论病证结合血瘀证血管内皮细胞损伤模型的建立

建立病证结合血瘀证血管内皮细胞损伤模型是血瘀证模型研制的一个方向。文章论述了建立病证结合血瘀证血管内皮细胞损伤模型的必要性和可行性,认为该模型具有重要的学术价值、深远的科研价值和积极的临床价值。

从病证结合角度分析血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研究

从病证结合的角度探讨和分析了血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研制种类、方法和未来的研究前景,认为血瘀证细胞模型的研究中应该体现"病""证"结合的特点,走"微观"之路,应"宏观"之理,才能成为活血化瘀药物筛选中的重要技术平台,并为中医证候模型的研究提供有益的探索。

SD大鼠血管内皮细胞损伤模型的制作方法

目的 :建立SD大鼠血管内皮细胞损伤动物模型。方法 :SD大鼠随机分为正常对照组和模型组。模型组大鼠皮下注射稀释 1.5倍的肾上腺素 0 .0 5 / 10 0 g ,连续 5天。于第 4天起 ,每二次给药中间时间将大鼠置于 0℃冰水中 5min ,共 4次。正常对照组则皮下注射等量 0 .9%NS。于第 6天 ,二组大鼠自颈总动脉取血 ,分别测定CEC计数、t PA、PAI活性、6 Keto PGF1α含量及血小板最大聚集率。结果 :模型组较正常对照组大鼠CEC计数、PAI活性、血小板最大聚集率明显升高 (P <0 .0 0 1～ 0 .0 1) ,t PA活性、6 Keto PGF1α含量降低 (P <0 .0 1～ 0 .0 5 )。结论 :大剂量肾上腺素加冰泳刺激确能造成SD大鼠血管内皮细胞损伤。

SD大鼠血管内皮细胞损伤模型的制作方法

目的 建立SD大鼠血管内皮细胞损伤模型.方法 SD大鼠随机分为正常对照组和模型组.模型组大鼠皮下注射稀释1.5倍的肾上腺素0.05mg·100g^(-1)(tid),连续5d.于d 4起,每2次给药间将大鼠置于0℃冰水中5min.正常对照组则皮下注射等量NS.于d6,2组大鼠自颈总动脉取血,分别测定CEC计数、t-PA、PAI活性、6-keto-PGF_(1a)含量及血小板最大聚集率.结果 模型组较正常对照组大鼠CEC计数、PAI活性、血小板最大聚集率明显升高(P<0.01),t-PA活性、6-keto-PGFl_(1a)含量降低(P＜0.01;P＜0.05).结论 大剂量肾上腺素加冰泳刺激能造成SD大鼠血管内皮细胞损伤.

高糖联合晚期糖基化终产物对微血管内皮细胞损伤模型的建立

目的：糖尿病微血管病变是糖尿病发生最早的并发症，也是各种慢性并发症的病理基础，成为糖尿病预后的决定性因素。晚期糖基化终产物（advanced glycation end—products，AGEs）对糖尿病微血管并发症的发生和发展起了重要作用。本研究拟在体外培养的微血管内皮细胞建立规范化的AGEs损伤的细胞模型，以为进一步的药物筛选和作用机制研究奠定基础。

宣白承气汤对脂多糖诱导肺微血管内皮细胞损伤模型mTOR/自噬信号通路的影响

目的探讨宣白承气汤对脂多糖(LPS)致大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)损伤模型雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬信号通路的影响。方法实验细胞分为正常组、模型组、雷帕霉素组和宣白承气汤(低、中、高剂量)组,ELISA检测白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;实时荧光定量PCR检测缺氧诱导因子-lα(HIF-1α)、P70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K1)、真核起始因子4E(eIF4E)和真核起始因子4E结合蛋白1(eIF4E-BP1) mRNA表达,Western blot检测p-mTOR、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、微管相关蛋白1轻链3(LC3B)和泛素化结合的接头蛋白(P62)蛋白表达。结果与正常组比较,模型组细胞TNF-α、IL-6含量明显升高,HIF-1α、eIF4E-BP1和p70S6K mRNA表达显著升高,p-mTOR和VEGF蛋白表达明显升高,LC3B蛋白表达明显降低;与模型组比较,宣白承气汤中剂量组中TNF-α、IL-6含量降低,宣白承气汤低、中剂量组中HIF-1α、eIF4E-BP1、p70S6KmRNA表达降低,宣白承气汤高剂量组中eIF4E-BP1、p70S6KmRNA表达降低,宣白承气汤中剂量组p-mTOR、VEGF蛋白表达降低,宣白承气汤中、高剂量组LC3B蛋白表达量明显升高。结论宣白承气汤减轻脂多糖诱导PMVECs的炎症损伤机制可能与抑制mTOR蛋白磷酸化,增强细胞自噬,抑制HIF-1α表达,降低VEGF蛋白表达有关。

基于血管内皮细胞损伤模型的丹参酮ⅡA治疗慢性心力衰竭的机制研究

目的研究丹参酮ⅡA（TanⅡA）对慢性心力衰竭（CHF）患者血清损伤后的血管内皮细胞（VEC）的影响，探讨丹参酮ⅡA治疗CHF的作用机制。方法利用15％的CHF患者血清损伤正常培养的人脐静脉内皮细胞（CRL-1730），用不同浓度的TanⅡA（10、20、40μg／ml）作用于损伤后的细胞24h，检测VEC的活性及细胞DNA的损伤；并检测细胞培养上清液中VEC损伤标志物循环内皮细胞数（CEC）、血管性假血友病因子（vWF）及血栓调节蛋白（TM）的水平变化。结果与健康对照组比较，模型组VEC细胞活性下降（P〈0．05），尾部DNA％、彗星长及尾矩均上升（P〈0．05），CEC、vWF72．TM水平均上升（P〈0．05）；与模型组比较，20μg／ml和40μg/ml的TanⅡA能增加内皮细胞的活性（P〈0．05）；减轻DNA的损伤（P〈0．01）；3个浓度的TanⅡA均可以减少CEC数（P〈0．05）；20μg／ml和40μg／ml的TanⅡA可降低vWF水平（P〈0．05）；40μg／ml的TanⅡA可降低TM水平（P〈0．05）。结论TanⅡA能通过减轻CHF患者血清对内皮细胞的DNA损伤保护VEC，这可能是TanⅡA治疗CHF的作用机制之一。

内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响:生物信息学分析和实验验证

背景:血管新生是心血管疾病的主要干预靶点,骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,但内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的调控作用不清楚。目的:探讨内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响。方法:(1)生物信息学分析:通过Panglao DB公共基因表达数据库单细胞转录组荟萃分析观察骨形态发生蛋白2细胞群表达丰度和定位。血管新生小鼠和内皮(心内膜)过表达骨形态发生蛋白2小鼠转录组测序数据集探索内皮细胞骨形态发生蛋白2对血管新生信号通路的调控作用。(2)体内实验验证:建立小鼠后肢缺血模型,对比模型小鼠患侧与健侧缺血后肢7,14和21 d血流灌注情况,免疫荧光和免疫组织化学染色评估小鼠骨形态发生蛋白2和CD31的表达定位情况。(3)体外实验验证:体外培养人脐静脉内皮细胞,分为对照组、缺氧组和骨形态发生蛋白2抑制剂(Noggin蛋白)干预组,培养24 h,观察各组内皮细胞血管新生情况。结果与结论:(1)内皮细胞是表达骨形态发生蛋白2的重要细胞亚群,在血管新生内皮细胞和骨形态发生蛋白2过表达内皮细胞转录组再分析均发现骨形态发生蛋白2表达明显升高,血管新生通路明显激活。(2)缺血7 d小鼠新生血管周围骨形态发生蛋白2阳性血管明显增加(P<0.05),缺血2周骨形态发生蛋白2阳性血管明显减少(P<0.001)。(3)体外培养人脐静脉内皮细胞,缺氧干预后,内皮细胞迁移能力和血管出芽明显增加,血管新生因子血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达明显升高,Noggin明显减少了缺氧诱导的内皮细胞血管新生(P<0.001),并下调血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达(P<0.01)。(4)结果证实,内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,靶向性内皮细胞骨形态发生蛋白2可望改善血管新生。

常压高浓度氧对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤与Nrf2/HO-1信号通路的影响分析

目的探究常压高浓度氧(NBO)对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤及核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法取新生SD大鼠45只,采用随机数字表法分为常氧组、NBO组和NBO+Nrf2激活剂组,每组各15只。常氧组大鼠置于普通空气(21%氧气)中饲养,NBO组和NBO+Nrf2激活剂组大鼠置于90%常压氧气饲养,NBO+Nrf2激活剂组每日灌胃5 mg/kg Nrf2激动剂莱菔硫烷。测定脑组织伊文思蓝(EB)含量,采用酶联免疫法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量,干湿重法检测脑组织含水量,HE染色和TUNEL染色观察脑组织病理变化,蛋白质印迹法检测海马组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达,水迷宫检测大鼠认知功能。结果与常氧组比较,NBO组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理染色结果显示,常氧组大鼠神经细胞形态及结构完整,未见明显病理变化和细胞凋亡;NBO组神经细胞形态及结构不规则,出现明显的水肿和空泡,并伴有大量的凋亡细胞;NBO+Nrf2激活剂组脑组织病理损伤较NBO组明显减轻。与常氧组比较,NBO组脑组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与常氧组比较,NBO组第2~4天逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组第2~4天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NBO可诱导新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤,导致远期认知功能障碍,可能与下调Nrf2/HO-1信号通路表达有关。

微血管内皮细胞在脊髓损伤中的作用机制及中药干预脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种神经破坏性疾病,引起患者感觉、运动及自主神经功能障碍[1]。根据病因,SCI可以分为创伤性与非创伤性,研究[2]发现,发展中国家创伤性SCI发病率逐年下降,而其中坠落伤及老年患者占比上升,男性多于女性,且以不完全性四肢瘫多见。

银杏素调节TGF⁃β1/Smad通路对ox⁃LDL诱导血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨银杏素调节转化生长因子⁃β1(TGF⁃β1)/Smad信号通路对ox⁃LDL诱导血管内皮细胞损伤的影响。方法将人脐静脉血管内皮细胞HUVEC分为对照组(未处理的HUVEC细胞)、模型组(50μg/mL ox⁃LDL处理的HUVEC细胞)、银杏素组(50μg/mL ox⁃LDL+12.5μmol/L银杏素处理HUVEC细胞)、SRI⁃011381组(50μg/mL ox⁃LDL+10μmol/L的TGF⁃β1/Smad激活剂SRI⁃011381处理HUVEC细胞)、银杏素+SRI⁃011381组(50μg/mL ox⁃LDL+12.5μmol/L银杏素+10μmol/L的SRI⁃011381共同处理HUVEC细胞)。ELISA试剂盒检测HUVEC细胞丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、IL⁃6、IL⁃1β、TNF⁃α水平;CCK⁃8法检测HUVEC细胞增殖;流式细胞术检测HUVEC细胞凋亡率;Western blot检测细胞上皮间质转化(EMT)、TGF⁃β1/Smad通路相关蛋白表达。结果与对照组相比,模型组IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α、MDA水平、细胞凋亡率、TGF⁃β1、Smad3、神经型钙黏附蛋白(N⁃cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白水平显著增加(P<0.05),A值、GSH、SOD水平、上皮钙黏附素(E⁃cadherin)蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,银杏素组IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α、MDA水平、细胞凋亡率、TGF⁃β1、Smad3、N⁃cadherin、Vimentin蛋白水平显著下降(P<0.05),A值、GSH、SOD水平、E⁃cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05),而SRI⁃011381组趋势相反,SRI⁃011381减弱了银杏素对ox⁃LDL诱导的HUVEC细胞损伤的抑制作用。结论银杏素可能通过下调TGF⁃β1/Smad信号通路对ox⁃LDL诱导的血管内皮细胞损伤起到改善作用。

丹参酮ⅡA对脓毒症肺微血管内皮细胞损伤的保护作用

目的探寻丹参酮ⅡA对脓毒症肺血管内皮细胞损伤的保护作用。方法采用盲肠结扎穿孔术构建脓毒症肺损伤小鼠模型,分为6组:假手术组、模型组、丹参酮1组(10 mg/kg)、丹参酮2组(30 mg/kg)、丹参酮3组(50 mg/kg)、丹参酮4组(100 mg/kg)。药物干预24 h后检测肺组织病理变化、肺微血管通透性、肺组织湿/干重比、白细胞计数以及炎症因子等各项指标,假手术组仅行盲肠探查术。结果丹参酮各组较模型组小鼠肺组织损伤及评分均减轻(P<0.05)。与模型组比较,丹参酮各组小鼠肺组织Evans Blue含量、肺组织湿/干比明显降低(P<0.05),BALF白细胞计数、蛋白含量、炎症因子明显减少(均P<0.05),且呈剂量依赖性,其中丹参酮2组、丹参酮3组和丹参酮4组之间,肺组织病理损伤、Evans Blue含量、肺组织湿/干比以及肺泡灌洗液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)。结论丹参酮ⅡA能够剂量依赖性地降低脓毒症所致的肺微血管内皮细胞损伤,从而改善肺损伤;30 mg/kg剂量的丹参酮ⅡA即可达到最佳效果。

2型糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研究

目的建立2型糖尿病血瘀证的血管内皮细胞损伤模型。方法取对数生长期的正常人脐静脉内皮细胞(ECV-304),干预分组如下:空白对照组(无血清的DMEM)、健康组(健康人血清)、糖尿病血瘀证组(糖尿病血瘀证患者血清)和糖尿病非血瘀证组(糖尿病非血瘀证患者血清)。采用MTT法观察细胞活性;在倒置相差显微镜、扫描电镜和透射电镜下观察细胞形态的变化;应用放免法测定内皮素(ET)含量;硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量;利用双抗夹心ELISA法检测各组细胞培养上清液中内皮细胞蛋白C受体(EPCR)、血管内假性血友病因子(vWF)和血栓调节蛋白(sTM)的含量;应用激光扫描共聚焦显微镜,采用Fluo-3/AM作为荧光指示剂观察细胞内游离钙浓度的变化;并采用荧光探针标记的鬼笔环肽染色法观察细胞肌动蛋白微丝分布的差异。结果①10%浓度的糖尿病血瘀证组的OD值较健康组明显降低(P<0.001);②糖尿病血瘀证组的ET水平比空白对照组和糖尿病非血瘀证组升高(P<0.001);糖尿病血瘀证组的NO水平比空白对照组降低(P<0.001);但和糖尿病非血瘀证组相比差异没有统计学意义(P>0.05);③内皮细胞经过患者血清损伤后,糖尿病血瘀证组分泌的EPCR含量比空白对照组升高(P<0.001),但低于糖尿病非血瘀证组(P<0.001);糖尿病血瘀证组分泌的vWF和sTM含量比空白对照组升高(P<0.001),和糖尿病非血瘀证组相比差异没有统计学意义(P>0.05);④糖尿病血瘀证组胞浆内荧光分布不均匀,荧光强度高于正常对照组和糖尿病非血瘀证组(P<0.001);⑤空白对照组和健康组细胞骨架微丝分布多规则清晰,保持着细胞的正常外形,糖尿病血瘀证组的细胞骨架微丝断裂且排列紊乱,糖尿病非血瘀证组细胞微丝断裂但排列较为规则。结论应用2型糖尿病血瘀证患者血清干预ECV-304可以在体外表现出血管内皮细胞损伤的种种征象,初步建立一种病证结合的血瘀证细胞损伤模型。

清开灵有效组分对大鼠脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注损伤模型核转录因子-κB的影响

目的:建立大鼠脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注损伤模型,探讨清开灵有效组分牛胆酸、猪胆酸、黄芩苷、栀子苷和珍珠母对其的保护作用是否与调节核转录因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)活化有关。方法:体外培养大鼠脑微血管内皮细胞(microvascular endothelial cell,MVEC),氧糖剥夺法模拟缺血再灌注损伤,建立体外缺血再灌注损伤模型。随机分为模型组、尼莫地平组、猪胆酸组、黄芩苷组、栀子苷组、珍珠母组和牛胆酸组,并设正常MVEC为正常对照组,每组设6孔。使用免疫细胞化学法观察NF-κB蛋白表达情况并进行图像分析。结果:光学显微镜下观察,正常组MVEC胞核的位置形成空腔,胞浆内见淡棕黄色均匀颗粒。模型组NF-κB细胞核的染色强度明显高于胞浆,活化后移位至细胞核;用药各组NF-κB在胞浆近胞核处有少量阳性表达,在胞核的表达明显弱于模型组。对各组MVEC NF-κB表达强度的图像分析显示,模型组胞核与胞浆的透光度比值低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01),用药各组透光度比值显著高于模型组(P<0.05,P<0.01)。结论:清开灵有效组分可能通过拮抗NF-κB活化抑制内皮细胞损伤。

血管内皮细胞冷损伤模型的建立

目的建立在细胞水平进行冷冻损伤研究的细胞冷损伤实验模型。方法在不加任何低温保护剂的条件下将体外培养的大鼠主动脉血管内皮细胞(VEC),以1℃·min1、10℃·min1和20℃·min1的冷冻速率冷冻至-40℃,或以1℃·min1的冷冻速率分别冻至0℃、-10℃、-20℃和-40℃,在冻后1d和3d观察VEC生长情况以及乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化,分析冷冻速率和冷冻温度与VEC损伤程度的关系。结果VEC活存率1℃·min1组为80.0%,10℃·min1组为61.5%,20℃·min1组为42.3%。在冻后1d和3dVEC生长率(%)分别为:0℃组91.7,95.1;-10℃组57.7,54.2;-20℃组20.5,16.8;-40℃组5.4,4.4。冷冻至0℃、-10℃、-20℃和-40℃,冻后1dVCE培养液中LDH活性(U·L-1)依次为:141.6±15.3,270.2±18.6,328.9±29.6,359.8±28.0。结论本实验建立了以1℃·min-1的速率冷冻至0℃的轻度冷损伤模型、冷冻至-10℃的中度冷损伤模型和冷冻至-20℃或-40℃的重度冷损伤模型。对冷冻损伤反应较为适宜的细胞冷冻模型是中度冷损伤模型或重度中的-20℃冷损伤模型。

温阳生肌膏及其有效成分改善线粒体功能减轻高糖诱导的血管内皮细胞损伤

目的探讨温阳生肌膏及其有效成分(肉桂醛、没食子酸)对高糖状态下血管内皮细胞线粒体损伤的保护作用。方法CCK-8法确定温阳生肌膏有效成分(肉桂醛、没食子酸)干预浓度,将人脐静脉血管内皮细胞(EA-hy926)分为对照组(Con)、高糖组(HG)、温阳生肌膏组(WYSJ)、肉桂醛组(CA)、没食子酸组(GA)。以CCK-8法检测细胞增殖活性,成管实验检测细胞成管能力,透射电镜观察细胞线粒体超微结构,DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧(ROS)含量,比色法检测细胞ATP含量。结果CA组浓度选用10μM,GA组浓度选用5μM。与Con组相比,HG组细胞增殖活性下降(P<0.05);成管能力下降(P<0.05);线粒体肿胀、破裂、数量减少;ROS含量增多(P<0.05);ATP含量减少(P<0.05)。与HG组相比,WYSJ组、CA组、GA组细胞增殖活性加强(P<0.05);成管能力加强(P<0.05);线粒体超微结构损伤改善、数量增加,线粒体自噬增加;ROS含量减少(P<0.05);ATP含量增加(P<0.05)。与CA组和GA组相比,WYSJ组细胞增殖活性较强(P<0.05);成管能力较CA组弱(P<0.05);ROS含量较CA组和GA组多;ATP含量多(P<0.05)。结论温阳生肌膏及其有效成分可能通过清除细胞ROS,改善线粒体功能,增加ATP生成,从而减轻高糖诱导的血管内皮细胞损伤。

缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞Necroptosis模型的建立

目的:采用拟缺血再灌注损伤结合z-VAD-FMK(Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone,z-VAD-FMK)干预,探索一种脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs)Necroptosis模型。方法:首先利用原代大鼠脑微血管内皮细胞,采用氧糖剥夺及复氧复糖方法,筛选出拟缺血再灌注损伤时间点。在拟缺血再灌注模型基础上,予Casepase抑制剂z-VAD-FMK 20μmol/L干预,采用CCK-8检测细胞活性;透射电镜观察细胞超微结构;Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)双染色法检测细胞死亡方式。结果:确定氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h,作为拟缺血再灌注时间点;z-VADFMK作用于拟缺血再灌注损伤BMECs后,细胞活性无统计学意义;z-VAD-FMK干预组在电镜下呈现明显的Necroptosis特征;流式检测显示,各象限细胞比率无明显变化,但Necroptosis特异性抑制剂Nec-1可显著降低Q2象限细胞比率,提示z-VAD-FMK干预抑制了细胞晚期凋亡,诱导了Necroptosis的发生。结论:z-VAD-FMK可诱导拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞发生Necroptosis,为以后研究缺血性脑中风necroptosis机制提供了细胞实验模型。

黄芪甲苷调控Nrf2/HO-1信号通路对血管内皮细胞氧化损伤的影响

目的 基于细胞实验研究黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AST-Ⅳ)调控核转录因子红系2相关因子2/血红素加氧酶-1(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1,Nrf2/HO-1)信号通路对血管内皮氧化损伤的影响。方法 采用1-棕榈酰基-2-(5'-氧-戊酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱[1-palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphocholine,POVPC]刺激血管内皮细胞24 h建立血管内皮细胞氧化损伤模型,随机分为模型(Model)组(35μmol/L POVPC)、AST-Ⅳ低剂量(AST-L)组(35μmol/L POVPC+50μmol/L AST-Ⅳ)、AST-Ⅳ高剂量(AST-H)组(35μmol/L POVPC+100μmol/L AST-Ⅳ)及AST-Ⅳ高剂量+ML385(Nrf2抑制剂)(AST-H+ML385)组(35μmol/L POVPC+100μmol/L AST-Ⅳ+5μmol/L ML385),以正常未处理细胞作为对照(Control)组。免疫荧光鉴定大鼠胸主动脉内皮细胞(aortic vascular endothelium cell,AVEC),CCK-8检测AST-Ⅳ细胞增殖情况,Transwell小室检测AVEC迁移情况,Matrigel基质胶检测细胞血管形成功能,鬼笔环肽染色检测细胞骨架结构,DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,试剂盒法检测细胞培养上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平,RT-qPCR和Western blot检测Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达情况。结果 免疫荧光鉴定所提取的细胞,可特异性表达血管性血友病因子(von willebrand factor,v WF),鉴定为AVEC。与Control组相比,Model组细胞活力、迁移能力和血管形成功能显著下降(P<0.01),细胞骨架破坏明显,细胞内ROS水平显著上升(P<0.01),细胞培养上清液中SOD含量显著减少(P<0.01),细胞中Nrf2和HO-1的m RNA及蛋白表达水平下调(P<0.01或P<0.05)。与Model组比较,AST-L组及AST-H组细胞活力、迁移能力和血管形成功能显著升高(P<0.01),细胞骨架破坏得到较好修复,细胞内ROS水平显著下降(P<0.01),细胞培养上清液中SOD含量显著增加(P<0.01),细胞中Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达水平显著上调(P<0.01),且以AST-H组效果更为显著(P<0.01)。与AST-H组比较,ASTH+ML385组迁移能力和血管形成功能显著下降(P<0.01),细胞骨架破坏增加,细胞内ROS水平显著上升(P<0.01),细胞培养上清液中SOD含量显著减少(P<0.01),细胞中Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达水平显著下调(P<0.01)。结论 AST对血管内皮氧化损伤具有保护作用,且有一定的剂量依赖性,其机制可能是通过激活Nrf2/HO-1信号通路发挥作用。

lncRNA MALAT1靶向miR-532-3p对脑出血继发脑损伤大鼠脑微血管内皮细胞模型凋亡和氧化损伤的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)肺癌转移相关转录本1(MALAT1)靶向miR-532-3p对脑出血(ICH)继发脑损伤的大鼠脑微血管内皮细胞(RCMECs)凋亡和氧化损伤的影响。方法采用双重荧光素酶报告基因实验和实时定量PCR(RT-qPCR)确定MALAT1和miR-532-3p的靶向调控关系。首先将细胞分为对照组(正常培养的RCMECs)与模型(H_(2)O_(2))组(RCMECs氧化损伤模型),采用RT-qPCR分析并对比两组MALAT1和miR-532-3p的表达量。随后将细胞分为H_(2)O_(2)-si-NC组、H_(2)O_(2)-si-MALAT1组、H_(2)O_(2)-miR-mimics-NC组、H_(2)O_(2)-miR-532-3p mimics组、H_(2)O_(2)-si-MALAT1+miR-inhibitor-NC组、H_(2)O_(2)-si-MALAT1+miR-532-3p inhibitor组,分别转染si-NC、si-MALAT1、miR-mimics-NC、miR-532-3p mimics、共转染si-MALAT1与miR-inhibitor-NC、共转染si-MALAT1与miR-532-3p inhibitor后,构建RCMECs氧化损伤模型,然后采用流式细胞术分析RCMECs凋亡情况,采用试剂盒测定丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,采用蛋白质印迹法(Wes-tern blot)检测B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2和Bcl相关x蛋白(Bax)表达量,并比较组间差异。结果MALAT1可与miR-532-3p特异性结合并负调控miR-532-3p表达(P<0.05)。与对照组比较,H_(2)O_(2)组中MALAT1的表达量显著升高,miR-532-3p的表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与H_(2)O_(2)-si-NC组比,H_(2)O_(2)-si-MALAT1组沉默MALAT1可显著减弱H_(2)O_(2)诱导的RCMECs凋亡,并降低MDA含量、升高SOD和CAT活性、降低Bax蛋白相对表达量、升高Bcl-2蛋白相对表达量,差异均有统计学意义(P<0.05)。与H_(2)O_(2)-miR-mimics-NC组比,H_(2)O_(2)-miR-532-3p mimics组过表达miR-532-3p可显著减弱H_(2)O_(2)诱导的RCMECs凋亡,并降低MDA含量、升高SOD和CAT活性、降低Bax蛋白相对表达量、升高Bcl-2蛋白相对表达量,差异均有统计学意义(P<0.05)。与H_(2)O_(2)-si-MALAT1+miR-inhibitor-NC组比,H_(2)O_(2)-si-MALAT1+miR-532-3p inhibitor组沉默MALAT1同时抑制miR-532-3p表达,可显著增加H_(2)O_(2)诱导的RCMECs凋亡,并升高MDA含量、降低SOD和CAT活性、升高Bax蛋白相对表达量、降低Bcl-2蛋白相对表达量,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论沉默MALAT1通过负调控miR-532-3p能够减弱H_(2)O_(2)诱导的RCMECs凋亡和氧化损伤。

一种基于血管内皮细胞损伤的大鼠局灶性脑梗死模型

目的:建立一种因血管内皮细胞损伤而诱导的大鼠局灶性脑梗死模型。方法:取S-D大鼠11只,分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。结扎左颈外动脉远心端,夹闭左翼腭动脉和颈总动脉,经颈外动脉逆行插管并缓慢注入月桂酸钠至颈内动脉系统,造成大脑中动脉血管内皮细胞受损。结果:从模型动物的行为表现、梗死灶形态学和病理学进行考察,10只大鼠均产生一定程度的脑梗死表现,造模成功率为90.9％。结论:该模型的稳定性和重复性较好,能在大脑中动脉的供血区产生恒定的梗死灶,适合进行脑缺血损伤的有关实验研究。