燃煤细颗粒物对血管内皮细胞EA.hy926的细胞毒性

以银川散煤为样品煤,在实验室采用固定源稀释通道采集燃煤PM2.5,超声波水浴提取燃煤PM2.5全颗粒悬液,对人脐静脉内皮细胞EA.hy926进行染毒,并采用MTS法检测燃煤PM2.5在不同染毒时间对EA.hy926细胞增殖的影响.结果表明,燃煤PM2.5悬液对EA.hy926细胞分别染毒6,12,24h均可抑制细胞增殖,且12,24h各剂量组和溶剂对照相比具有统计学意义;在相同染毒剂量组内,和6,12h相比,染毒24h对细胞存活率抑制更加明显,其差异具有统计学意义.可见,燃煤PM2.5可以抑制血管内皮细胞增殖且具有时间和剂量依赖性,血管内皮损伤是PM2.5致心血管毒性的可能机制之一.

miR-126对EA．hy926细胞血管内皮生长因子表达的调控作用

目的:探讨miR-126对EA.hy926细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:选用EA.hy926细胞株作为研究对象,采用阳离子介导的转染方式,将miR-126 inhibitor和miR-126 mimics进行细胞转染,分析miR-126对血管内皮细胞功能的影响。采用转染negative control作为阴性对照,转染36 h后提取细胞总RNA,利用real-time PCR和Western blotting分别检测EA.hy926细胞VEGF mRNA和蛋白水平的表达。结果:转染miR-126 inhibitor 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间差异有统计学意义(P<0.01),与阴性对照组相比,miR-126 inhibitor使EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平显著上调(P<0.01);转染miR-126 mimics 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间有显著差异(P<0.01),与阴性对照组相比,miR-126 mimics使EA.hy926细胞的VEGF在mRNA及蛋白水平显著下调(P<0.01)。结论:miR-126能够抑制VEGF的表达,VEGF有可能是其调节的靶基因之一。

大蒜素对PM2.5损伤EA.hy926内皮细胞的保护作用及机制

目的探讨PM2.5对EA.hy926型人脐静脉内皮细胞损伤的影响及大蒜素的保护作用及机制。方法采集大气PM2.5分别以20、200、400 mg·L^(-1)染毒EA.hy926细胞24h,MTT法测细胞存活率;流式细胞术测细胞凋亡;Western blot法测p-ERK1/2、Bax、Bcl-2蛋白水平;ELISA法测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)含量,并测细胞丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及乳酸脱氢酶(LDH)活性;分别加入大蒜素(5、20、40 mg·L^(-1))和ERK1/2通路特异性阻滞剂PD98059 20μmol·L^(-1),检测大蒜素的干预作用及机制。结果与对照组比较,PM2.5染毒后呈剂量依赖性降低EA.hy926细胞存活率,上调p-ERK1/2蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以促进细胞凋亡,诱导分泌TNF-α及IL-6含量增高,降低SOD活性,增加MDA含量及LDH活性(P<0.05);大蒜素呈剂量依赖性增加EA.hy926细胞的存活率,下调p-ERK1/2蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以抑制细胞凋亡,降低TNF-α及IL-6含量,增加SOD活性,降低MDA含量及LDH活性(P<0.05)。结论大蒜素可能通过抑制ERK1/2信号通路,减轻PM2.5诱导的炎症反应及氧化应激损伤,从而保护EA.hy926细胞。

EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代细胞生物特性的比较研究

目的比较培养EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)的优缺点及生物学特性。方法通过倒置显微镜、透射电镜形态学鉴定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检查及生长曲线测定,比较2种脐静脉内皮细胞的形态、生长曲线等差异。结果透射电镜观察到原代HUVECs中发现较多WebelPalade小体,而EA.HY926细胞株较少见。免疫组织化学染色Image-Pro Plus 6.0软件进行分析EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代HUVECs平均光密度值分别为(2 234.02±78.78)、(4 138.80±594.01)。原代HUVECs的染色程度明显较EA.HY926细胞株高,差异有统计学意义(P<0.01)。EA.HY926人脐静脉内皮细胞株生长曲线较原代HUVECs稳定。结论培养原代HUVECs耗时长,生长期较短,易出现杂细胞的污染,细胞的增殖能力有限,花费昂贵。EA.HY926细胞株虽生物特性较差,但其操作简便,具有一定程度的原代HUVECs所具有的生物特性,细胞均一以及增长旺盛,可用于较复杂、细胞创伤较大的体外内皮细胞的研究。

厄贝沙坦对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926增殖、凋亡、VEGF mRNA表达的影响

目的:应用不同浓度厄贝沙坦对人脐静脉内皮细胞株EA.hy 926的增殖、凋亡生物学效应及血管发生主要基因VEGFmRNA的表达进行体外研究,探讨厄贝沙坦对内皮细胞的血管生成效应。方法:各种浓度厄贝沙坦对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926共同孵育24 h。细胞增殖采用CCK8法分析,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。RT-PCR验证VEGFmRNA的表达。结果:厄贝沙坦各浓度干预组细胞形态无明显变化,CCK8结果提示厄贝沙坦各干预组相比对照组细胞增殖活力增高(P<0.05),呈浓度非依赖性。流式细胞仪分析厄贝沙坦各浓度干预组细胞无明显凋亡。RT-PCR发现厄贝沙坦1×10-4,1×10-5,1×10-6mol/L浓度组VEGFmRNA表达增高(P<0.05)。结论:厄贝沙坦促进EA.hy926细胞株细胞增殖,上调VEGFmRNA的表达。这提示除了降压效应,血管紧张素受体拮抗剂在缺血性心脏病如慢性心力衰竭治疗中具有一定作用。

石斛酚对高糖诱导的EA.hy926内皮细胞凋亡的保护作用研究

目的:研究石斛酚对高糖损伤的EA.hy926细胞(来源于人脐静脉的永生化内皮细胞系)的保护作用,并探讨其作用机制。方法:采用100 mmol·L-1高糖培养基建立EA.hy926内皮细胞损伤模型,给予石斛酚孵育24 h,采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,检测细胞半胱天冬酶-3(Caspase-3)活性以及培养液中SOD(过氧化物歧化酶)、T-AOC(总抗氧化能力)活力和MDA(丙二醛)的含量。结果:石斛酚能抑制Caspase-3活性,降低细胞凋亡率,增强细胞活力,提高SOD和T-AOC活力,减少MDA含量。结论:石斛酚对高糖损伤的血管内皮细胞具有保护作用,其机理与其增强细胞的抗氧化能力密切相关。

G1对EA.hy926内皮细胞内质网应激的抑制作用

目的观察GPR30受体激动剂G1对高糖诱导的EA.hy926内皮细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的影响。方法选用EA.hy926内皮细胞为研究对象,分为3组:正常对照组(Con,17.51mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,33.3mmol/L葡萄糖)、高糖+G1组(HG+G1,HG+1umol/L G1),利用流式细胞术检测3组细胞凋亡率,Western blot法检测ERS相关分子Bip、IRE1、PERK及凋亡分子Bax、Bcl-2的表达变化,RT-PCR法检测Bip和CHOP的mRNA表达变化。结果 HG组与Con组比较,细胞凋亡率明显升高(P<0.01),Bip、IRE1、PERK及凋亡分子Bax表达上调(P<0.01,P<0.05或P<0.001),Bcl-2的表达下调(P<0.01),Bip mRNA、CHOP mRNA表达上调(P<0.001及P<0.01);HG+G1组与HG组比较,细胞凋亡率明显降低(P<0.05),Bip、IRE1、PERK及凋亡分子Bax表达下调(P<0.05或P<0.01),Bcl-2的表达上调(P<0.05),Bip mRNA、CHOP mRNA表达下调(P<0.001及P<0.01)。结论 GPR30受体激动剂G1可抑制EA.hy926内皮细胞内质网应激。

茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯PRP-S16对人脐静脉内皮细胞EA.hy926的抑制作用及机制研究

目的:探讨茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯PRP-S16对人脐静脉内皮细胞EA.hy926的抑制作用及其机制。方法:MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪检测EA.hy926细胞凋亡与细胞周期,real-time RT-PCR检测Bax、Bcl-2 mRNA表达。结果:茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯PRP-S16对EA.hy926细胞的增殖有显著的抑制作用(P<0.05),其作用呈浓度依赖性,最大抑制率达66.83%(72 h、400μg/mL);细胞凋亡率分别为15.89%(200μg/mL)、24.48%(400μg/mL);细胞在G;/G;期的分布分别是80.03%(100μg/mL)、81.44%(200μg/mL)、82.38%(400μg/mL);细胞经不同浓度的茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯PRP-S16处理48 h后,Bax mRNA表达显著升高,Bcl-2 mRNA表达显著降低,二者均呈浓度依赖性。结论:茶藨子木层孔菌多糖硫酸酯PRP-S16能通过阻滞内皮细胞G_(0)/G_(1)期、促进细胞凋亡来抑制人脐静脉内皮细胞增殖,其机制与上调促凋亡基因Bax mRNA的表达并下调抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达有关。

软脂酸对EA.hy926细胞一氧化氮合成的影响及六味地黄丸的干预效应

目的研究软脂酸(PA)对EA.hy926内皮细胞一氧化氮(NO)合成和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)表达的影响及六味地黄丸(LWDHP)含药血清的干预作用。方法将培养的EA.hy926细胞分组,采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NAPDH)依赖性硝酸盐还原酶法测定细胞裂解上清液NO含量;RT-PCR及Western印迹检测细胞内eNOS mRNA和蛋白的表达。结果 PA损伤的细胞裂解液中NO含量减少,与正常对照组比较差异显著(P<0.01)。2.5%LWDHP含药血清组NO含量进一步减少,5%、10%LWDHP含药血清组及二甲双胍(MET)组均能显著增加细胞裂解液中NO含量,与PA组比较有差异显著(P<0.01),但三者之间互相比较无显著性差异(P>0.05)。同时PA组细胞内eNOS mRNA和蛋白的表达显著减少(P<0.01),LWDHP和MET组细胞内eNOS mRNA和蛋白表达量增加(P<0.01)。结论 LWDHP含药血清能够刺激PA损伤的EA.hy926细胞eNOS mRNA和蛋白的表达,从而有效促进NO的合成,发挥其保护作用。

苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导EA.hy926细胞Bax表达的影响

目的探讨苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的人脐静脉血管内皮细胞株(EA.hy926)Bax表达的影响。方法苦荞麦总黄酮作用于高浓度软脂酸刺激下的EA.hy926细胞,RT-PCR技术检测Bax mRNA表达水平,免疫细胞化学方法检测Bax蛋白的表达情况。结果与对照组相比,模型组细胞Bax mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组相比较,苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组细胞Bax mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01);苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组之间无显著差异(P>0.05)。结论苦荞麦总黄酮可以降低EA.hy926细胞Bax基因及蛋白的表达,从而发挥抑制血管内皮凋亡的作用。

苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的EA.hy926细胞Bcl-2表达的影响

目的研究苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的人脐静脉血管内皮细胞株(EA.hy926)Bcl-2表达的影响。方法苦荞麦总黄酮作用于高浓度软脂酸刺激下的EA.hy926细胞,RT-PCR技术检测Bcl-2 mRNA表达水平,免疫组织化学方法检测Bcl-2蛋白的表达情况。结果与对照组相比,模型组细胞Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组相比较,苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01);苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组之间无显著差异(P>0.05)。结论苦荞麦总黄酮可以促进EA.hy926细胞Bcl-2基因及蛋白的表达发挥抑制凋亡的作用。

苞叶雪莲粗提物对EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用

通过确定Na_2S_2O_4对EA.hy926细胞造成缺氧损伤的最佳浓度和时间点建立缺氧损伤模型,以只加Na_2S_2O4为对照组,添加不同浓度的苞叶雪莲(Saussurea obvallata)粗提物,从细胞形态和细胞生存率两个方面检测其抗缺氧作用,分析苞叶雪莲粗提物对Na_2S_2O4造成EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用。结果表明,苞叶雪莲粗提物从1.25 mg/m L浓度开始呈剂量依赖性的增加了缺氧模型组中EA.hy926细胞的相对存活率,在10 mg/m L浓度下与Na_2S_2O4模型组相比,极显著增加了细胞存活率,是缺氧模型组的6.3倍,表明苞叶雪莲具有很强的抗缺氧损伤能力。

机动车排放PM_(2.5)对EA.hy926细胞DNA甲基化效应研究

目的探讨机动车排放PM2.5对EA.hy926细胞(人脐静脉内皮细胞和人肺腺癌细胞株A549融合的细胞株)增殖功能、DNA甲基化及凋亡的影响。方法机动车排放PM2.5对EA.hy926细胞染毒24 h。采用MTS法测定机动车排放PM2.5对细胞增殖功能的影响;DNA甲基化定量检测试剂盒(比色法)测定机动车排放PM2.5对细胞DNA甲基化的影响;Annexin V-FITC/PI染色,流式细胞仪测定机动车排放PM2.5对细胞凋亡的影响。结果机动车排放PM2.5染毒24 h可抑制细胞增殖功能,当染毒质量浓度为200μg/m L时,与PBS对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);随着染毒质量浓度的增加细胞DNA甲基化率(5-m C%)下降,在染毒质量浓度为50μg/m L和200μg/m L时,与PBS对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);随染毒质量浓度升高细胞诱导凋亡率逐渐升高。结论机动车尾气排放PM2.5可以抑制EA.hy926细胞的增殖功能,改变EA.hy926细胞的DNA甲基化率,对EA.hy926细胞产生诱导凋亡作用。此外DNA甲基化可能是细胞增殖和凋亡的机制,定点基因的甲基化仍需要进一步研究。

苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的EA.hy926细胞Bcl-2/Bax表达的影响

目的:研究苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的人脐静脉血管内皮细胞(EA.hy926)凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法:体外培养EA.hy926细胞,实验分为正常组、模型组、苦荞麦总黄酮组和二甲双胍组,用高浓度的软脂酸建立胰岛素抵抗状态血管内皮细胞损伤模型。采用western bolt检测Bcl-2及Bax蛋白的表达情况。结果:与正常组相比,模型组细胞Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达显著增加,Bcl-2/Bax比值降低,差异有显著性(P<0.01);与模型组相比较,苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组细胞Bcl-2蛋白表达水平明显升高,Bax蛋白表达减少,Bcl-2/Bax比值明显提高,差异有显著性(P<0.01);苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组之间无显著差异(P>0.05)。结论:苦荞麦总黄酮可通过调节Bcl-2/Bax表达而抑制软脂酸诱导的EA.hy926凋亡,减少内皮细胞损伤。

采用蛋白质组学技术研究罗布麻总黄酮抗EA.hy926细胞损伤作用机制

目的应用同位素标记的绝对与相对定量（iTRAQ）蛋白质组学技术联合Q-Exactive质谱仪对罗布麻总黄酮（total flavonoids of Folium ApocyniVenet,TFF）作用前后EA.hy926细胞的蛋白质表达谱进行检测,找出差异蛋白,并对其进行生物信息学分析,以探讨TFF抑制H2O2诱导的EA.hy926细胞损伤的作用机制.方法（1）采用MTT法检测TFF各浓度的细胞毒性和最有效剂量.（2）分别提取正常组,模型组,罗布麻总黄酮组蛋白,酶解后用不同的iTRAQ试剂标记,混合后采用Q-Exactive质谱仪鉴定,并用PD（Proteome Dis-coverer1.3,thermo）和mascot2.3.0进行定性和定量分析,筛选差异表达蛋白并对其进行生物信息学分析.结果（1）36mg·L^-1的TFF能较好的减少H2O2导致的细胞凋亡.（2）实验共鉴定出蛋白3628个,以两组比值≥1.2或≤0.8为差异蛋白定量标准,H2O2刺激后导致其中250个蛋白表达发生变化（两组比值〉1.2倍或〈0.8倍）,经TFF治疗可改善87个蛋白的异常表达趋势,其中上调54个,下调33个,包括血红蛋白δ亚基（HBD）,硫氧还蛋白结构域蛋白15（TXD15）,溶质载体家族12成员6（S12A6）,组织因子途径抑制物（TFPI）,血小板衍化生长因子β（PA1B2）等蛋白.结论TFF能改变H2O2导致的差异蛋白表达情况,这些蛋白富集于细胞周期,细胞骨架,细胞凋亡等多种生物学功能,形成庞大的相互作用网络,协同发挥抗凋亡作用.

人EGFL7真核表达载体的构建及稳定转染EA.hy926细胞系的建立

目的建构对人类表皮生长因子样结构域7(EGFL7)基因真核表达载体以及稳定性转染EA.hy926细胞系的科学评价体系。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法获得EGFL7的开放阅读框(ORF),借助双酶切方式,使得EGFL7能够被克隆至真核表达载体(pEGFP-N1)中并获取到已经重组好的质粒pEGFP-N1-EGFL7。在进一步接受测序和鉴定处理后,借助电转仪对EA.hy926细胞进行转染,然后通过G418筛查进而建构起稳定性转染EA.hy926细胞系。使用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测EGFL7基因及蛋白在EA.hy926细胞系中的表达。结果转染EGFL7的EA.hy926细胞的EGFL7基因和蛋白水平均明显高于对照质粒转染组和空白对照组(P<0.05)。结论成功建构人EGFL7真核表达载体并鉴定了EGFL7在EA.hy926细胞系中的过表达,为探讨EGFL7对早产儿支气管肺发育不良的影响奠定基础。

党参多糖对H_2O_2所致EA.hy926细胞氧化损伤的保护作用

目的研究党参多糖对低浓度过氧化氢(H2O2)刺激下EA.hy926细胞的保护作用。方法采用体外培养EA.hy926细胞,利用H_2O_2小剂量长时间刺激进行造模,并选用维生素E作为阳性对照组。采用MTT法检测细胞的增殖情况,光学显微镜观察细胞形态学的改变,SA-β-半乳糖苷酶染色法检测细胞的衰老水平,流式细胞术检测细胞周期,比色法检测细胞细胞培养上清中一氧化氮含量及细胞内的超氧化物歧化酶、丙二醛的含量,ELISA检测细胞培养基中内皮素-1、诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶的水平,DCFH-DA检测细胞内活性氧的水平。结果党参多糖各浓度组、维生素E组与模型组比较细胞的形态均有不同程度改善。与模型组比较,党参多糖各浓度组、维生素E组细胞的存活率升高,细胞G1期比例下降,SA-β-半乳糖苷酶染色的细胞蓝染率下降,超氧化物歧化酶、一氧化氮、内皮型一氧化氮合酶的水平升高,丙二醛、诱导型一氧化氮合酶、内皮素-1、活性氧水平下降。结论党参多糖可能通过提高EA.hy926细胞的抗氧化能力、调控内皮素-1与一氧化氮的动态平衡发挥其对氧化损伤的保护作用。

丹红化瘀口服液含药血清对氯化钴诱导EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用

目的研究丹红化瘀口服液含药血清对氯化钴(CoCl_(2))诱导人脐静脉内皮细胞(EA.hy926细胞)缺氧损伤的保护作用。方法建立CoCl_(2)诱导EA.hy926细胞缺氧模型,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,透射电镜观察细胞超微结构。试剂盒检测细胞上清液的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)活力和丙二醛(MDA)水平,RT⁃PCR检测缺氧诱导因子⁃1α(HIF⁃1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达。结果5%~10%丹红化瘀口服液含药血清能增强缺氧损伤细胞的活力(P<0.05,P<0.01),抑制细胞凋亡(P<0.05,P<0.01),减轻细胞结构损伤,降低细胞MDA水平和升高GSH⁃Px水平(P<0.05,P<0.01),剂量依赖性地下调细胞HIF⁃1α、VEGF、VEGFR1、VEGFR2及iNOS mRNA表达(P<0.01)。结论丹红化瘀口服液含药血清通过抗氧化作用减轻氯化钴诱导的EA.hy926细胞缺氧损伤。

补肾抗衰片对EA.hy 926细胞过氧化损伤的影响

目的:观察补肾抗衰片对EA.hy 926细胞氧化应激损伤的影响。方法:采用过氧化氢(H2O2)诱导EA.hy 926细胞损伤建立EA.hy 926细胞过氧化模型,以CCK-8法评价模型。实验分为空白对照组、实验对照组、H2O2过氧化损伤模型组以及补肾抗衰片干预组,利用CCK-8法测定各组细胞活力,采用流式细胞术检测EA.hy 926细胞内的总氧化水平(ROS),采用免疫荧光法检测HO-1蛋白水平。结果:补肾抗衰片具有抗H2O2诱导的EA.hy 926细胞过氧化损伤,维持细胞氧化还原平衡状态的效应。结论:补肾抗衰片抗氧化损伤,维持细胞氧化还原平衡可能与调节HO-1蛋白水平有关。

溴代甲氧基二苯甲酮咪唑类化合物的合成及对过氧化氢致EA. hy 926细胞损伤的保护作用

本文旨在引入咪唑环,对溴代甲氧基二苯甲酮类化合物进行结构衍生,以发现对血管内皮细胞具有更高保护活性的化合物。通过以2-甲基-5-溴-苯甲酸为起始原料,经过酰氯化、傅克酰化、溴代、与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)自由基取代及与取代咪唑的亲核取代等多步反应,合成了8个新型溴代甲氧基二苯甲酮咪唑类化合物。目标化合物的结构均经质谱(MS)、核磁共振波谱仪(NMR)和高分辨质谱(HRMS)进行确证。并采用噻唑蓝(MTT)法考察了目标化合物对过氧化氢损伤的EA.hy 926细胞的保护活性,结果表明,目标化合物6a、6g、6h具有显著的细胞保护活性,其半抑制浓度(EC50)分别为1.9、4.0和3.2μmol/L,优于阳性对照槲皮素(EC_(50)为18μmol/L),表明该类化合物在心血管疾病的治疗方面有潜在的应用前景。