基于VEGF/PI3K/Akt通路基因表达探讨骨坏死康复丸对激素性股骨头坏死大鼠血管新生的影响

【目的】观察骨坏死康复丸对激素性股骨头坏死(SONFH)大鼠的治疗作用及机制。【方法】将60只大鼠随机分为空白组,模型组,仙灵骨葆胶囊组及骨坏死康复丸低、中、高剂量组,每组10只。除空白组,其他各组大鼠采用脂多糖联合糖皮质激素诱导法建立SONFH模型。干预结束后,分别进行股骨头的血管造影观察骨髓内微血管变化、苏木素-伊红(HE)染色并计算空骨陷窝率、Micro-CT扫描分析、压缩实验,采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测全血磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)1、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板内皮细胞黏附分子1(CD31)基因表达。【结果】与空白组比较,模型组股骨头髓腔内血供差,空骨陷窝率增加(P<0.05),骨密度、骨体积分数显著降低(P<0.05),股骨头最大载荷及弹性模量降低(P<0.05),全血Akt1、PI3K、VEGF、CD31 mRNA表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,骨坏死康复丸高剂量组和仙灵骨葆胶囊组股骨头髓腔内血供较好,空骨陷窝率减少(P<0.05),骨密度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度显著升高(P<0.05)及骨小梁分离度显著减小(P<0.05),股骨头最大载荷及弹性模量升高(P<0.05),全血Akt1、PI3K、VEGF、CD31 mRNA表达水平升高(P<0.05);骨坏死康复丸高剂量组上述各指标与仙灵骨葆胶囊组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。【结论】骨坏死康复丸可改善大鼠激素性股骨头坏死,其机制与促进VEGF/PI3K/Akt通路基因表达,进而促进血管新生有关。

水蛭提取液通过VEGF/PI3K/AKT通路抑制WERI-RB-1细胞表达VEGF

目的:研究水蛭提取液对视网膜母细胞瘤细胞(WERI-RB-1细胞)表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响及相关分子机制。方法:将体外培养的WERI-RB-1细胞分为对照组、0.04U/mL水蛭提取液组、0.08U/mL水蛭提取液组,对照组采用完全培养基培养48h,水蛭提取液组分别采用含0.04、0.08U/mL含药培养基培养48h。采用ELISA法检测各组细胞培养基上清液中VEGF表达水平;采用RT-PCR法检测各组细胞缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA相对表达水平;采用Western Blot法检测各组细胞HIF-1a、MMP-9、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、人磷酸化蛋白激酶(p-AKT)相对表达水平。结果:与对照组比较,水蛭提取液组细胞培养基上清液中VEGF表达均降低(P<0.05),0.04、0.08U/mL水蛭提取液对VEGF表达抑制率分别为32.43%、38.92%。与对照组比较,水蛭提取液组细胞HIF-1a和MMP-9 mRNA相对表达水平均明显降低(P<0.05),0.04、0.08U/mL水蛭提取液对HIF-1a mRNA表达抑制率分别为27.64%、24.75%,对MMP-9 mRNA表达抑制率分别为43.97%、51.48%。与对照组比较,水蛭提取液组细胞HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白相对表达水平均明显降低(P<0.05),0.04、0.08U/mL水蛭提取液对HIF-1a蛋白表达抑制率分别为55.81%、43.85%,对MMP-9蛋白表达抑制率分别为39.49%、47.23%,对PI3K蛋白表达抑制率分别为33.27%、29.83%,对p-AKT蛋白表达抑制率分别为52.07%、30.21%。结论:水蛭提取液可能通过VEGF/PI3K/AKT通路及HIF-1a、MMP-9因子抑制WERI-RB-1细胞VEGF的表达。

基于VEGF/VEGFR2/PI3K/Akt信号通路研究健脾活骨方对酒精性股骨头坏死血管损伤的修复作用机制

目的:本研究旨在观察健脾活骨方(JPHGP)对实验性酒精性股骨头坏死(AONFH)血管损伤的修复作用,并基于血管内皮细胞生长因子(VEGF)/血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路探索其作用机制。方法:实验采用46%酒精度红星二锅头10 m L·kg^(-1)·d^(-1)灌胃建立AONFH大鼠模型,观察JPHGP不同剂量组(2.5、5.0、10.0 g·kg^(-1))的干预作用,选择健骨生丸(JGS,1.5 g·kg^(-1))为阳性药物;给药8周后,Micro-CT扫描分析股骨头骨计量学,墨汁灌注观察股骨头骨髓内微血管面积,苏木素-伊红(HE)染色法观察病理学改变程度,免疫组化和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测股骨头中血小板-内皮细胞黏附分子31(CD31)、VEGF、VEGFR2、PI3K、磷酸化蛋白激酶B(p-Ak)和抑癌基因(PTEN)的蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠股骨头骨小梁断裂变细,空骨陷窝增多,脂肪细胞数量明显增多和直径显著变大(P<0.01),Micro-CT影像学结果显示骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)均明显降低(P<0.05,P<0.01),骨表面积体积比(BS/BV)和骨小梁分离度(Tb.Sp)均显著升高(P<0.01),墨汁灌注结果表明股骨头髓腔内微血管面积显著减少(P<0.01);与模型组比较,JPHGP作用后能降低AONFH大鼠股骨头的空骨陷窝率、脂肪细胞面积和直径,Micro-CT影像学结果显示JPHGP低剂量组BV/TV、Tb.Th、Tb.N均明显升高(P<0.05,P<0.01),BS/BV显著降低(P<0.01),BMD呈升高趋势,Tb.Sp呈下降趋势,但差异均无统计学意义,JPHGP中、高剂量组的BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N均明显升高(P<0.05,P<0.01),BS/BV、Tb.Sp明显降低(P<0.05,P<0.01),并明显升高股骨头髓腔内微血管面积(P<0.05,P<0.01),扩大股骨头髓腔内微血管面积;与正常组比较,模型组大鼠均显著下调CD31、VEGF、VEGFR2、PI3K、p-Akt和上调PTEN的表达含量(P<0.01),与模型组比较,JPHGP作用后中、高剂量组显著升高大鼠股骨头CD31、PI3K、p-Akt表达含量(P<0.01),降低PTEN蛋白的表达水平(P<0.01),同时JPHGP作用后上调VEGF、VEGFR2表达含量(P<0.05,P<0.01)。结论:JPHGP对AONFH股骨头血管损伤具有修复作用,其机制可能与激活VEGF/VEGFR2/PI3K/Akt信号通路有关,相关研究结果将为JPHGP的临床应用提供一定科学依据和参考。

补肾活血方通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路改善DOR大鼠卵巢储备功能

目的:观察补肾活血方调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关因子改善卵巢储备功能下降(DOR)大鼠卵巢储备功能的作用机制。方法:运用Ataya法腹腔注射环磷酰胺复制60只DOR模型大鼠,将其随机分为模型组、戊酸雌二醇组(0.000 9 g·kg^(-1)),补肾活血方高、中、低剂量组(33,16.5,8.25 g·kg^(-1)),同时另设正常组,每组12只;各组相应药物治疗,正常组和模型组给予等体积生理盐水,连续灌胃14 d,每天1次。治疗结束后,苏木素-伊红(HE)染色卵巢组织,光镜观察初级卵泡数、成熟卵泡数、总卵泡数的变化;免疫组化检测卵巢组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢组织中PI3K,Akt,mTOR,半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测卵巢组织中PI3K,Akt,mTOR mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组卵巢组织中成熟卵泡数量、总卵泡数量明显减少(P<0.05,P<0.01),卵巢组织中VEGF,Caspase-3表达升高(P<0.05),PI3K,Akt,mTOR蛋白及mRNA表达水平降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,补肾活血方中、高剂量组成熟卵泡数量、总卵泡数量均有不同程度上升(P<0.05,P<0.01),VEGF补肾活血方中剂量组升高最为明显(P<0.05),补肾活血方低、中、高剂量组及戊酸雌二醇组Caspase-3下降,补肾活血方中、高剂量组PI3K,Akt,mTOR蛋白及mRNA表达水平均升高(P<0.05,P<0.01),且补肾活血方中剂量组更加接近于正常组。结论:补肾活血方可以有效地改善DOR大鼠卵巢储备功能,促进卵泡数量增加。作用机制可能与补肾活血方通过增加卵巢组织中VEGF的表达有关,进而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,从而调节Caspase-3的含量,最后促进卵泡数量的增加。

基于网络药理学和实验验证黄芪甲苷和三七总皂苷配伍调控血管生成抗脑缺血作用机制

采用网络药理学结合体内、外实验验证探讨黄芪甲苷(astragalosideⅣ,ASTⅣ)配伍三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)调控血管生成治疗脑缺血的作用机制。运用网络药理学预测ASTⅣ和PNS通过介导血管生成治疗脑缺血的可能机制。体内实验:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、ASTⅣ(10 mg·kg^(-1))+PNS(25 mg·kg^(-1))组,大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法建立脑缺血模型。ASTⅣ及PNS灌胃给药,每天2次。采用Longa法测定神经功能缺损症状;苏木素-伊红(HE)染色观察脑组织病理损伤;免疫组化测定血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的表达;免疫荧光测定血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的表达;蛋白质印迹法检测脑组织血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、VEGFA、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)的表达。体外实验:原代培养并鉴定脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs),取第3代rBMECs,设置对照组、模型组、ASTⅣ+PNS(50μmol·L^(-1)+30μmol·L^(-1))组、LY294002(PI3K/AKT信号通路抑制剂)组、740Y-P组(PI3K/AKT信号通路激动剂)、ASTⅣ+PNS+LY294002组及ASTⅣ+PNS+740Y-P组,氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R)建立缺血再灌注损伤模型。CCK-8检测rBEMCs存活情况,划痕实验检测rBEMCs迁移能力;人工基底膜(matrigel)检测rBEMCs成管数;内皮细胞渗漏实验检测内皮细胞渗透率;蛋白质印迹检测rBEMCs中VEGFR2、VEGFA、p-PI3K、p-AKT蛋白的表达。网络药理学结果显示,ASTⅣ及PNS可调节脑梗死血管生成的21个靶点,包括VEGFA、AKT1等,大部分涉及PI3K/AKT信号通路。体内实验发现,与模型组比较,ASTⅣ+PNS配伍能降低脑缺血后神经功能缺损评分(P<0.05)及脑组织细胞损伤率(P<0.05),增加vWF及VEGFA蛋白的表达(P<0.01),促进血管新生,且显著升高PI3K/AKT通路相关蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。体外实验发现,与模型组比较,ASTⅣ+PNS、740Y-P、ASTⅣ+PNS+LY294002及ASTⅣ+PNS+740Y-P均能增加OGD/R后rBEMCs存活率,增强rBEMCs迁移率,增加rBEMCs成管数,增强PI3K/AKT通路相关蛋白表达,降低内皮细胞渗透率(P<0.05,P<0.01);与LY294002组比较,ASTⅣ+PNS+LY294002组rBEMCs存活率、迁移率、成管数及PI3K/AKT通路相关蛋白表达显著增加,内皮细胞渗透率显著减少(P<0.05,P<0.01);与ASTⅣ+PNS组和740Y-P组比较,ASTⅣ+PNS+740Y-P组rBEMCs存活率、迁移率、成管数及PI3K/AKT通路相关蛋白表达显著增加,内皮细胞渗透率显著降低(P<0.01)。该研究表明,ASTⅣ和PNS在脑缺血后能促进血管生成,机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。