs)细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型,并将CMECs分为对照组(Control组)、氧糖剥夺/再灌注组(OGD/R组)、常氧Evs组(N-Evs组,给予常氧Evs培养24 h)、低氧Evs组(H-Evs组,给予低氧Evs培养24 h)、低氧Evs+自噬抑制剂组(H-Evs+3-MA组,给予低氧Evs和3-MA 5 mmol/L培养24 h)。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法、5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色、划痕实验、Transwell实验、管腔形成实验和透射电镜分别检测CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力;采用酶联免疫吸附法(Western Blot)检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki67、基质金属蛋白酶(MMP)-2/MMP-9、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、LC3B、重组人自噬效应蛋白1(Beclin1)蛋白表达。结果:与Control组比较,OGD/R组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力减弱(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少(P<0.05)。与OGD/R组比较,N-Evs组和H-Evs组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力增强(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达增加(P<0.05),且H-Evs组优于N-Evs组(P<0.05)。与H-Evs组比较,H-Evs+3-MA组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力减弱(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少(P<0.05)。结论:低氧微环境诱导下的ADSCs-Evs通过增加LC3B表达可促进OGD/R损伤CMECs的增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力。

丹参酮ⅡA对脓毒症肺微血管内皮细胞损伤的保护作用

目的探寻丹参酮ⅡA对脓毒症肺血管内皮细胞损伤的保护作用。方法采用盲肠结扎穿孔术构建脓毒症肺损伤小鼠模型,分为6组:假手术组、模型组、丹参酮1组(10 mg/kg)、丹参酮2组(30 mg/kg)、丹参酮3组(50 mg/kg)、丹参酮4组(100 mg/kg)。药物干预24 h后检测肺组织病理变化、肺微血管通透性、肺组织湿/干重比、白细胞计数以及炎症因子等各项指标,假手术组仅行盲肠探查术。结果丹参酮各组较模型组小鼠肺组织损伤及评分均减轻(P<0.05)。与模型组比较,丹参酮各组小鼠肺组织Evans Blue含量、肺组织湿/干比明显降低(P<0.05),BALF白细胞计数、蛋白含量、炎症因子明显减少(均P<0.05),且呈剂量依赖性,其中丹参酮2组、丹参酮3组和丹参酮4组之间,肺组织病理损伤、Evans Blue含量、肺组织湿/干比以及肺泡灌洗液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)。结论丹参酮ⅡA能够剂量依赖性地降低脓毒症所致的肺微血管内皮细胞损伤,从而改善肺损伤;30 mg/kg剂量的丹参酮ⅡA即可达到最佳效果。

红景天苷调控NF-κB、Bcl-2信号通路对烟雾暴露大鼠氧化应激及肺血管内皮细胞凋亡的影响

目的探究红景天苷(SDS)通过调控B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、核转录因子-κB(NF-κB)信号通路对烟雾暴露大鼠氧化应激及肺血管内皮细胞凋亡的机制。方法选取60只大鼠分为对照组、模型组、SDS 10 mg/kg、SDS 40 mg/kg、SDS 70 mg/kg、醋酸泼尼松(PNS)组,每组10只,除对照组外,其余均建立烟雾致肺损伤模型,对照组与模型组大鼠每日采用等量生理盐水灌胃;SDS高、中、低剂量组分别按70、40、10 mg/kg剂量给予SDS混悬液2 mL灌胃;PNS组给予PNS混悬液3.6 mg/kg灌胃,均每日1次,连续21 d。结果与对照组比较,模型组大鼠血清中丙二醛(MDA)、Bcl-2相关X因子(Bax)、NF-κB、p-NF-κB及细胞凋亡升高,超氧化物歧化酶(SOD)、Bcl-2降低(P<0.05);与模型组比较,SDS各剂量组MDA、Bax、NF-κB、p-NF-κB及细胞凋亡均有所降低,SOD、Bcl-2也有所升高(P<0.05),且模型组与SDS 10 mg/kg组比较无明显差异(P>0.05),SDS 40 mg/kg组与PNS组比较无明显差异(P>0.05)。对照组大鼠肺组织良好;模型组肺损伤严重;药物干预后各组肺损伤均减轻。结论SDS可改善烟雾暴露大鼠肺损伤、氧化应激及血管内皮细胞凋亡,其机制可能与调控Bax/Bcl-2及NF-κB相关。

PD-1抗体对PM2.5诱导的大鼠心血管及血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨程序性死亡蛋白(PD)-1抗体对PM2.5染毒大鼠心血管损伤的作用及对PM2.5引起人血管内皮细胞损伤的影响。方法40只雄性SD大鼠随机分成对照组、PM2.5组、低剂量(PM2.5+低剂量PD-1抗体)组、高剂量(PM2.5+高剂量PD-1抗体)组,每组10只。气管滴注PM2.5悬液进行染毒,每隔2 d滴注1次,持续3 w,并以低、高剂量PD-1抗体(10 mg/kg、20 mg/kg)注射腹腔。实验前后测定大鼠体质量;末次染毒24 h后,腹主动脉取血,检测血清中氧化应激和炎症反应相关因子的水平;苏木素-伊红(HE)染色检测肺部和心脏组织形态学变化;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况。人血管内皮细胞EA.hy926随机分为对照组、PM2.5组、低剂量组、高剂量组,PM2.5组用含100μg/ml PM2.5培养液培养,低、高剂量组用含1 mg/ml PM2.5培养液和PD-1抗体(0.5、1.0 mg/ml)培养,24 h后收集细胞,噻唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测细胞活性和凋亡;Western印迹法检测活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3、Cleaved caspase-9蛋白表达。结果与对照组比较,实验后PM2.5组大鼠体质量减轻,血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)含量下降,丙二醛(MDA)、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、内皮素(ET)-1和C反应蛋白(CRP)含量均升高,肺组织和心肌组织出现明显的病理改变,心肌细胞凋亡增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。与PM2.5组比较,经高、低剂量PD-1抗体处理的大鼠,体质量有所增加,血清中SOD活性及GSH含量升高,MDA、IL-6、TNF-α及CRP含量均下降,高剂量PD-1抗体处理下ET-1也下降,肺组织和心肌组织病理学形态得到改善,心肌细胞凋亡减少,差异均具有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,PM2.5组EA.hy926细胞存活率降低,细胞凋亡率增加,Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达增加,差异均具有统计学意义(P<0.01);与PM2.5组比较,低剂量组、高剂量组的细胞存活率均升高,细胞凋亡率下降,同时,细胞中Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达减少,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论PD-1抗体可减轻PM2.5染毒引起的大鼠心血管损伤,其保护机制可能与抑制炎症反应、抗氧化损伤相关,此外,PD-1抗体还能够减少PM2.5诱导的人血管内皮细胞凋亡。

映山红花总黄酮促进大鼠脑血管内皮细胞体外形成血管作用及与VEGFR_(2)和神经源性H_(2)S的关系

目的探讨映山红花总黄酮(total flavones of rhododendra,TFR)促大鼠脑血管内皮细胞体外形成血管作用及与VEGFR_(2)和神经源性硫化氢(H_(2)S)的关系。方法采用大鼠脑血管内皮细胞单独培养及和与海马神经元共培养,分别采用不同的实验方法检测细胞增殖、迁移、成管及H_(2)S含量和钙离子荧光强度,包括CCK-8法、细胞划痕法、Transwell法、基质胶成管、H_(2)S试剂盒及钙离子荧光探针法。结果在单独培养的大鼠脑血管内皮细胞上,H_(2)S供体NaHS(200μmol·L^(-1))和TFR(90、270、810 mg·L^(-1))对大鼠脑血管内皮细胞的增殖、迁移、成管及[Ca^(2+)]i荧光强度都有明显的促进作用。而VEGFR_(2)阻断剂SU5416(10μmol·L^(-1))可抑制TFR的促进内皮细胞增殖、迁移和形成血管及[Ca^(2+)]i荧光强度;在与海马神经元共培养的大鼠脑血管内皮细胞上,TFR显著地升高共培养中H_(2)S含量,并被CBS抑制剂AOAA(200μmol·L^(-1))抑制。与此同时,TFR明显地促进共培养中大鼠脑血管内皮细胞的形成血管作用,并可被AOAA和VEGFR_(2)阻断剂SU5416显著地抑制。结论TFR在体外可通过VEGFR_(2)升高[Ca^(2+)]i来促进脑血管内皮细胞形成血管,并可通过诱导神经元中CBS生成H_(2)S作用于大鼠脑血管内皮细胞的VEGFR_(2)来促进血管形成。

长链非编码RNA NUTM2A-AS1靶向微小RNA-129-5p调控氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)NUTM2A-AS1对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的血管内皮细胞损伤的影响及分子机制。方法 将人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在DMEM培养基中培养,采用100μg/mL oxLDL处理的HUVEC纳入oxLDL组,常规培养的细胞纳入Con组。将lncRNA NUTM2A-AS1干扰表达载体及阴性对照、miR-129-5p模拟物及阴性对照转染至HUVEC后采用100μg/mL oxLDL处理后的细胞分别纳入oxLDL+si-NUTM2A-AS1组、oxLDL+si-NC组、oxLDL+miR-129-5p组、oxLDL+miR-NC组。将lncRNA NUTM2A-AS1干扰表达载体与微小RNA(miR)-129-5p抑制剂或阴性对照共转染至HUVEC后采用100μg/mL的oxLDL处理的细胞分别纳入oxLDL+si-NUTM2A-AS1+anti-miR-129-5p组、oxLDL+si-NUTM2A-AS1+anti-miR-NC组。采用试剂盒测量细胞中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;采用流式细胞术检测细胞凋亡;采用蛋白质印迹法检测蛋白表达;采用双荧光素酶报告实验及RNA下拉实验检测NUTM2A-AS1与miR-129-5p的靶向关系。结果 与Con组比较,oxLDL组lncRNA NUTM2A-AS1表达水平升高,miR-129-5p表达水平降低,MDA含量升高,SOD、GSH-Px活性降低,血管内皮细胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。干扰lncRNA NUTM2A-AS1表达或过表达miR-129-5p后,MDA含量降低,SOD、GSH-Px活性升高,细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。lncRNA NUTM2A-AS1敲低介导的oxLDL条件下血管内皮细胞的损伤抑制可以被miR-129-5p下调逆转。lncRNA NUTM2A-AS1靶向调控miR-129-5p。结论 干扰lncRNA NUTM2A-AS1表达通过靶向上调miR-129-5p抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞损伤。

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

分析大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定。方法 选取大鼠进行取脑,并对其开展原代培养,通过形态学观察、CD31免疫荧光染色对培养、鉴定的细胞实施检测,以获取检测结果。结果 在对细胞进行培养后,以脑微血管段为中心,放射性向周围移动,渐渐形成“铺路石”样,CD31免疫荧光染色鉴定结果显示,细胞质呈棕红色荧光,DAPI衬染的细胞核呈蓝色荧光,阳性细胞率较高。结论 该方法能够成功分离及培养大鼠脑微血管内皮细胞,对研究脑微血管内皮细胞的生物学特性以及功能具有重要作用。

松弛素抑制氧化应激反应保护小鼠心肌微血管内皮细胞的缺氧/复氧损伤

背景:松弛素是人松弛素2的重组形式,作为机体内源性抗纤维化活性物质,松弛素治疗可能会缓解急性心力衰竭患者的症状并改善其预后,但尚未有研究松弛素在氧化应激方面对缺氧/复氧损伤小鼠心肌微血管内皮细胞(H5V)的作用。目的:探讨松弛素在小鼠H5V细胞缺氧/复氧损伤模型中的作用。方法:建立小鼠H5V细胞缺氧/复氧损伤模型,分别为缺氧3,6,12 h,复氧3 h,通过检测细胞活力和乳酸脱氢酶活性确定细胞缺氧/复氧的最佳时间。选用不同质量浓度的松弛素(0,60,100,140,180 ng/mL)作用于H5V细胞缺氧/复氧损伤模型,通过检测细胞活力和乳酸脱氢酶活性确定松弛素干预的最佳质量浓度。在此基础上,将H5V细胞分为3组:对照组、缺氧/复氧模型组、缺氧/复氧+180 ng/mL松弛素组,检测丙二醛、超氧化物歧化酶和活性氧水平。结果与结论:(1)与对照组比较,缺氧6 h/复氧3 h、缺氧12 h/复氧3 h的细胞活力均显著降低(P<0.05),细胞上清中乳酸脱氢酶活性均显著增加(P<0.05),选取缺氧6 h/复氧3 h进行后续实验;(2)与缺氧/复氧模型组比较,缺氧/复氧+松弛素180 ng/mL组细胞活力显著增加(P<0.05),细胞上清中乳酸脱氢酶活性显著降低(P<0.05),选取松弛素180 ng/mL进行后续干预实验;(3)与缺氧/复氧模型组比较,缺氧/复氧+180 ng/mL松弛素组活性氧、丙二醛水平显著降低(P<0.05),超氧化物歧化酶水平显著增加(P<0.05);(4)结果表明,H5V细胞经缺氧6 h/复氧3 h可建立H5V细胞损伤模型,经180 ng/mL松弛素干预后提高了细胞活性和细胞抗氧化应激能力。

大鼠主动脉血管内皮细胞原代培养方法改良及氧化损伤模型构建

目的改良大鼠原代主动脉血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)的提取和培养方法,并构建稳定的AVECs氧化损伤模型。方法采用六孔板植块联合胶原酶消化改良法建立大鼠原代AVECs提取和培养方法,倒置显微镜下观察细胞形态,免疫荧光染色法检测vW因子(vWF)进行细胞鉴定。选用2~4代的AVECs,用不同浓度的POVPC干预24 h,检测细胞增殖、细胞骨架、成管能力、细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS),构建POVPC诱导的AVECs氧化损伤模型。结果植块联合胶原酶消化法提取培养的内皮细胞具有典型的“铺路石”样特性,生长状态良好,vWF免疫荧光染色阳性,阳性率占0.95,鉴定为内皮细胞。该法可缩短细胞传代时间。采用4.375~70μmol·L^(-1)的POVPC干预培养AVECs,POVPC在17.5~70μmol·L^(-1)时可明显抑制AVECs增殖(P<0.05);POVPC在8.75~70μmol·L^(-1)时,可导致细胞骨架交叉断裂堆积、解聚、结构模糊,且细胞成管能力明显降低(P<0.01),细胞内ROS水平明显升高(P<0.05)。以上改变在POVPC浓度为35μmol·L^(-1)时尤为明显。结论采用六孔板植块联合胶原酶消化改良法可获得较多的内皮细胞,细胞生长状态良好,缩短了细胞的生长周期,是一种简便、可行的AVECs培养方法。17.5~705μmol·L^(-1)的POVPC可构建稳定AVECs氧化损伤模型。

腺相关病毒感染GDF11对2型糖尿病大鼠血管损伤的保护作用

目的探讨腺相关病毒感染上调体内生长和分化因子11(GDF11)表达水平对2型糖尿病大鼠(T2DM)主动脉损伤的影响。方法随机选取9周龄雄性SD大鼠,采用高糖高脂饲料加小剂量链脲佐菌素(STZ)联合诱导,建立T2DM模型。正常大鼠和糖尿病模型大鼠随机分为5组:空白对照组(Control组)、阴性病毒对照组(NC组)、GDF11腺相关病毒组(GDF11组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+GDF11腺相关病毒组(DM+GDF11组)。喂养8周后,检测大鼠血清中胰岛素(INS)、晚期糖基化终末产物(AGES)、重组生长转化因子11(GDF11)、总胆固醇(T-CHO)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)、丙二醛(MDA)浓度;采用过碘酸雪夫氏染色(PAS染色)观察糖原沉积部位,苏木精-伊红染色(HE)观察血管损伤情况,扫描电镜观察血管内皮细胞和血管弹性纤维损伤情况,蛋白印迹和免疫组化检测血管损伤相关蛋白的表达水平。结果在动物实验中与Control组相比,生化指标提示:DM组大鼠血清中AGES、T-CHO、TG、LDL-C和MDA浓度升高(P<0.05),INS、GDF11、HDL-C、ADMA显著低于Control组(P<0.05),DM+GDF11组AGES和HDL-C与DM组无明显差异,T-CHO、TG、LDL-C和MDA相比较DM组降低(P<0.05),INS、GDF11和ADMA相比较DM组升高(P<0.05)。病理染色提示:DM组PAS染色提示糖原颗粒在主动脉内皮及内皮下沉积,HE染色观察到主动脉中膜增厚,内皮细胞及弹性纤维断裂走形不规则,电镜观察到DM组血管内皮损伤,弹性纤维断裂,DM+GDF11组这些变化有所减轻。蛋白印迹和免疫组化表示内皮细胞相关蛋白在DM组中表达下降(P<0.05),间充质标志物在DM组中表达升高(P<0.05),DM+GDF11组中这些蛋白有所回调,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论提高体内GDF11表达水平可以改善糖尿病导致的主动脉血管损伤,推断可能与其抑制内皮间充质转化保护血管内皮细胞的功能从而改善血管损伤有关。

内皮微粒包裹的miR-204-3p介导川崎病血管炎性损伤的机制探讨

目的 探讨内皮微粒(EMP)包裹的miR-204-3p介导川崎病(KD)血管炎性损伤的作用机制。方法 2016年4月至2021年3月,58例KD患者和50例对照组入选本研究。其中,18例KD患者伴有冠状动脉瘤(CAA),其余为无冠状动脉瘤(NCAA)。分离各组血清样品中EMP,并进行全基因组miRNA测序。在体外试验中,将VSMC或预转染miR-204-3p模拟物(AgomiR-204-3p)、miR-204-3p抑制剂(AntagomiR-204-3p)的VSMC与各组EMP共培养。结果 通过全基因组miRNA测序以及RT-qPCR分析证实miR-204-3p在KD EMP中显著增加,并且EMP中miR-204-3p水平根据冠状动脉病理严重程度显著降低,顺序为NCAA>SCAA>MCAA>GCAA。与对照组EMP共培养相比,VSMC与NCAA EMP共培养48 h后增殖率显著降低(P<0.05),VSMC分化标志物(ACTA2和CNN1)表达显著增加(P<0.05),去分化标志物(OPN和PDGFRβ)表达显著降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测证实,EMP中miR-204-3p在功能上靶向VSMC中的PDGFRβ。在与NCAA EMP孵育的VSMC中,使用AntagomiR-204-3p可显著降低分化标记物(ACTA2和CNN1)的表达,并增加去分化标记物(OPN和PDGFRβ)的表达。在与CAA EMP孵育的VSMC中,给予AgomiR-204-3p显著增加分化标记物的表达,并降低去分化标记物的表达。结论 EMP将miR-204-3p转移到VSMC并通过靶向PDGFRβ部分介导KD血管炎性损伤。因此,靶向miR-204-3p-PDGFRβ轴可能为KD诱导的血管病变提供新的治疗选择。

化纤胶囊Ⅱ号方治疗脓毒症急性肺损伤疗效及对患者血管内皮细胞功能、毛细血管渗漏指数的影响

目的:探讨化纤胶囊Ⅱ号方治疗脓毒症急性肺损伤疗效及对患者血管内皮细胞功能、毛细血管渗漏指数的影响。方法:选取80例脓毒症急性肺损伤患者并采用随机数字表法均分为对照组(n=40)和观察组(n=40)。对照组给予规范西医治疗,观察组在对照组基础上加用化纤胶囊Ⅱ号方治疗。对两组临床效果进行比较,并观察治疗前后病情严重程度[急性生理学和慢性健康状况评分(APACHEⅡ)和Murray肺损伤评分(mlIS)]、中医症状积分、血气[动脉血氧分压(PaO_(2))、氧合指数(PaO_(2)/FiO_(2))]及呼吸功能指标[血管外肺水指数(EVLWI)、肺血管通透指数(PVPI)]、血管内皮细胞功能[血清血管性假血友病因子(vWF)、血栓调节蛋白(TM)、内皮素-1(ET-1)]及毛细血管渗漏指数(CLI)。结果:两组临床总有效率(85.00%与65.00%)比较,观察组高于对照组(P<0.05);治疗后,两组中医症状积分、APACHEⅡ和mlIS评分均低于治疗前(P均<0.05),但观察组中医症状积分、APACHEⅡ和mlIS评分均低于对照组(P<0.05);治疗后,两组血气指标(PaO_(2)、PaO_(2)/FiO_(2))均明显上升、呼吸功能指标(EVLWI、PVPI)明显下降(P<0.05),且观察组血气、呼吸指标改善优于对照组(P<0.05);治疗后,两组血管内皮细胞功能(vWF、TM、ET-1水平)及毛细血管渗漏指数(CLI)均明显下降(P<0.05),且观察组血清vWF、TM、ET-1水平及CLI均低于对照组(P<0.05)。结论:化纤胶囊Ⅱ号方可提高脓毒症急性肺损伤治疗效果,并可稳定病情,改善患者血气及呼吸指标,修复和保护血管内皮细胞功能,降低毛细血管渗漏指数。