芍药苷能通过调节Src/血管内皮-钙黏蛋白通路改善心脏微血管内皮细胞通透性

目的探讨芍药苷对脓毒症心脏微血管内皮细胞(CMECs)通透性的影响及机制。方法体外分离并原代培养大鼠CMECs细胞,待细胞进入对数生长期用于实验。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)筛选出芍药苷的安全有效浓度10、20、40μmol/L。将细胞分为空白对照组、脂多糖(LPS)组及低、中、高浓度芍药苷预处理组。空白对照组用完全培养基培养;LPS组在完全培养基中加入1 mg/L的LPS刺激细胞;芍药苷预处理各组分别于LPS刺激前4 h加入10、20、40μmol/L芍药苷进行预处理。各组细胞于LPS刺激后继续培养24 h,采用辣根过氧化物酶(HRP)法检测大鼠CMECs细胞通透性;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中CXC趋化因子配体(CXCL1、CXCL2)水平;采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中CXCL1、CXCL2的mRNA表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞中磷酸化Src(p-Src)、血管内皮-钙黏蛋白(VE-cadherin)、磷酸化丝裂素活化蛋白激酶(p-MAPK)的蛋白表达。结果与空白对照组相比,LPS组大鼠CMECs细胞通透性明显增加;经不同浓度芍药苷预处理后细胞通透性均有一定程度改善,以40μmol/L芍药苷组改善最明显,与LPS组比较差异有统计学意义(A值:1.61±0.07比2.13±0.06,P<0.01)。ELISA结果显示,空白对照组大鼠CMECs细胞上清液中有适量CXCL1、CXCL2分泌;但在LPS诱导下,细胞上清液中CXCL1、CXCL2分泌量明显增加;给予不同浓度芍药苷预处理后细胞上清液中CXCL1、CXCL2的分泌量均明显减少,其中40μmol/L芍药苷对CXCL1的抑制作用最佳,20μmol/L芍药苷对CXCL2的抑制作用最佳,与LPS组比较差异均有统计学意义〔CXCL1(ng/L):337.51±68.04比829.86±65.06,CXCL2(ng/L):4.48±0.11比9.41±0.70,均P<0.01〕。RT-qPCR结果显示,大鼠CMECs细胞中CXCL1、CXCL2的mRNA表达与ELISA结果一致,表现为LPS能够诱导大鼠CMECs细胞中CXCL1、CXCL2的mRNA表达增加;而不同浓度芍药苷预处理后能够明显降低CXCL1、CXCL2的mRNA表达,40μmol/L芍药苷对CXCL1 mRNA表达的抑制效果最佳,20μmol/L芍药苷对CXCL2 mRNA表达的抑制效果最佳,与LPS组比较差异均有统计学意义〔CXCL1 mRNA(2^-ΔΔCt):0.543±0.004比0.812±0.089,CXCL2 mRNA(2^-ΔΔCt):10.52±0.71比17.68±1.09,均P<0.01〕。Western Blot结果显示,空白对照组大鼠CMECs细胞中有适量p-Src、VE-cadherin和p-MAPK蛋白表达;LPS刺激后大鼠CMECs细胞中p-Src、p-MAPK蛋白表达明显增加,而VE-cadherin蛋白表达明显下降;经不同浓度芍药苷预处理后,细胞中p-Src、p-MAPK蛋白表达有不同程度降低,但VE-cadherin蛋白表达则呈升高趋势,以40μmol/L芍药苷组效果最佳,与LPS组比较差异均有统计学意义〔p-Src蛋白(p-Src/GAPDH):1.02±0.09比1.29±0.05,p-MAPK蛋白(p-MAPK/GAPDH):0.24±0.02比0.62±0.02,VE-cadherin蛋白(VE-cadherin/GAPDH):0.64±0.03比0.31±0.02,均P<0.01〕。结论芍药苷能够通过调节CMECs细胞中Src/VE-cadherin通路,抑制炎症相关蛋白及趋化因子的表达和分泌,改善LPS诱导的CMECs细胞通透性。

血管内皮-钙黏蛋白在脓毒症患者病情严重程度评估中的价值

目的探讨血管内皮-钙黏蛋白(VE-cad)在脓毒症患者病情严重程度中的评估价值。方法采用前瞻性研究,选择2015年6月1日至2017年11月1日温州医科大学附属第一医院急诊病区收治的85例脓毒症患者,记录患者的性别、年龄、既往史、首发感染部位、受累器官数量、实验室指标、急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ)、简化急性生理学评分Ⅱ(SAPSⅡ)、序贯器官衰竭评分(SOFA)、总住院时间、急诊重症监护病房(EICU)住院时间及入院28 d和住院期间生存情况,检测患者入院24 h内血浆VE-cad水平。根据患者病情进展分为脓毒症组和脓毒性休克组;根据患者是否伴有多器官功能障碍综合征(MODS)分为MODS组和非MODS组。分析并比较各组患者及不同28 d预后患者上述指标的差异。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线),评估VE-cad对脓毒症患者病情严重程度的评估价值。结果共纳入85例患者,以呼吸道感染为主;其中38例为脓毒症,47例为脓毒性休克;39例发生MODS,46例未发生MODS;患者入院28 d内存活64例,死亡21例。与脓毒症组相比,脓毒性休克组患者受累器官数量多〔个:3(2,4)比1(0,2)〕,APACHEⅡ评分〔分:13(10,21)比7(5,12)〕、SAPSⅡ评分〔分:35(31,55)比7(5,12)〕、SOFA评分〔分:7.0(5.0,10.0)比3.0(0,5.0)〕、血乳酸〔Lac(mmol/L):3.5(2.4,6.2)比1.9(1.2,2.2)〕、C-反应蛋白〔CRP(mg/L):90.0(58.1,90.0)比50.5(38.0,90.0)〕、VE-cad水平〔mg/L:1.427(1.141,2.150)比1.195(0.901,1.688)〕均明显升高,而血小板计数〔PLT(×10^(9)/L):113.4±67.2比202.5±10^(9).5〕、血红蛋白(Hb)水平(g/L:106.3±36.3比118.6±18.0)均明显降低(均P<0.05)。与非MODS组相比,MODS组患者APACHEⅡ评分〔分:14(10,22)比8(6,13)〕、SAPSⅡ评分〔分:36(32,56)比29(24,35)〕、SOFA评分(分:7.9±3.9比4.0±3.8)、住院病死率〔53.8%(21/39)比0%(0/46)〕、Lac〔mmol/L:3.1(2.3,6.3)比2.1(1.4,4.6)〕和VE-cad水平〔mg/L:1.427(1.156,1.937)比1.195(0.897,1.776)〕均明显升高,EICU住院时间明显延长〔d:6(3,12)比3(0,7)〕,而PLT水平明显降低(×10^(9)/L:118.2±80.0比182.5±104.0,均P<0.05)。与死亡组相比,存活组受累器官数量少〔个:2(1,3)比3(1,5)〕,APACHEⅡ评分〔分:9(6,13)比21(13,25)〕、SAPSⅡ评分〔分:31(25,36)比55(35,63)〕、SOFA评分(分:4.7±3.7比8.9±4.5)均明显降低,EICU住院时间明显缩短〔d:4(1,8)比8(3,15),均P<0.05〕。ROC曲线分析显示,VE-cad、SOFA评分及二者联合评估脓毒症患者病情严重程度的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.632〔95%可信区间(95%CI)为0.513~0.750〕、0.830(95%CI为0.744~0.916)和0.856(95%CI为0.779~0.933);当VE-cad截断值为1.240 mg/L时,敏感度为68.1%,特异度为55.3%;VE-cad联合SOFA评分评估的敏感度为85.1%,特异度为73.7%。结论VE-cad对脓毒症患者病情严重程度有一定评估价值,VE-cad联合SOFA评分的评估价值优于VE-cad单项指标。

抑制c-Abl激酶调节桩蛋白酪氨酸磷酸化对通气损伤活体大鼠的保护效应

目的 探讨在活体机械通气损伤模型抑制c-Abl激酶是否可以减少桩蛋白酪氨酸残基位点Y31和Y118（Pxn Y31、Pxn Y118）磷酸化,从而阻断其下游效应分子血管内皮-钙黏蛋白（VE-cad）及Rho/Rho激酶活化所致的血管屏障功能紊乱.方法 90只健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为9组,每组10只.假手术（Sham）组仅进行气管切开;保护性通气1 h、2 h组（PVT 1h、2h组）潮气量（VT）为6 mL/kg,呼气末正压（PEEP）为5 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）;大VT通气1 h、2 h组（HVT 1h、2h组）VT为30 mL/kg,PEEP为0;p42/44丝裂素活化蛋白激酶（p42/44MAPK）抑制剂UO126和c-Abl激酶抑制剂AG957预处理1 h、2 h组分别于大VT通气前1 h腹腔注射UO1261 mg/kg或灌胃AG95710 mg/kg.各组于预定实验时间结束后处死大鼠,采集肺组织标本及支气管肺泡灌洗液（BALF）,用伊文思蓝（EB）实验检测肺血管渗透性,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BALF中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平;镜下观察肺组织病理学改变,并计算弥漫性肺泡损伤系统（DAD）评分,计算肺湿/干重（W/D）比值;用比色法测定肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性,用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测肺组织c-Abl Y245、Pxn Y31、Pxn Y118、VE-cad Y658、p42/44MAPK Y202/Y204、肌球蛋白轻链（MLC）及肌球蛋白磷酸酯酶目标亚基Y696（MYPT Y696）的磷酸化情况.结果 ①Sham组与PVT组肺组织无明显病理学改变,且两组间各指标均无明显差异;HVT组肺组织损伤严重,且DAD评分、肺W/D比值、EB渗出量、MPO活性和BALF中TNF-α 水平较Sham组及PVT组明显升高;给予AG957或UO126预处理后,上述指标均较HVT组明显降低.②HVT组肺组织各蛋白磷酸化水平较Sham组和PVT组明显增加,以2 h更明显;给予AG957预处理后2 h,肺组织蛋白磷酸化水平均较HVT组明显降低〔p-c-Abl Y245（灰度值）：0.29±0.04比0.42±0.04,p-Pxn Y31（灰度值）：0.51±0.03比0.70±0.05,p-Pxn Y118（灰度值）：0.65±0.04比0.91±0.04,p-VE-cad Y658（灰度值）：0.77±0.07比1.32±0.07,p-p42/44MAPK Y202/Y204（灰度值）：0.38±0.06比0.61±0.03,p-MLC（灰度值）：0.37±0.04比0.77±0.05,p-MYPT Y696（灰度值）：0.54±0.05比0.87±0.06,均P〈0.05〕;给予UO126预处理后2 h,肺组织p-VE-cad Y658表达较HVT组明显降低（灰度值：0.74±0.04比1.32±0.07）,且p42/44MAPK及其下游效应分子MLC、MYPT的磷酸化水平亦明显降低〔p-p42/44MAPK Y202/Y204（灰度值）：0.38±0.07比0.61±0.03,p-MLC（灰度值）：0.37±0.04比0.77±0.05,p-MYPT Y696（灰度值）：0.55±0.05比0.87±0.06,均P〈0.05〕.结论 抑制c-Abl激酶可阻断Pxn Y31、Pxn Y118磷酸化,稳定黏附连接处的VE-cad,并有可能通过阻断Pxn-鸟嘌呤核苷酸交换因子H1（GEF-H1）-p42/44MAPK信号小体的形成而抑制Rho信号链的活化、MLC的磷酸化及继发的肺血管屏障渗透性增加.